锌指工具：转录因子和核酸酶的自定义DNA结合域

主干网序列

识别螺旋外的ZF序列是Sp1C共识框架，表明其对螯合剂的稳定性增强(13,14)，以及在模块化单元环境中有效运行(15). 该框架由构成两条β链和相关序列（氨基酸序列）的N末端主干组成YKC公司PECG公司肯尼亚先令S、 带下划线的β-链）和C末端主干，即α-螺旋的C末端部分（氨基酸序列HQRTH）。N端（氨基酸序列LEPGEKP）和C端（氨基酸顺序TGKKTS）上的固定克隆序列基于改进的Sp1C框架(16). 用于融合ZF的连接子带有氨基酸序列TGEKP，是从转录因子数据库分析得出的共识序列(17)].

ZFP生成

为了生成ZFP的氨基酸序列，每个锌指重复序列被建模为围绕可变螺旋的两个不变序列（分别是N端和C端主干），其序列依赖于三联体。连接序列放在连续的ZF重复序列之间，包含所有手指的整个结构两侧是N端和C端固定序列（图3B）。

输入

用户必须提供高达10kb的DNA序列才能搜索目标位点。如果目的是基因调控，建议搜索基因启动子的～1 kb区域。如果启动子未知，转录起始位点上游和下游的数百个碱基对可以提供有效的调控位点(18). 由于显示大型搜索查询的结果所需的带宽相对较高，因此此类搜索的显示速度可能较慢。

相邻站点是指那些不间断的站点，具有以碱基对测量的最小用户特定长度（称为“最小目标大小”）。指定最小（而非精确）大小是为了避免冗长的target-site列表。因此，如果指定的最小大小为18 bp，则可能会找到36 bp的位点。要分析长目标站点，可以使用解析功能在较长的目标站点中查找唯一的子站点（如下所述）。分离的目标站点由两个相邻的“半站点”组成，由一个称为“核心”的非目标区域分隔由于分离目标位点的局限性，用户必须指定准确而非最小的半位点大小（单位：bp）。核心序列可以是任何长度，必须使用IUPAC基本术语进行描述(19)（详见网站）或简单的数字，其中数字是指IUPAC的编号N个'基础(N个匹配任何基数）。DNA链上半位点的相对顺序决定了结合ZFP的N端和C端的并置。用户可以使用“并置”单选按钮选择是否对齐ZFP的N或C端子。对于使用FokI催化结构域的核酸酶设计，C末端通常是对齐的(2,20).

使用“三元组搜索”复选框，用户可以选择将报告的目标站点限制为由选定的三元组类型子集组成的站点（例如，仅GNN和ANN三元组）。当筛选了由三元组子集构建的ZF库并且需要潜在的目标位点时，或者当需要目标位点中的特定碱基组成时，此功能可能很有用（有关更多详细信息，请参阅讨论）。搜索目标时也可以使用“ZF集合”选项。大多数用户应该使用由全部49个DNA三联体组成的“总”集合。“23–21–19”集合是以前用于库选择的三元组（补充表S1）的子集(7)包含和是为了向此库的用户提供他们期望找到的目标数量的上限估计。

输入

该工具的输入是一个由有效三联体（材料和方法）组成的DNA靶位点。这个目标站点可能是手动生成的，也可能是在上述搜索和解析工具的帮助下生成的。目标场地预计为5′-3′方向。搜索工具生成的半个站点的“底部”链显示为3′-5′，在使用此工具手动输入之前必须纠正方向。默认的主干、连接子和固定序列已经在我们的实验室和其他实验室进行了验证，因此建议大多数用户使用（讨论）。然而，用户可以通过显示默认值的文本框编辑这些序列。

输入

输入是ZFP的氨基酸序列。如果只有DNA序列可用，则必须首先翻译并选择正确的阅读框。通常可以通过粗略检查主干序列来识别正确的阅读框。

输入

输入的DNA序列不能超过10 kb。要匹配的目标站点必须<100 bp，并且可以使用IUPAC基本术语进行描述(19)（在网站上提供）允许未定义或部分定义的位置。用户可以指定任意数量的允许不匹配，并且这些不匹配在目标站点的任何位置都是允许的。不匹配与IUPAC基本“N”形成对比，后者仅限于目标站点内的特定位置。使用IUPAC命名法指定核酸酶位点的目标位置描述的一个示例是NNYNNYNNNYNNNNNNNNRNRNNNNN（其中N个=任何基础，R=G或A，Y=C或T）。生成这种类型的输入既不方便又容易出错，因此应尽可能使用自动生成目标序列描述符的搜索工具（如上所述）。

选择正确的手指数和连接序列以获得最佳亲和力和特异性

在设计ZFP时，必须优化亲和力和特异性。以解离常数结合靶标的蛋白质(K（K）_d日)10 nM或更高的容量有望成为生产调节器(18). 天然存在的三指蛋白质，如Zif268和SP1，将其首选序列与K（K）_d日值介于10 nM和10 pM之间，取决于分析条件(17). 用ZF Tools数据库中包含的域构建的ZFP通常具有极好的亲和力：许多以错误B-2基因有K（K）_d日其首选目标值<10 nM(22); 靶向不同的六指蛋白6Fn-642、6Fn-369和6Fn-285错误B-2站点具有K（K）_d日值分别为4.8、4.8和9.5 nM(22); 和K（K）_d日六指蛋白HLTR1、HLTR3和HLTR6的HIV-1 DNA靶向值分别为10、1和6 nM(23).

随着手指数量从一个增加到三个，观察到的DNA亲和力趋于改善，但亲和力在三个手指以上趋于稳定，六个手指蛋白质的亲和力仅比相应的三个手指蛋白质略有提高（～70倍）(17). 这种差异可能源于使用规范的TGEKP链接器。一种假设是，由于DNA扭曲，连接体导致DNA接触缺失或结合能丢失(24). 尽管如此，连接子序列TGEKP的突变导致DNA结合亲和力的大量损失(17). 为了改善TGEKP连接子中的任何缺陷，在含有典型TGEKP-连接子的两个三指蛋白质之间使用更长的中心连接子（9或12个残基）导致与靶位点的相互作用比三指成分紧密6000倍(25). 在我们自己使用这些连接物的研究中，我们无法重现这种效果。值得注意的是，最近有报道称，仅用TGEKP连接子构建的六指蛋白在体内转录调控优于四指或五指蛋白质，优于两个三指单位之间或三个二指单位之间具有12个残基连接子的蛋白质(26). 我们自己的良好结果与在所有手指之间使用TGEKP连接器是一致的。

ZFP的特异性来源于手指的数量和每个手指区分其他序列的能力。一般来说，ZF Tools使用的结构域在放置在新蛋白质的不同位置时保持其原始的高特异性(15). 在一项对80种三指蛋白的调查中，所有三指蛋白都与预期靶点结合，根据多靶点ELISA特异性测定，90%以上的三指蛋白具有高度特异性(15). 然而，为了避免偏离目标的影响，首选18 bp的目标位置。9 bp的靶位点预计在人类基因组中出现13000次，而18 bp的靶点预计在比人类基因组大20倍的基因组中只出现一次(15). 我们之前报道过E2C蛋白从三指移到六指时对某些手指的特异性降低(15). 一般来说，即使考虑到某些手指的特异性丧失，六指蛋白质较长的识别序列预计也会比三指蛋白质具有更大的特异性。此外，如果ZFP同时与预期靶点和相关靶点结合，它可能没有足够的亲和力（<10 nM），无法在相关靶点引发生物反应(15). 我们发现，设计用于识别18 bp靶位点并使用标准TGEKP连接子构建的六指蛋白是内源性基因调控的最佳解决方案。

专注于目标站点

采埃孚工具确定的潜在目标站点列表通常很长，因为现在可以作为目标的三元组数量众多。DNA酶超敏反应实验表明，可访问的DNA区域可用于评估确定的靶点中哪一个最有希望(27). 谨慎的做法是避免ZF Tools标记为未满足目标位置重叠要求的站点。然而，我们注意到，我们已经获得了具有未满足靶位重叠要求的高亲和力蛋白质。重要的是，采埃孚工具不会检查目标站点序列之外的未满足TSO要求，除非此类序列位于半个站点之间的非目标间隔内。因此，如果目标站点中最多的3′三元组是GNG（材料和方法），则用户必须手动检查未满足的TSO要求。最后，我们注意到一些性能最好的ZFP包含许多GNG域；GNN、ANN、CNN和TNN结构域通常也提供高亲和力和特异性蛋白质（数据未显示）。搜索工具提供了一种方法，可以将已识别的目标站点限制为由三元组子集组成的站点。

发件人生物信息学到体内：克隆和效应器域

ZFP的DNA编码序列通常通过标准PCR技术组装(6,28). 方便的是，最近许多公司已经开始提供长DNA分子的合成，六指蛋白质的DNA序列编码可以以良好的产量进行化学合成。通常，编码ZFP的DNA必须克隆到载体中，以创建具有效应域的融合蛋白。文献中使用的激活域包括转录激活物VP64(28)，单纯疱疹病毒蛋白VP16的衍生物，以及人类p65蛋白的激活域，NF-κB复合物的组成部分(29). 抑制域包括人类衍生的Krüppel-associated box（KRAB）(30)，Mad mSIN3交互域（SID）(31)ERF抑制域（ERD）(32)与组蛋白脱乙酰酶HDAC1直接融合(33). 然后将载体转移到感兴趣的细胞中，并监测适当基因的mRNA水平，例如通过RT-PCR。或者，ZFP反应元件DNA可以克隆到报告者上游的最小启动子中，如荧光素酶，并在与含有ZFP的表达质粒共转染后检测活性(6).

我们感谢罗伯塔·富勒（Roberta Fuller）为准备ELISA图提供的帮助，感谢巴巴斯小组的其他成员进行的有益讨论。这项工作得到了国立卫生研究院CA086258、GM065059和GM075110的支持。国家卫生研究院提供资金支付本文的开放获取出版费用。

利益冲突声明。未声明。