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EMBO J。2006年8月9日；25(15): 3618–3626.
在线发布2006年7月27日。 数字对象标识：10.1038/sj.emboj.7601249
预防性维修识别码：项目经理1538564
PMID：16874301

一种新的线粒体泛素连接酶在线粒体动力学中起关键作用

Ryo Yonashiro先生,1,2 石岛佐治,三，b条 新口奎,2 福田东史,1 后藤英治,2,三 松木洋平,2,三 大村麻利,三 Kiyonao Sada公司,2 哈克·霍塔,2 山村弘弘,2 稻户龙子,1,2和柳木茂1,4,一
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摘要

在这项研究中，我们发现了一部小说米托软骨泛素我igase，命名为MITOL，定位于线粒体外膜。MITOL具有一个植物同源域（PHD）基序，负责E3泛素连接酶活性和预测的四个跨膜结构域。MITOL通过PHD依赖的自泛素活性表现出快速降解。通过小干扰RNA稳定表达缺乏泛素连接酶活性的MITOL突变或MITOL缺陷细胞的HeLa细胞显示出异常的线粒体形态，如断裂，表明MITOL功能障碍导致线粒体分裂增强。事实上，Drp1突变体的显性负表达阻断了由MITOL缺失诱导的线粒体断裂。我们发现MITOL与线粒体裂变蛋白hFis1和Drp1相关并泛素化。脉冲追踪实验表明，MITOL过度表达增加了这些裂变蛋白的周转。此外，hFis1的过度表达表型可以通过MITOL的共同过度表达而恢复。我们的发现表明，MITOL通过控制线粒体分裂蛋白在线粒体动力学中发挥着关键作用。

关键词：E3泛素连接酶，线粒体，线粒体动力学，线粒体裂变

介绍

泛素化是一种翻译后修饰，通过一系列复杂的酶反应，将一种小的保守肽泛素附加到细胞中的靶蛋白上(Hershko和Ciechanover，1992年). 泛素-蛋白酶体系统在控制各种细胞蛋白质水平和调节细胞周期进程、信号转导、细胞转化和免疫识别等基本细胞过程中起着重要作用(Hershko和Ciechanover，1998年). 该系统还参与蛋白质质量控制，维持细胞的健康(Sitia和Braakman，2003年).

E3泛素连接酶是一个蛋白质大家族，可分为三种结构上不同的主要类型：N末端规则E3、含有HECT（E6AP C末端同源）结构域的E3和带有RING（真正有趣的新基因）指的E3，包括其衍生物、U-Box和PHD（植物同源域）(杰克逊等, 2000;皮卡，2001年;帕特森，2002年). PHD是锌指的一个广泛分布的亚家族，最初被认为参与染色质介导的转录调控。但最近的研究表明，含有PHD的各种蛋白质作为E3泛素连接酶发挥作用，包括MEKK1和Doa10(Coscoy和Ganem，2003年). 随后，发现了几种含有PHD的病毒蛋白，它们通过下调控制免疫识别的蛋白质来促进免疫逃避(石岛等，2000年). 例如，卡波西肉瘤相关疱疹病毒编码两种蛋白质，MIR(米的调制器我公社第页识别）1和2，已证明其含有PHD，并作为免疫识别相关分子（如MHC I类分子）的E3泛素连接酶发挥作用(石岛等，2000亿;手段等, 2002). 因此，这些病毒调节剂通过作为需要PHD基序的E3泛素连接酶发挥作用，导致其靶点泛素化。我们最近证实，人类基因组还编码一种新的含PHD的蛋白质，该蛋白质作为E3泛素连接酶发挥作用，被指定为c-MIR(转到等, 2003). 此外，在含有PHD样c-MIR的相关哺乳动物蛋白质的基因组筛查中，我们发现了一种新的膜结合E3泛素连接酶，命名为MITOL，其特异性定位于线粒体。

线粒体是细胞能量生产和基本代谢反应的中心，通过释放细胞色素参与诱导细胞凋亡c（c）线粒体是非常活跃的细胞器。活细胞的时间推移显微镜显示线粒体不断迁移和形态变化。线粒体分裂和融合机制在细胞器的动力学、分裂、分布和形态中起着至关重要的作用(雅菲，1999年;詹森等, 2000;格里帕里克和范德布利克，2001年;Shaw和Nunnari，2002年). 进化保守的大GTP酶Dnm1/Drp1/Dlp1和Fzo1/mitofusin分别参与线粒体分裂和融合(Hales和Fuller，1997年;赫尔曼等, 1998;拉布鲁斯等, 1999;Sesaki和Jensen，1999年). 哺乳动物蛋白hFis1是已知参与酵母线粒体分裂的酵母Fis1p的同源物(詹姆斯等, 2003). 然而，它们的调节机制在很大程度上是未知的。

在本研究中，我们证明MITOL通过下调线粒体裂变蛋白参与线粒体动力学的调节。我们讨论了线粒体生物学中MITOL的关键作用。

结果

MITOL是一种新型线粒体特异性E3泛素连接酶

在MIR家族的人类基因组筛查中，我们发现了一种新的米托软骨泛素我igase并将其命名为MITOL。图1A显示了MITOL的氨基酸序列。MITOL在其N末端包含一个PHD基序，并预测了四个跨膜结构域。我们首先检测了MITOL中PHD是否表现出E3泛素连接酶活性。为此，生成了两个缺乏锌结合能力的结构体，即GST-fused PHD（MITOL的2-72个氨基酸）和GST-fuse PHD突变体（CS突变体；C65S，C68S）。体外用含有E1和E2s的兔网织红细胞裂解物进行泛素化试验，结果显示GST-PHD中有一个明确的多泛素信号，但GST或GST-PHD-CS突变中没有(图1B). 这表明MITOL中的PHD具有E3泛素连接酶活性。Northern印迹分析显示MITOL在各种人体组织中普遍表达(图1C). 为了确定MITOL的表达，针对对应于MITOL 257–279氨基酸的肽提出了一种特异性抗MITOL抗体。用抗MITOL抗体进行的Western blot分析表明，MITOL在COS-7和HeLa细胞中的表达均为≈30kDa带，但在对照免疫前血清中没有表达(图1D). 此外，MITOL表达载体转染细胞中增强的MITOL信号证实了该抗体的特异性和MITOL蛋白带的位置。

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新型膜结合E3泛素连接酶MITOL的鉴定。(A类)人类MITOL的氨基酸序列。PHD基序和预测的四个跨膜结构域分别由下划线和阴影线表示。针对氨基酸上方圆点所示的肽，提高抗-MITOL抗体。(B类)GST融合的MITOL-PHD中的E3泛素连接酶活性，但CS突变体（C65S，C68S）中没有。体外使用纯化的GST、GST-PHD和GST-PHD-CS突变体进行泛素连接酶分析，如材料和方法所述。(C类)不同人体组织中MITOL的Northern blot分析。使用全长人类MITOL cDNA作为探针。(D类)线粒体蛋白在COS-7和HeLa细胞系中的表达。将COS-7、HeLa和MITOL表达载体转染的HeLa细胞的裂解物与含有抗MITOL抗体的对照免疫前或免疫血清进行免疫印迹。

为了检测MITOL在HeLa细胞中的亚细胞分布，使用抗MITOL抗体进行免疫组织化学分析，如图所示图2A（上部面板）。内源性MITOL与线粒体标记物MitoTracker共定位，表明MITOL是一种线粒体蛋白。同样，用抗Myc抗体和MitoTracker对表达Myc-tagged MITOL的HeLa细胞进行免疫染色。Myc-tagged MITOL也与线粒体共定位(图2A，下部面板）。为了确认MITOL的线粒体定位，分离正常HeLa或表达Myc-tagged MITOL HeLa细胞的细胞溶质和线粒体部分，并用抗MITOL免疫印迹法测定MITOL定位(图2B，左）或抗Myc抗体(图2B，右）。正如预期的那样，MITOL定位于线粒体部分。由于线粒体部分已知含有部分内质网（ER）蛋白，因此分离了线粒体和富含ER的部分，并使用抗PDI（ER标记）和抗Tom20抗体（线粒体标记）检查了MITOL定位。如所示图2C，在富含ER的部分中未检测到MITOL，表明MITOL在线粒体中的特异性定位。碳酸盐提取试验表明MITOL表现为一种完整的膜蛋白。该结果与预测的四跨膜结构一致(图2D). 接下来，我们研究了线粒体是位于线粒体的外膜还是内膜。用胰蛋白酶处理从HeLa细胞制备的纯化的完整线粒体，胰蛋白酶攻击外膜蛋白的细胞溶质域。用胰蛋白酶处理不会影响内膜蛋白Tim23，但会降解MITOL和外膜蛋白Tom20(图2E). 通过非离子洗涤剂洋地黄素处理从线粒体中去除线粒体外膜蛋白。MITOL的洋地黄素溶解度与Tom20一致，但与Tim23不一致(图2E). 为了确定N-末端的拓扑结构，对从表达N-末端HA标记的MITOL的细胞中分离的线粒体进行了胰蛋白酶保护试验。如所示图2E（右图），经胰蛋白酶处理后，线粒体N端PHD结构域迅速消失。这些结果表明，MITOL定位于线粒体外膜，N末端PHD结构域暴露于细胞质。

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线粒体外膜中MITOL的特异性定位。(A类)线粒体与线粒体的克隆化。（上面板）HeLa细胞用抗线粒体（绿色）抗体和线粒体追踪（红色）进行免疫染色。（下面板）用抗Myc抗体（绿色）和MitoTracker（红色）对表达Myc-tagged MITOL的HeLa细胞进行免疫染色。(B类)亚细胞分馏表明线粒体中有丝分裂原的定位。从表达Myc-MITOL的HeLa（左）或HeLa细胞（右）分离的全裂解物（W）、细胞溶质（C）和线粒体部分（M）用抗MITOL、抗Myc、抗微管蛋白或抗Tim23线粒体标记抗体进行免疫印迹。(C类)线粒体部分（M）和从HeLa细胞分离的富ER-部分（ER）用抗MITOL、抗PDI（ER标记）或抗Tom20（线粒体标记）抗体进行免疫印迹。(D类)碳酸盐萃取实验表明MITOL是一种完整的膜蛋白。用抗MITOL、抗Tom20或抗细胞色素免疫印迹法对从分离线粒体中提取碳酸盐后的全裂解物（W）、上清液（S；外周蛋白）和颗粒（P；整体蛋白）组分进行免疫印迹c（c）抗体。(E类)MITOL对胰蛋白酶或洋地黄素治疗的敏感性表明MITOL定位于线粒体外膜。用胰蛋白酶或洋地黄素处理来自HeLa细胞（左、中面板）或表达N末端HA标记的MITOL的细胞（右面板）的纯化线粒体，并用抗MITOL、抗HA、抗Tim23或抗Tom20抗体的免疫印迹监测MITOL和线粒体标记物的消失。

利用自泛素活性快速降解MITOL

为了了解MITOL表达的代谢稳态水平，检测了蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）对MITOL表达的影响。如所示图3A（左面板），CHX治疗下调了MITOL的表达，这被蛋白酶体抑制剂MG132所阻断。在表达FLAG-MITOL的HeLa细胞中也得到了类似的结果(图3A，右侧面板）。FLAG-MITOL的半衰期约为60分钟，用CHX治疗3小时后，很难检测到MITOL蛋白带。另一方面，MG132治疗阻断了CHX诱导的MITOL下调（泳道7）。等量微管蛋白染色显示，每条通道中装载的蛋白质量相同。与FLAG-MITOL相比，CHX处理后内源性MITOL降解较慢，表明内源性MITOL可能受到未知修饰物的调节。

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通过自身泛素化活性快速降解MITOL。(A类)蛋白合成抑制剂CHX对MITOL蛋白表达的影响。在存在或不存在MG132（50μM）的情况下，用CHX（10μg/ml）处理HeLa细胞（左面板）或表达FLAG-MITOL WT的HeLa电池（右面板）指定时间，并用抗MITOL、抗FLAG或抗管蛋白抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。(B类)MITOL CS突变体无降解。用CHX（10μg/ml）处理HeLa细胞或表达FLAG-MITOL WT或FLAG-MITOL CS突变体的HeLa电池3小时，并用抗FLAG或抗tubin抗体进行免疫印迹。(C类)MITOL WT而非MITOL CS突变体的多泛素化。将与对照载体FLAG-MITOL WT或带有HA标记泛素（HA-Ub）的FLAG-MITOL CS突变体共转染的HeLa细胞的裂解液用抗FLAG抗体琼脂糖珠免疫沉淀，并用抗HA或抗FLAG的抗体免疫印迹。(D类)MITOL CS突变体引起的线粒体聚集。用抗Myc抗体和MitoTracker对表达Myc-MITOL WT和CS突变体的HeLa细胞进行染色。棒材，10μm。通过计数至少100个细胞来测量MITOL WT或CS突变体诱导的线粒体聚集（右侧面板）。误差线代表s.d。n个=3. (E类)MITOL CS突变体在不溶性部分的积累。从表达Myc-MITOL WT或CS突变体的HeLa细胞或HeLa电池中分离出全部裂解物（W）、可溶性（S）和不溶性（I）部分，并用抗Myc抗体进行免疫印迹。棒材，10μm。(F类)电子显微镜分析表明MITOL CS突变体过度表达细胞线粒体严重受损。在27600倍放大的电子显微镜下，对对照载体、MITOL WT或CS突变转染细胞的线粒体形态进行了检查。

为了确定MITOL-PHD中的泛素连接酶活性是否是MITOL降解所必需的，类似地研究了CHX处理对CS突变体降解的影响。图3B表明CHX处理未能降解CS突变体。这表明MITOL的降解是PHD依赖性的。因此，我们研究了MITOL是否表现出自泛素化活性。用来自HeLa细胞的抗FLAG抗体免疫沉淀FLAG-MITOL和HA-ubiquitin，结果显示FLAG-MITO野生型（WT）具有显著的多泛素化，但CS突变型没有出现(图3C). 这表明MITOL具有自泛素化活性。综上所述，这些结果表明，MITOL通过PHD依赖的自泛素化活性快速降解MITOL，从而严格控制其蛋白表达水平。

为了研究这种通过自身泛素化活性快速转换MITOL的生理相关性，使用瞬时表达系统检测了CS突变对线粒体功能和形态的影响。我们发现，与MITOL WT相比，CS突变显著诱导线粒体聚集(图3D). 统计分析表明，超过80%的CS突变表达线粒体形成聚集，而只有10-20%的WT表达线粒体聚集。Western blot分析表明线粒体不溶部分中存在CS突变而非WT的积累(图3E). 电子显微镜分析显示CS突变体表达细胞的线粒体肿胀和塌陷(图3F). 在WT表达的线粒体中没有观察到这种现象。这种线粒体功能障碍可能是由不溶性或未折叠CS突变的积累引起的。综上所述，这些结果表明，MITOL的泛素连接酶活性对于抑制退化MITOL（包括其他蛋白质）在线粒体中的积累是必要的。

线粒体分裂因子与线粒体分裂因子相互作用和泛素化对线粒体动力学的MITOL需求

为了评估MITOL在线粒体中的作用，我们建立了几种稳定表达FLAG-MITOL WT或FLAG-MITOL CS突变体的HeLa细胞系。我们发现FLAG-MITOL WT或CS突变体的稳定表达水平大大低于其瞬时表达水平(图4A，右侧面板）。这可能是由于FLAG-MITOL通过一种未知机制下调，以保护细胞免受毒性的影响，例如FLAG-MITOL WT或CS突变体过度表达诱导的线粒体聚集。事实上，在表达FLAG-MITOL WT或CS突变的HeLa细胞系的稳定克隆中未观察到明显的线粒体聚集。相反，表达CS突变体（但不表达WT）的HeLa细胞系经常表现出异常的线粒体形态，如断裂(图4A，左侧面板）。CS突变细胞系中约30-50%的线粒体出现线粒体断裂。其他两个CS突变体也显示出类似的线粒体碎片。为了验证这一现象，我们检测了MITOL敲除对线粒体形态的影响。以干扰小干扰RNA（siRNA）为对照或两种抗MITOL的siRNA转染HeLa细胞，孵育48 h，用抗MITOL抗体探针免疫印迹分析检测内源性MITOL表达水平。如所示图4B这两种siRNAs都是针对MITOL的，但没有加扰，MITOL表达减少了约70-90%。使用该系统，我们比较了对照线粒体和MITOL缺陷线粒体的线粒体形态，发现MITOL缺乏线粒体的线粒体碎片增加。统计分析表明，在转染siRNA1或siRNA2的细胞中，50%以上的线粒体碎片化。我们生成了另外三个针对MITOL的siRNA，发现转染了这三个siRNA的细胞表现出类似的线粒体断裂（未显示）。这一结果表明线粒体分裂因MITOL缺失而增强。为了确定由siRNA介导的内源性MITOL过度表达引起的线粒体断裂是否是hFis1/Drp1依赖性裂变所特有的，我们检测了显性负性Drp1 GTPase缺陷突变体（Drp1K38A）表达对MITOL缺陷线粒体形态的影响。如所示图4C在siRNA和Drp1K38A共转染后，显性阴性的Drp1突变体通过siRNA1介导的MITOL缺失阻止线粒体断裂。统计分析表明，Drp1突变体在90%以上的MITOL缺失细胞中诱导线粒体伸长。这些结果表明，线粒体正常形态需要MITOL，MITOL可能通过调节线粒体分裂参与线粒体动力学。

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线粒体形态中MITOL的关键作用。(A类)稳定表达FLAG-MITOL CS突变体的HeLa细胞系的线粒体断裂。用MitoTracker对稳定表达对照载体、FLAG-MITOL WT或CS突变体的HeLa细胞系进行染色，并比较线粒体形态。通过使用抗FLAG抗体的免疫印迹法显示稳定转染和瞬时转染后相对于模拟转染细胞的FLAG-MITOL表达水平（右图）。棒材，10μm。(B类)线粒体缺陷细胞线粒体形态异常。转染craft、MITOL siRNA1或siRNA2的HeLa细胞用抗FLAG和抗小病毒抗体进行免疫印迹（右）或用MitoTracker染色（左）。棒材，10μm。从100个干扰或MITOL siRNA转染细胞中计算出显示每个线粒体形态的细胞百分比。误差线代表s.d。n个=3. (C类)显性负性Drp1突变通过MITOL缺失阻断线粒体断裂。转染FLAG-Drp1突变体（K38A）和siRNA1的HeLa细胞用MitoTracker和抗FLAG抗体染色。箭头和星号分别表示具有或不具有Drp1突变表达的siRNA1介导的MITOL耗竭细胞。棒材，10μm。从100个有或无Drp1突变表达的MITOL缺失细胞中计算显示每种线粒体形态的细胞百分比。误差线代表s.d。n个=3。

siRNA介导的MITOL敲除实验表明，线粒体裂变因子如hFis1或Drp1可能是MITOL的底物。为了探索这种可能性，我们研究了MITOL是否能泛素化hFis1。如所示图5发现MITOL WT，但不是CS突变体泛素化hFis1。此外，联合免疫沉淀分析显示MITOL与hFis1相关(图5B). 为了研究MITOL在内源性hFis1控制中的作用，我们生成了表达MITOL WT和CS突变的腺病毒构建物。与表达LacZ的细胞相比，表达MITOL WT的细胞中内源性hFis1减少(图5C). CHX处理表明MITOL缺陷细胞内源性hFis1的降解延迟。为了进一步证明hFis1的MITOL依赖性转换，进行了脉冲追踪实验。如所示图5D和E，MITOL过度表达促进hFis1转换，MG132处理抑制了这种作用。用抗FLAG抗体进行的免疫印迹分析表明，等量的hFis1被免疫沉淀（未显示）。因此，MITOL可能通过泛素-蛋白酶体途径控制hFis1的蛋白表达水平。事实上，hFis1的过度表达导致线粒体断裂(图6A). 因此，我们接下来测试了hFis1的过度表达表型是否可以通过MITOL的共同过度表达而恢复。预期MITOL WT而非CS突变体的共同过度表达阻止了hFis1诱导的线粒体断裂(图6B和C). MITOL CS突变体的共表达诱导由碎片线粒体组成的线粒体聚集。

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MITOL与线粒体裂变蛋白hFis1相关并泛素化。(A类)MITOL对hFis1的泛素化。转染指示载体的HeLa细胞裂解液用抗FLAG抗体进行免疫沉淀，免疫沉淀用抗HA或抗FLAG的抗体进行免疫印迹。用抗Myc抗体对整个裂解物进行免疫印迹。(B类)MITOL与hFis1的相互作用。转染有指示载体的HeLa细胞的裂解液用抗Myc抗体进行免疫沉淀，免疫沉淀用抗FLAG或抗Myc的抗体进行免疫印迹。为了证明联合免疫沉淀的特异性，使用抗HA抗体作为阴性对照。用抗FLAG抗体对整个裂解产物进行免疫印迹，以确认FLAG-hFis1的表达。(C类)MITOL功能障碍导致内源性hFis1积累。用抗hFis1、抗MITOL或抗管蛋白抗体对感染所示腺病毒载体的HeLa细胞裂解液进行免疫印迹（左面板）。用CHX（10μg/ml）处理转染craft或MITOL siRNA1的HeLa细胞的裂解液指定时间，并用抗hFis1、抗Tublin或抗MITOL抗体进行免疫印迹（右侧面板）。(D类)MITOL的表达导致hFis1的快速转换。进行脉冲追踪实验。将表达FLAG-hFis1或FLAG-hFis1/MITOL WT的HeLa细胞标记60分钟[35S] Met/Cys标记混合物，并在完整的DMEM中追踪指定的时间。(E类)MG132对MITOL过度表达促进的hFis1转换的影响。在无MG132或有MG132的情况下，表达FLAG-hFis1/MITOL WT的HeLa细胞同样在指定的时间段内进行追踪。用抗FLAG抗体溶解细胞并免疫沉淀，通过放射自显影术观察免疫沉淀的FLAG-hFis1。结果（D或E）代表了三个独立的实验。NIH图像分析估计的相对值如下所示。

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通过MITOL共表达拯救hFis1表达表型。(A类)hFis1表达导致线粒体断裂。用MitoTracker和抗FLAG抗体对表达FLAG-hFis1的HeLa细胞进行染色。棒材，10μm。(B类)MITOL WT而非CS突变的共表达阻断了hFis1诱导的线粒体断裂。用MitoTracker、抗FLAG和抗Myc抗体对共表达Myc-MITOL WT或CS突变与FLAG-hFis1的HeLa细胞进行染色。棒材，10μm。(C类)从100 hFis1、hFis1/MITOL WT或hFis1/MITOL CS共表达细胞中计算显示每个线粒体形态的细胞百分比。误差线代表s.d。n个=3.

类似地观察到Drp1与MITOL和MITOL依赖性泛素化的关联，如补充数据1脉冲追踪实验也表明MITOL过度表达促进了Drp1的转换。然而，MITOL对Drp1的泛素化低于hFis1，内源性Drp1表达水平不受腺病毒介导的MITOL WT表达的影响（未显示）。这可能是由于与hFis1的线粒体膜定位相比，Drp1的细胞溶质分布。此外，对于MITOL，hFis1可能比Drp1更好。综上所述，这些结果表明MITOL通过直接相互作用和泛素化控制hFis1和Drp1参与线粒体动力学。

讨论

在这项研究中，我们发现了一种新的膜结合泛素连接酶，命名为MITOL，它特异性地定位于线粒体。由于迄今为止没有报道线粒体特异性泛素连合酶，MITOL的发现首次表明线粒体具有假定的泛素化系统。MITOL似乎与March-V相同，除了对其ER定位的描述外，其功能尚未报道(巴特等2004年). 在他们的论文中，对March-V定位的描述很差，我们的结果表明他们对March-V定位的描述是不正确的。在这里，我们已经证明MITOL参与线粒体动力学。含有PHD基序的一个新蛋白家族已被证明构成了一个广泛分布的锌指蛋白亚家族，其功能为E3泛素连接酶。已经确定了几种含有PHD的病毒蛋白，它们通过下调控制免疫识别的蛋白质来促进免疫逃避(石岛等，2000年). 因此，该家族具有促进或帮助某些病毒或细胞器（如宿主细胞中的线粒体）存活的共同特征。

在真核生物中，线粒体是数量和形状不同的动态移动细胞器。对立裂变和融合之间的平衡对于维持线粒体形态很重要(Yaffe，1999年;Shaw和Nunnari，2002年). 在哺乳动物细胞中，外膜蛋白Fzo1/丝裂原(陈等, 2003)内膜蛋白OPA1在线粒体融合中起作用(三坂等, 2002)而细胞溶质蛋白Drp1和外膜蛋白hFis1参与线粒体分裂(斯米尔诺娃等, 2001;詹姆斯等, 2003). 然而，到目前为止，裂变和聚变之间动态平衡的调节基本上是未知的。在酵母中，Mdm30是一种含有F-box基序的E3泛素连接酶，据报道可以调节Fzo1的蛋白水平(弗里茨等, 2003). 另一方面，Drp1的sumoylation提高了其在线粒体的稳态水平并加速线粒体断裂(更努力等, 2004). 因此，一个解释如何协调融合和裂变之间平衡的模型是通过修饰sumoylation和泛素化来控制这些参与融合和裂变的因素的蛋白质水平。事实上，线粒体缺陷的HeLa细胞显示出许多碎片状或非常短的丝状线粒体(图4). 共转染和脉冲追踪实验表明hFis1和Drp1与MITOL相关并被MITOL泛素化。因此，MITOL可能通过泛素-蛋白酶体途径控制hFis1和Drp1蛋白水平，从而密切参与线粒体动力学。由于线粒体融合因子以及裂变因子也可能受到MITOL的调节，MITOL与融合因子之间的关系有待进一步研究。

E3泛素连接酶广泛分布于细胞内，包括质膜、细胞质、高尔基体和内质网。尤其是位于内质网的膜结合泛素连合酶已被证明通过与伴侣分子的相互作用参与蛋白质质量控制(Sitia和Braakman，2003年). 在线粒体中，未折叠的蛋白质被定位于线粒体每个隔室的ATP依赖性蛋白酶降解(兰格等, 2001;阿诺德和兰格，2002年). 然而，一些线粒体蛋白质如Tom20和禁止蛋白已被报道为泛素化(赖特等2001年;汤普森等, 2003)这表明线粒体中存在特定的泛素-蛋白酶体系统。当我们确定伴侣是线粒体相互作用蛋白之一时，线粒体可能与泛素展开的线粒体蛋白相互作用。线粒体作为蛋白质质量控制系统，可能具有假定的泛素化途径。我们现在正在研究MITOL在线粒体质量控制中的作用。

在我们的初步观察中，延时成像分析表明siRNA介导的MITOL缺失细胞线粒体运动存在严重缺陷。在这些细胞中，线粒体保持在相同的位置，经常显示出核周聚集。有趣的是，有一种线粒体相互作用蛋白与运动蛋白密切相关。因此，MITOL可能参与线粒体基于微管的运动。我们目前正在尝试生成表达MITOL WT或CS突变体的转基因小鼠。我们已经成功地培育出过表达MITOL WT的转基因小鼠，但没有培育出CS突变体，这表明表达MITOL-CS突变体的转基因小鼠可能无法存活。有必要进一步研究MITOL的功能。

材料和方法

人类MITOL cDNA的数据库检索与克隆

为了克隆编码人类MITOL的cDNA，根据制造商的协议，使用上标RT试剂盒（Invitrogen）对从BJAB细胞中分离的总RNA进行逆转录。为了确定MITOL cDNA整个编码序列的5′端和3′端，使用GeneRacer试剂盒（Invitrogen）快速扩增cDNA末端。通过PCR获得MITOL的全长cDNA，并将其亚克隆到pEF-1（Invitrogen）和pAAV IRES-EGFP载体中，并使用310型DNA测序器（Applied Biosystems）进行测序。为了引入C末端FLAG和Myc表位标签，使用适当的引物通过PCR扩增MITOL cDNA，并将其亚克隆到pApuro载体中。利用海德堡（PHD）的剖面反馈神经网络系统和sosui程序对MITOL的假定二级结构和跨膜拓扑进行了检验。Cys的点突变65和Cys68通过定点突变试剂盒（Stratagene）产生MITOL cDNA到Ser。

人体组织中MITOL mRNA的检测

将小鼠NorthernLIGHT blots（Panomics）中每车道含有1μg Poly（A）+RNA的Poly（A）+RNA印迹与32P标记的全长小鼠MITOL cDNA。根据制造商的协议进行杂交。清洗后，使用增感屏将膜暴露在−70°C的X射线胶片下(伊纳托姆等, 2000).

细胞培养和转染

HeLa和COS-7细胞在含有10%胎牛血清和100 U/ml青霉素的Dulbecco改良Eagle's培养基中生长，浓度为5%CO237°C时。对于瞬时检测，根据制造商的说明，使用脂质体+（Invitrogen）转染表达质粒。

小干扰RNA

对于RNAi分析，从Dharmacon购买与以下靶序列相对应的正、反义寡核苷酸：5′-GCTCTATTGGAGAG-3′（No.1），5′-TCTTGTGGAATTGGTT-3′（No.2）。扰民寡核苷酸被用作阴性对照。使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）将退火的siRNA双链转染到HeLa细胞中。

抗体

用合成肽GCKQQYLRQAHRKILNYPEQEEA免疫兔子，产生针对MITOL的抗体，该合成肽对应于MITOL 257–279氨基酸。抗-FLAG（M2）、抗α-微管蛋白和抗小管蛋白抗体来自Sigma。抗-c-Myc抗体来自Roche。抗HA抗体来自Babco。抗泛素（P4D1）抗体来自圣克鲁斯。小鼠抗细胞色素单克隆抗体c（c）、Tom20、Tim23和PDI从BD Biosciences购买。

免疫荧光显微镜

细胞在37°C下用4%多聚甲醛在磷酸盐缓冲液（PBS）中固定1 h，然后用0.2%吐温20在PBS中洗涤两次，用0.2%Triton X-100在PBS内渗透10 min，用PBS洗涤四次，并用3%牛血清白蛋白在PBS里封闭，均在室温下进行。为了进行双重染色，细胞在室温下与适当的一级抗体孵育1小时，用0.5%Triton X-100在PBS中洗涤三次，然后用适当的二级抗体（Alexa Fluor山羊抗兔IgG、Alexa Fluor山羊抗鼠IgG）洗涤30分钟。为了观察线粒体，添加100 nM MitoTracker（分子探针）并孵育30 min。如前所述清洗样品，使用PermaFluor（Immunon）进行安装，并使用蔡司LSM510共焦激光扫描显微镜进行分析(霍塔等, 2005).

电子显微镜分析

在0.1M磷酸钠缓冲液（pH 7.4）中用2.5%戊二醛固定表达MITOL WT或CS突变体的HeLa细胞。使用2%OsO对其进行后固定4在同一个缓冲区中。用梯度系列乙醇脱水后，用环氧丙烷取代，并嵌入环氧树脂中。用乙酸铀酰和柠檬酸铅对银至金薄片进行双重染色，并用H-7000透射电子显微镜（日立，日本东京）进行检查，并在各种放大倍数下拍照。

免疫沉淀和免疫印迹

如前所述制备细胞裂解物、免疫沉淀和免疫印迹(Kyo（京）等, 2003). 为了研究蛋白质的泛素化，将细胞溶解在裂解缓冲液（1%Triton X-100、50 mM Tris、pH 7.4、150 mM NaCl、10 mM EDTA、1 mM PMSF、2μg/ml抑肽酶）中，以分离蛋白质复合物。通过直接向单层膜中添加1×SDS样品缓冲液来制备总细胞裂解物。用SDS–PAGE分离免疫沉淀物和总细胞裂解物，并转移到PVDF膜（密理博）(三井等, 2002). 用指示的抗体探测斑点。在所有的印迹中，通过增强化学发光试剂（Western Lightning；PerkinElmer LifeScience）观察蛋白质。

质粒构建

通过RT-PCR从HeLa细胞总RNA中获得带有C末端FLAG表位标签的Drp1 cDNA和带有N末端的hFis1 cDNA，并将其亚克隆到pCMV5表达载体中。Lys的点突变38通过定点突变产生的Drp1 cDNA到Ala。为了构建GST融合蛋白的质粒DNA，通过PCR扩增了一个编码MITOL PHD结构域的片段，然后将其亚克隆到pGEX 4T-3载体（Amersham Biosciences）中。

亚细胞分离

使用线粒体分离试剂盒（Active Motif）分离线粒体。收集的上清液和颗粒分别用作ER和线粒体组分。以牛血清白蛋白（BSA）为标准，采用生物反应蛋白测定法（Bio-Rad）测定蛋白质浓度。

碳酸盐萃取分析

为了确认MIOL是外周蛋白还是整体蛋白，我们进行了碳酸盐提取。等压缓冲液中的线粒体悬浮液（250 mM蔗糖，2.5 mM Hepes pH 7.5）以200 mM Na的等量添加2一氧化碳三（pH 11.5）（最后100 mM）并在冰上培养30分钟。悬浮液在144000下离心克在4°C下保持1小时。用100mM Na稀释收集的上清液（外周蛋白级分）和沉淀（整体蛋白级分）2一氧化碳三等渗缓冲液中。

脉冲追踪分析

用无Met/Cys-free DMEM培养HeLa细胞1 h，然后添加500μCi35S-标记的Met/Cys混合物1小时。标记后，在PBS中清洗细胞，并在不含放射性氨基酸的完整培养基中培养指定时间。细胞在PBS中清洗，裂解并用抗FLAG M2琼脂糖（Sigma）免疫沉淀等量蛋白。

泛素化测定

对于在体外自泛素化分析，GST融合蛋白产生如下。0.1 mM异丙基-1诱导GST融合蛋白的表达-D类-硫代半乳糖苷在含有蛋白酶抑制剂的1%Triton X-100裂解缓冲液中超声处理细菌颗粒3-6小时。通过离心清除后，细菌裂解物与谷胱甘肽-脑葡萄糖珠培养（Amersham Biosciences）。10μg沉淀的GST融合蛋白用裂解缓冲液洗涤三次，用泛素化缓冲液洗涤一次（40mM Tris–HCl，pH 7.5，5mM MgCl2，2 mM ATP，2μM二硫苏糖醇，25μM MG132），并在30°C下，在150μl添加有兔网织红细胞裂解物和40μg His标记泛素（钙生物化学）的相同缓冲液中培养2 h。之后在体外泛素化，所有样品用裂解缓冲液洗涤四次，用SDS样品缓冲液洗脱，用抗泛素（P4D1）抗体进行免疫印迹分析。

腺病毒载体的构建

基于腺病毒的MITOL载体由ViraPower腺病毒网关表达（Invitrogen）产生。用脂质体（Invitrogen）和滴度为10的腺病毒将重组腺病毒质粒转染293T细胞10–1012收集PFU/ml。

洋地黄/胰蛋白酶治疗

用线粒体缓冲液（70 mM蔗糖，220 mMD类-以0、0.1或0.5%（w/v）的最终浓度添加甘露醇、2.5 mM Hepes–KOH pH 7.4）和洋地黄素。每个样品在冰上孵育10分钟，添加4体积线粒体缓冲液，并在4°C下11000 r.p.m.离心10分钟。每个颗粒用线粒体缓冲液悬浮，并通过Western blot进行分析。对于胰蛋白酶处理，将胰蛋白酶以最终浓度1%添加到线粒体部分，并在冰上培养0、5、10或15分钟。添加蛋白酶抑制剂并在4°C下11000 r.p.m.离心10分钟后，用线粒体缓冲液悬浮每个颗粒，并通过Western blot进行分析。

补充材料

补充图

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补充图图例

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致谢

这项研究部分得到了MEXT和JSPS科学研究资助。我们感谢T Kozaki先生的技术援助。我们感谢D Bohmann博士提供的HA-ubiquitin表达质粒和H Hirai博士提供的pAAV IRES-EGFP载体。我们还感谢S Jahanger博士和M Kojima博士对手稿的批判性阅读。

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