含Sp1、C/EBPβ和HMGI-Y的核蛋白复合物控制人胰岛素受体基因转录

寡核苷酸和EMSA。

使用先前描述的重组质粒pCAT-C2和pCAT-E3通过PCR扩增产生人类IR启动子区域的野生型和突变C2（300-bp）和E3（300-bb）序列(1)及其突变克隆作为模板（见下文）和以下引物：C2用于，5′-TCGAGTCACAAAATAAACAT-3′（用于野生型和突变寡核苷酸）；C2修订版，5′-TGCAGGGGAGGGGGAG TGCCGC-3′（用于野生型寡核苷酸）；pCAT-C2 rev，5′-ATTGGGATATATATCAACGGTGGTTATATCC-3′（突变寡核苷酸）；pCAT-E3用于，5′-TACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAG-3′（用于突变寡核苷酸）；5′-AGATCTCTGGCCATTGCACTCCAG-3′的E3（用于野生型寡核苷酸）；和E3 rev，5′-TTCAAAACAGTTTTGCTAGGAGC-3′（用于野生型和突变寡核苷酸）。³²如前所述，在电泳迁移率变化分析（EMSA）中使用了P标记的C2和E3(1). 在竞争研究中使用含有C/EBPβ的野生型或突变结合位点的双链寡核苷酸（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）。含有HMGI-Y（5′-GAGAAAAAACTCCATCT）相关结合元件的双标记45米寡核苷酸AAAAAAAAaaaaaaaaAAAAAAAACA-3′）或Sp1（5′-GGGAGGCggG公司通用航空公司GgCGg公司GCGG公司GGCggGGCGG行政协调会GgGCgG公司CACC-3′）分别由E3和C2化学合成（Life Technologies，Gaithersburg，Md.），并用于诱饵实验（仅显示编码链；突变碱基用小写字母标识；HMGI-Y和Sp1结合位点下划线）。

GST下拉分析。

³⁵使用TNT-T7快速偶联转录/翻译系统（威斯康星州麦迪逊市普罗米加）在体外合成S标记蛋白（血凝素标记HMGI、Sp1和C/EBPβ）。谷胱甘肽S公司-转移酶（GST）融合蛋白表达载体，包括HMGI及其衍生物的表达载体、D.Thanos（纽约哥伦比亚大学）的馈赠品、Sp1及其衍生物、H.Rotheneder（奥地利维也纳大学）的赠送品以及pGEX-2TK控制载体（新泽西州皮斯卡塔韦Amersham Pharmacia Biotech）转化为大肠杆菌（加利福尼亚州拉霍亚市斯特拉赫纳），在悬浮培养基中扩增，并用0.5 mM异丙基诱导2 h-d日-硫代吡喃半乳糖苷。将细菌制成丸，在含有1%NP-40、10%甘油、1mM二硫苏糖醇（DTT）、1mM苯甲基磺酰氟（PMSF）、10μg胃蛋白酶抑制素A、亮氨酸蛋白酶和抑肽酶/ml以及0.4 mg溶菌酶/ml的冰镇磷酸盐缓冲盐水溶解缓冲液中进行超声处理，然后离心。然后将所得上清液添加到300μl谷胱甘肽-淀粉珠中，在4°C的转轮上混合2 h，并离心。用裂解缓冲液洗涤颗粒中结合的GST融合蛋白五次，并将其重新悬浮在300μl结合缓冲液中（50 mM NaCl、20 mM Tris-HCl[pH8.0]、0.05%NP-40、0.25%牛血清白蛋白[BSA]、1 mM PMSF、1 mM-DTT）。结合蛋白用考马斯蛋白质分析试剂（皮尔斯，罗克福德，伊利诺伊州）定量，结合到谷胱甘肽-糖珠的每个GST蛋白0.5μg与7μl的体外翻译³⁵S标记蛋白在4°C的150μl结合缓冲液中放置2 h。通过离心终止反应，用蛋白结合缓冲液洗涤沉淀三次，并进行十二烷基硫酸钠10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-10%PAGE），通过放射自显影术观察蛋白质。

免疫沉淀和免疫印迹。

为了进行免疫沉淀，将HepG2或3T3-L1细胞核提取物或HMGI-Y和纯Sp1的等分样品与10μl抗体偶联蛋白A珠一起在4°C下旋转培养3 h。通过温和离心回收珠子，并用500μl NETN洗涤缓冲液（0.1%NP-40，150 mM NaCl，1 mM EDTA，50 mM Tris-HCl[pH8.0]）洗涤5分钟。通过在样品缓冲液中煮沸5分钟，从珠子中去除蛋白质，并如前所述通过SDS-PAGE和免疫印迹分析(三). 对于Sp1抗体的免疫沉淀研究，向3T3-L1细胞的核提取物中添加主要抗体-糖结合物（PEP 2；10μg；Santa Cruz Biotechnology），并如上所述分析蛋白质。如前所述，对健康和糖尿病患者HepG2、MCF-7和EBV转化的淋巴母细胞核提取物中的HMGI-Y、Sp1和C/EBPβ进行Western blot分析(三). 用于这些研究的抗体如下：抗HMGI-Y(三)、抗Sp1（PEP 2；1:250）和抗C/EBPβ（C-19；1:1000）（圣克鲁斯生物技术）。C/EBPβ（Δ198）抗原（Santa Cruz Biotechnology）作为阳性对照。

对于蛋白A-Sepharose（Amersham Pharmacia）抗体的共价偶联，将抗HMGI-Y或抗C/EBPβ多克隆抗体与珠混合，并在室温下旋转结合1h。在用200 mM硼酸钠（pH 8.0）进行大量清洗后，将固体二甲基吡美酰胺（密苏里州圣路易斯市西格玛）添加到最终浓度为20 mM的溶液中，并在室温下在滚筒上混合组分30分钟。为了停止反应，将珠子在200 mM乙醇胺（pH 8.0）中洗涤两次，并在室温下在滚筒上在200 mM乙醇胺中培养2 h。抗体偶联蛋白A珠在磷酸盐缓冲盐水中洗涤两次，用于免疫沉淀研究。

免疫耗竭和体外转录。

将蛋白A珠（100μl）悬浮在400μl转录缓冲液（30 mM HEPES[pH7.9]，3 mM MgCl）中₂，140 mM KCl），并与100μl抗Sp1或抗HMGI-Y多克隆抗体或对照（无关兔血清免疫球蛋白G）抗体在4°C下通过端对端旋转2小时轻轻混合。将含有0.1 mg BSA/ml的HeLa核提取物（400μl；Promega）与100μl抗体偶联珠轻轻混合，并在4°C下培养30 min。此步骤重复三次，然后将提取物转移到UFCMC超滤装置（密立波，贝德福德，马萨诸塞州），并在2000×克在4°C下保持约2小时，以达到约三倍的浓度。在线性化pCAT-IR质粒存在下，使用HeLa细胞提取物体外转录试剂盒（Promega）将免疫缺陷HeLa提取物用于体外转录研究(1)作为DNA模板，有或没有HMGI-Y(三)和/或纯Sp1，由R.Tjian（加州大学伯克利分校）赠送。RNA转录物与³²如前所述，进行了P标记氯霉素乙酰转移酶（CAT）引物和逆转录(39). 在竞争实验中，将含有野生型或突变HMGI-Y和/或Sp1或C/EBPβ结合位点的双链寡核苷酸添加到未经处理的HeLa提取物中，并且在暴露于IR-CAT模板之前，将提取物在室温下培养15分钟。

质粒和诱变。

本研究使用的真核表达质粒如下：pcDNA1-HMGI-Y（正反义），一份来自T.Maniatis（哈佛大学，剑桥，马萨诸塞州）的礼物，pEVR2/Sp1，一份由G.Suske（德国马尔堡菲利普斯大学）赠送的礼物，以及pSG5-C/EBPβ，一份从T.Penning（宾夕法尼亚大学，费城）赠送的礼品。体外转录和翻译中使用了质粒pSG5-C/EBPβ和pcDNA3-Sp1，后者是K.-S.Chang（德克萨斯大学，休斯顿）赠送的礼物，后者是G.Manfioletti（意大利的里雅斯特大学）赠送的HA-I表达载体。

用重叠延伸法对pCAT-C2和pCAT-E3中HMGI-Y和/或Sp1的DNA结合位点进行定点突变(11)使用野生型C2和E3序列作为PCR中的初始模板，并使用以下引物（Life Technologies Inc.）：C2-HMGI-Y for，5′-GCCACTAGAACccAATAGCAAccTGGTAGAGAAAGG-3′，C2-HMGI-Y rev，5′-CCTTCTACCAGTTTATTGGTAGGC-3′；C2-Sp1代表，5′-CCCCGGCACAGGAGGCttGGAGGCtGGAGaCGtCGtGCGGGGCG-3′，C2-Sp1rev，5′-CGCCCCGCaCGtCTCCCaaGCCTGTGCCGGG-3′（第一轮）；C2-Sp1代表，5′-GAGGTGCGGGCttGGCGGGACCGaGCtGCACCTCCCTCCCTCC-3′，C2-Sp1修订，5′-GAGGGAGAGGGGCGCtCGGTCCCGCCaaGCCCCGCACGTC-3′（第二轮）；E3-HMGI-Y代表，5′-AACTCACTCttctagAAAAAAAAAA AAAAAAA AAAACAG-3′，E3-HMKI-Y版本，5′-CTGTTTTTTTTttTTTTTTtagaagAGAGATT-3′（第一轮）；E3-HMGI-Y代表，5′-ATCTCTAGAAgcgctagctAAAAAACAGAGAG-3′和E3-HMGI-Y版本，5′-CTCTCGTTTTTTTTagctagcTTAGAGAGAT-3′（第二轮）；E3-Sp1代表5′-AAGGAAAACGGAACTGATGtGatGAtGATTGCAAAAATATG-3′，E3-Sp1版本，5′-CATATTTGCAAAATCaTCtaCaCTGTTCCGTTTCCTT-3′。变异的碱基是小写字母。序列分析证实了突变。

HMGI-Y增强了Sp1与IR启动子的结合。

为了分析HMGI-Y是否对Sp1与IR启动子的结合产生任何影响，我们最初通过将放射性标记的片段C2或E3与来自HepG2细胞的未处理或热处理的核提取物（HNE）孵育来进行EMSA，一种天然表达HMGI-Y和Sp1核蛋白的细胞系，广泛用于IR表达研究(三). 核提取物的热处理消除了内源性Sp1的DNA结合，而HMG蛋白具有热稳定性(38). 如图所示。​图2A，2安培当HNE添加到反应混合物中时，纯Sp1与探针C2的结合增加。通过向反应混合物中添加HMGI-Y抗体，可以证明HMGI-Y存在于HNE中，并且增强了Sp1与DNA的结合。在未经处理的核提取物中，HMGI-Y在快速迁移的复合物中的存在通过其在抗HMGI-Y抗体存在下的超移位来验证，而在缓慢迁移的复合体内的Sp1通过其在存在抗Sp1抗体时的超移位而验证。分别在HMGI-Y或Sp1抗体存在的情况下，Sp1或HMGI-Y结合减少，表明这两个因子同时结合同一标记探针。在存在对照无关抗体的情况下，未观察到对DNA蛋白结合的影响（数据未显示）。在滴定实验中，在纯HMGI-Y存在下，用0.25 ng纯Sp1观察到Sp1与探针C2的结合，而在没有HMGI-Y的情况下，首先用1 ng Sp1蛋白检测到Sp1-DNA复合物（图。​（图2B），2B型)表明HMGI-Y显著刺激Sp1与其DNA结合位点的结合。

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图2。

HMGI-Y增强了Sp1与IR启动子的结合，并通过对HMGI-Y结合位点的突变干扰来阻止。（A） EMSA带有C2探针和0.5μg未经处理的HepG2细胞核提取物（NE）或HNE以及纯HMGI-Y或Sp1蛋白（各2 ng）。在超位移测定中，NE与0.5μl针对HMGI-Y或Sp1的抗体（Ab）预孵育。在纯Sp1存在下，使用HMGI-Y抗体进行HNE超移分析。（B） 在不存在纯HMGI-Y（2 ng）的情况下（2至5车道）或存在纯HMGI-Y（6至9车道）的情况，用减少的纯Sp1（2和6车道，2 ng；3和7车道，1 ng；4和8车道，0.5 ng；5和9车道，0.25 ng）孵育探针C2。1号通道，单独探测。（C） 在野生型（wt）或突变型（m）探针C2存在的情况下，使用2.5 ng纯Sp1加上增加量的纯HMGI-Y（车道2和6，0 ng；车道3和7，1 ng；车道4和8，2 ng；车道5，9和11，4 ng）进行EMSA。车道1和10，单独探测。使用针对HMGI-Y或Sp1的抗体（通道12和13）对纯HMGI-Y和Sp1蛋白质进行超移分析。

为了分析HMGI-Y与DNA的结合是否是刺激Sp1结合的先决条件，我们用野生型探针C2和突变型进行了滴定实验，其中a区发生了突变。这种突变探针仍应结合Sp1，但应禁止HMGI-Y的结合，如图所示。​图2C，2摄氏度，在纯HMGI-Y存在下，Sp1与野生型探针C2的结合增强，稍有延迟，证实HMGI-Y和Sp1同时结合同一探针上的相邻位点。探针C2m完全检测不到HMGI-Y-DNA复合物，Sp1的结合几乎不受HMGI-Y的影响。探针E3的突变版本也获得了类似的结果，该突变版本是通过消除该序列中A27延伸段的21个碱基而产生的（数据未显示）。在任何条件下，我们都没有观察到HMGI-Y存在下的额外低迁移率络合物，这表明C2或E3、HMGI-Y和Sp1三元络合物（如果存在）在我们的分析条件下是暂时的或不稳定的。在使用抗HMGI-Y和抗Sp1抗体的超移位分析中，确认了与Sp1共复合物中HMGI-Y的存在（图。​（图2C）。2摄氏度). 综上所述，这些结果清楚地表明，HMGI-Y与IR启动子的结合是增强Sp1结合所必需的，并表明HMGI-Y刺激IR基因的分子机制。当HMGI-Y与DNA之间的接触被阻止时，对Sp1结合没有任何影响，这与HMGI-Y的结合可能改变DNA结构从而使其更有利于Sp1识别的概念一致。

HMGI-Y在缺乏DNA的情况下与Sp1相互作用。

HMGI-Y与多种转录因子之间的直接物理关联已被报道(31,36). 为了分析HMGI-Y和Sp1在体外相互作用的能力，在没有DNA的情况下，我们首先进行了GST下拉分析，其中在体外翻译³⁵分析S-标记的Sp1被GST-HMGI亲和树脂特异保留的能力。如图所示。​图3A，3A级，Sp1被GST-HMGI保留，而不仅仅是GST，这表明Sp1在体外与HMGI-Y发生物理相互作用。在一个相互作用的实验中，在体外合成³⁵S-标记HMGI与携带GST-Sp1的树脂特异结合，但不单独与携带GST的树脂结合。在高浓度溴化乙锭存在的情况下，观察到HMGI和Sp1之间的真正相互作用，这已被证明会破坏DNA依赖性蛋白质-蛋白质的接触(15). 在细胞核提取物或HMGI-Y与纯Sp1以及固定在蛋白A微球上的HMGI-Y抗体的共免疫沉淀研究中，进一步研究了HMGI-Y-和Sp1之间的相互作用。如图所示。​图3B，3B公司HepG2核提取物中HMGI-Y的免疫沉淀以及Sp1的Western blot分析显示了一个主要的特异性条带，该条带迁移到与Sp1大小相对应的位置。HMGI-Y和纯Sp1的结果相同，表明HMGI-Y与Sp1的结合是直接的，不受其他核因子的介导。当用抗HMGI-Y抗体重复相同的转移时，检测到一个独特的特异性条带，该条带迁移到与HMGI-Y大小相对应的位置。综上所述，这些数据明确表明HMGI-Y和Sp1在完整细胞的体外或体内物理相互作用，并表明HMGI-V和Sp1对IR启动子的物理和功能合作也可能通过直接接触发生。

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图3。

HMGI-Y和Sp1之间的物理关联。（A） SDS-PAGE共页³⁵S-Sp1与GST或GST-HMGI树脂结合（通道1至3），³⁵S-HMGI与GST或GST-Sp1树脂结合（通道4至6），以及³⁵在溴化乙锭（EtBr）存在下，S-Sp1与GST-HMGI树脂结合（泳道7至10）。在通道3、6和10中，将标记的蛋白质直接添加到凝胶中，而不与GST-蛋白质树脂结合并从中洗脱。（B） HMGI-Y和Sp1的免疫沉淀（IP），方法是使用抗-HMGI-Y抗体，然后在重复相同的转移后，使用抗-Sp1抗体（1到5道）或抗-HMGI-Y抗体（6到10道）进行免疫印迹。车道：1，10 ng纯HMGI-Y；2、10 ng纯Sp1；3、HepG2核提取物（NE；500μg）；4、HMGI-Y和Sp1（各20 ng）。在通道1和通道2中，蛋白质直接应用于凝胶，而不与蛋白A珠结合和洗脱。为了证明特异性，使用纯Sp1（20 ng）通过抗HMGI-Y抗体进行免疫沉淀（第5道，对照）。（C） HMGI-Y和Sp1内相互作用域的定位。³⁵S-Sp1或³⁵S-HMGI分别与含有归一化量野生型和各种突变型GST-HMGI或GST-Sp1的树脂孵育。特异结合蛋白通过SDS-PAGE进行解析，并通过放射自显影术进行可视化。（D） HMGI和Sp1.+的结构域，基本重复；−，酸性C端尾；R、 抑制域；A、 B、C和D，激活域；黑色条纹，锌指图案。数字对应与文本相关的氨基酸位置。

为了阐明HMGI-Y和Sp1的哪些区域是物理相互作用所必需的，我们使用这两种蛋白的GST-连锁缺失突变版本进行了GST下拉分析。如图所示。​图3C，3C公司HMGI突变体1-74和1-54分别缺乏C末端尾部加上第三、第二和第三个基本重复序列，与野生型（1-107）蛋白相比，其对Sp1的结合活性逐渐降低。携带第二个或第三个基本重复序列（克隆54-74和65-107）的蛋白质突变体在保留Sp1的能力方面与野生型蛋白质相似，而缺乏任何基本重复序列的HMGI突变体（克隆31-54和65-74）无法结合Sp1。这些数据表明，在HMGI-Y的背景下，与Sp1特异性相互作用所需的最小区域对应于中间碱性重复序列，该中间碱性重复序列两侧为中间和第三碱性重复序列之间的间隔区（氨基酸54至74），在这方面揭示了，类似于HMGI-Y和NF-κB之间相互作用的行为(39). 对GST-Sp1突变体和体外合成的³⁵S-标记HMGI。如图所示。​图3C，3C公司，Sp1突变体612-778，包含锌指基序和激活域D，能够以高亲和力结合HMGI。保留转录激活域A、B和C的Sp1 DNA结合缺陷突变体1-611也与HMGI相互作用，但程度低于全长（1-778）GST-Sp1。相反，含有Sp1阻遏结构域R和富含谷氨酰胺结构域A的氨基末端突变体1-283完全无法保留任何标记的HMGI。因此，这些发现表明，Sp1可能通过多个功能域与HMGI-Y相互作用，这些功能域可以在HMGI-Y存在的情况下作为有效的转录激活剂发挥作用。

HMGI-Y和Sp1之间的协同作用是IR基因转录和IR蛋白表达所必需的。

鉴于上述数据表明HMGI-Y与Sp1发生物理相互作用并促进其与IR启动子的结合，重要的是要询问这种相互作用的任何扰动是否会对体内IR启动子功能产生负面影响。为此，在HepG2细胞中测量C2或E3 IR启动子元件驱动CAT基因表达的能力，其中HMGI-Y和Sp1的内源性水平通过反义方法特异性降低(三,36). 如图所示。​图4，4HMGI-Y反义表达质粒抑制了含C2载体（pCAT-C2）的活性，这是通过转染细胞中CAT活性的降低来判断的，并显著降低了Sp1与C2和E3探针的结合（数据未显示）。当Sp1反义cDNA单独使用或与HMGI-Y反义cNA联合使用时，也获得了类似的结果。随着HMGI-Y和Sp1基因的敲除，IR启动子活性没有进一步降低，这表明这两个因子在向基本转录机制传递激活信号方面进行了功能性合作。通过蛋白质印迹分析测量，CAT活性与HMGI-Y和Sp1蛋白表达水平相关，并且在用含有有义方向HMGI-Y cDNA或Sp1有义寡核苷酸的表达载体转染的细胞中不受抑制（图。​（图4）。4). 与这些发现一致，体内HMGI-Y-Sp1蛋白复合物的扰动对IR的细胞表面表达具有抑制作用，如减少¹²⁵I-胰岛素与暴露于HMGI-Y和/或Sp1反义cDNA的HepG2细胞的结合（图。​（图44).

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图4。

通过反义RNA抑制IR启动子活性，并对HMGI-Y和Sp1 DNA结合进行突变和化学干扰。用含有C2 IR启动子元件野生型或突变型（m）的CAT报告质粒（2μg）转染HepG2细胞，同时存在或不存在含有HMGI-Y cDNA的反义（as）或正义（s）定向或Sp1反义或正义寡核苷酸（2μm）的效应质粒（5μg）。对于化学干扰实验，将转染细胞与数量增加的distamycin A和/或WP631孵育，36小时后测量CAT活性。CAT活性表示为仅存在pCAT-C2载体时报告活性的百分比。开酒吧，模拟（无DNA）；实心条，pCAT基本（没有插入的矢量）。结果是三个单独转染的平均值±标准误差（SE）。使用等量的细胞蛋白提取物对HMGI-Y和Sp1抗体进行免疫印迹分析。右上角，特定¹²⁵I标记胰岛素与接受HMGI-Y和/或Sp1反义寡核苷酸治疗的HepG2细胞结合。结合率表示为每10个胰岛素结合总量的百分比⁷细胞。未经反义寡核苷酸处理的结合活性是指未经转染的对照细胞。模拟一下，没有DNA。结果为三个单独实验的平均值±SE。右下方，EMSA分析了远端霉素A和WP631对HMGI-Y和Sp1与C2探针结合的影响。在添加2 ng HMGI-Y或纯Sp1之前，用探针C2（室温下15分钟）预培养增加量的远端霉素A（0、1和10μM）或WP631（0、2.5和5μM）。C、 单独探测。

为了扩展这些研究，我们生成了在HMGI-Y和Sp1结合位点或两者都发生突变的C2和E3调节元件的CAT结构。如图所示。​图4，4C2元件中HMGI-Y或Sp1位点的突变（分别为pCAT-C2/HMGI-Ym或pCAT-C2/Sp1m）使HepG2细胞中CAT活性降低至天然（pCAT-C1）启动子的10%至15%。两个结合位点的突变（pCAT-C2/HMGI-Ym/Sp1m）导致CAT活性类似的～90%的降低，此外，HMGI-Y位点的突变大大降低了IR启动子的活性，即使Sp1结合位点是完整的，进一步表明HMGI-Y和Sp1之间存在重要的功能相互作用。pCAT-E3报告质粒也获得了类似的结果（数据未显示）。与这些发现一致，用去霉素A和/或双蒽环素WP631治疗转染HepG2细胞，发现它们分别选择性地阻断HMGI-Y和Sp1与DNA的结合(38,23)，以剂量依赖性的方式抑制IR启动子诱导的CAT活性，当这两种化学试剂用于HMGI-Y或纯Sp1的EMSA时，这种抑制与C2探针的DNA结合活性降低相关（图。​（图44).

HMGI-Y与C/EBPβ发生物理相互作用，并增强其与IR启动子的结合。

与正常肝脏相比，肝癌细胞系中C/EBPβ的水平通常降低(7). 因此，用3T3-L1细胞的核提取物进行了DNA蛋白和蛋白与HMGI-Y和C/EBPβ的相互作用研究，3T3-LI细胞分化为脂肪细胞后，C/EBP？蛋白水平早期升高(21). 为了观察HMGI-Y是否对C/EBPβ与IR启动子的结合有任何影响，我们使用一定量的早期分化3T3-L1脂肪细胞的核提取物，在含有越来越多纯HMGI-Y.的情况下进行EMSA。在这些条件下，C/EBP？与探针C2的结合逐渐增强（图。​（图5A）5A级)而C/EBPβ复合物的阻滞作用略有增加，这意味着HMGI-Y和C/EBP？同时结合同一探针上的相邻位点，这在使用抗HMGI-Y或抗C/EBP抗体的超移位分析中得到了证实。随着BSA含量的增加，C/EBPβ的结合没有改变，并且与探针C2m的结合没有变化，探针C2m在HMGI-Y结合位点处含有突变，这表明C/EBP？与IR启动子的结合可能取决于HMGI-Y与其DNA结合元件的相互作用，在这方面，与HMGI-Y和Sp1之间的相互作用所显示的行为几乎相同。用探针E3的野生型和突变型获得了类似的数据（数据未显示）。

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图5：。

HMGI-Y与C/EBPβ发生物理相互作用，并增强其与IR启动子的结合。（A） EMSA使用0.5μg 3T3-L1核提取物（NE），并在野生型（wt）或突变型（m）探针C2存在的情况下，增加纯HMGI-Y或BSA的量（车道2、6和11，0.25 ng；车道3、7和12，0.5 ng；车道4、8和13，1.0 ng；车道5、9、14和15，2.0 ng）。车道1和10，单独探测。使用针对HMGI-Y或C/EBPβ的抗体（Ab）进行3T3-L1 NE加纯HMGI-Y的超移分析（16和17道）。（B） HMGI-Y结构域与C/EBPβ相互作用的定位。³⁵S-C/EBPβ与含有归一化量野生型GST-HMGI和各种GST-HMGI突变衍生物的树脂孵育。特异性结合的蛋白质通过SDS-PAGE进行解析，并通过放射自显影进行可视化。（C） 通过使用抗C/EBPβ抗体（通道4、5、9、10、13和14）或抗Sp1抗体（通道16、17、19和21）对HMGI-Y、C/EBP？和Sp1进行免疫沉淀（IP），然后使用抗HMGI-Y抗体（通道1至5和15至17）、抗C/EB？抗体（通道6至10[重复相同转移后]进行免疫印迹或抗Sp1抗体（11至14、20和21道）。通道1和15，10 ng纯HMGI-Y；通道2和18，20 ng C/EBPβ（Δ198）抗原；车道3和12，3T3-L1 NE（30μg）；车道4、13、16、19和21，3T3-L1 NE（500μg）；车道11和20，10 ng纯Sp1。在通道1、2、3、11、12、15、18和20中，蛋白质直接应用于凝胶，而不与蛋白A珠结合或洗脱。为了证明免疫沉淀的特异性，抗C/EBPβ抗体单独用HMGI-Y（5通道，对照）或纯Sp1（14通道，控制）进行测试。仅用纯HMGI-Y（17道，对照）测试抗Sp1抗体免疫沉淀的特异性。

为了支持HMGI-Y和C/EBPβ在IR启动子处直接相互作用的假设，我们首先尝试确定这两个因子在溶液中是否相互结合。为此，使用GST融合HMGI和体外合成的下拉分析³⁵进行S标记C/EBPβ。如图所示。​图5B，5亿，C/EBPβ被野生型（1-107）GST-HMGI有效保留，但不只是GST。使用GST融合HMGI缺失突变体进行下拉分析，以绘制与C/EBPβ接触所需的HMGI-Y区域。如图所示。​图5B，5亿，缺失第三个基本重复序列的突变体1-74能够以高亲和力结合C/EBPβ。HMGI-C/EBPβ相互作用在进一步截短蛋白直至丢失中间碱性重复序列后显著降低，这与最近过度表达HMGI-Y和C/EBPβ的HEK-293细胞的结果非常相似(24). 携带第二个或第三个基本重复序列的HMGI衍生物（克隆65-107和54-74）都能保留C/EBPβ，而缺少AT钩的HMGI-突变体（克隆31-54和65-74）没有与C/EBP？结合的趋势。因此，这些数据表明C/EBPβ在体外与HMGI-Y发生物理性相互作用，并且这种相互作用所需的HMGI的最小区域是氨基酸54和74之间的区域，这一结果与上述HMGI-Y与Sp1相互作用的结果相同。

为了验证体外观察到的HMGI-Y和C/EBPβ之间的相互作用与体内的相互作用相似，我们使用固定在蛋白A珠上的C/EBP？抗体进行了共免疫沉淀研究。如图所示。​图5C，5摄氏度免疫沉淀早期分化3T3-L1细胞核提取物中的C/EBPβ，然后对HMGI-Y进行Western blot分析，发现一条独特的特异性条带，该条带迁移到与HMGI Y大小相对应的位置，观察到一条主带，其迁移位置与C/EBPβ的大小相对应。因此，这些发现表明，这两个因素在体内物理上相互作用。此外，当从3T3-L1核提取物中免疫沉淀C/EBPβ，然后对Sp1进行免疫印迹分析时，发现也可以检测到Sp1蛋白（图。​（图5C）。5摄氏度). 通过用3T3-L1细胞的核提取物和固定在蛋白A珠上的抗Sp1抗体进行共免疫沉淀实验，进一步证明了所有三种转录因子之间的相互作用。正如预期的那样，Sp1免疫沉淀，然后用特定抗体进行免疫印迹分析，可以识别三种蛋白质，包括Sp1、HMGI-Y和C/EBPβ（图。​（图5C）。5摄氏度). 因此，我们得出结论，在完整细胞的情况下，体内存在由HMGI-Y、C/EBPβ和Sp1组成的物理复合物。

C/EBPβ激活IR基因转录需要HMGI-Y，并被Sp1增强。

接下来，我们进行了实验，以观察HMGI-Y和C/EBPβ是否在转录水平上协同激活IR启动子。为了测试这种可能性，在没有或存在HMGI-Y反义表达质粒的情况下，将HepG2细胞与含有C2（pCAT-C2）或E3（pCAT-E3）IR启动子序列和C/EBPβ效应载体的CAT报告质粒瞬时共转染。如图所示。​图6A，6A级C/EBPβ在HepG2细胞中过度表达，显著增加C2和E3启动子元件的CAT活性。然而，在HMGI-Y反义表达质粒存在的情况下，CAT活性显著降低，这表明C/EBPβ对IR启动子的反式激活需要HMGI-Y。含有突变HMGI-Y结合元件的CAT报告构建体pCAT-C2/HMGI Ym和pCAT-E3/HMGI Ym也获得了类似的结果。即使存在内源性HMGI-Y和过度表达的C/EBPβ，使用这两种结构中的任何一种，也能有效阻止C/EBP？对IR启动子的反式激活。

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图6。

C/EBPβ对IR基因转录的功能意义。（A） 在没有或存在HMGI-Y反义（as）表达载体（5μg）的情况下，将指示的CAT报告载体（每个2μg）转染到HepG2细胞中，并带有C/EBPβ的效应质粒（5μg）。（B） 在没有或存在HMGI-Y（10μg）反义表达载体的情况下，将HepG2细胞与C/EBPβ和/或Sp1表达质粒（各5μg）一起转染为A组。在这两种情况下，数据代表三个单独实验的平均值±标准误差；值表示为诱导活性增加到高于仅用野生型或突变报告载体转染获得的CAT活性水平的因子，该报告载体被赋予任意值1。放射自显影图显示了每种情况下HMGI-Y、Sp1和C/EBPβ的蛋白印迹。

为了研究C/EBPβ和Sp1在IR启动子处是否存在功能协同性，在HepG2细胞中用pCAT-C2或pCAT-E3进行转染，同时诱导C/EBP？和Sp1的强制表达。如图所示。​图6B，6亿Sp1和C/EBPβ共同激活IR启动子，使其水平分别比单独使用pCAT-C2或pCAT-E3时高出20倍和55倍。这些增加高于单独观察到的两种蛋白质的反式激活水平的总和，这意味着Sp1和C/EBPβ协同作用以驱动IR基因转录。当Sp1和C/EBPβ表达质粒与pCAT-C2/Sp1m或pCAT-E3/Sp1m共转染时，含有突变的Sp1结合位点，C/EBP？诱导的CAT活性显著受损，表明C/EBP对IR启动子的转录刺激依赖于相邻Sp1结合部位的完整性。在HMGI-Y反义表达质粒存在的情况下，Sp1和C/EBPβ共同诱导CAT活性几乎被消除，证实了HMGI-Y在这种情况下的核心重要性。

在体内和体外转录研究中，IR启动子的完全激活需要HMGI-Y、Sp1和C/EBPβ。

最后，我们询问HMGI-Y、Sp1和C/EBPβ之间的相互作用是否也可以证明在晚期MCF-7人类乳腺癌细胞中有功能性后遗症，该细胞系非常适合研究这些蛋白对转录的影响，因为它不表达HMGI-Y或Sp1的显著水平(18,32)，而C/EBPβ组成性表达(6). 如图所示。​图7A第7章B，HMGI-Y和Sp1在这些细胞中同时过度表达导致CAT活性显著增加，超过了单独使用任何一种因子时的水平，至少部分依赖于内源性C/EBPβ，正如C/EBP？诱饵策略所揭示的那样(28). 如图所示。​图7B，7亿，共转染顺式针对C/EBPβ结合位点的元件诱饵导致CAT活性降低75%，而突变的C/EBP？诱饵元件在体外不能结合C/EBP蛋白，转染无效。诱导CAT活性需要HMGI-Y和Sp1的完整结合位点，正如在其中一个或两个位点突变的结构体活性降低所证明的那样。野生型和突变型pCAT-E3报告质粒也获得了类似的结果（数据未显示）。

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图7。

HMGI-Y、Sp1和C/EBPβ对MCF-7细胞和免疫耗竭HMGI-Y和内源性Sp1基因激活剂的HeLa核提取物（NE）中IR基因转录的功能意义。（A） 用pCAT-C2报告载体（5μg）和增加量（1、5或10μg）的HMGI-Y和Sp1表达质粒单独或联合瞬时转染MCF-7细胞。（B） MCF-7细胞中的CAT活性被带有C/EBPβ结合序列的诱饵寡核苷酸降低，并通过转染携带HMGI-Y和/或Sp1突变结合元件的pCAT-C2报告基因结构而消除。在这两种情况下，数据代表三个单独实验的平均值±标准误差；这些值表示为诱导活性增加到高于仅用pCAT-C2控制载体转染获得的CAT活性水平的因子，该值被指定为任意值1。放射自显影图显示了每种情况下HMGI-Y和Sp1的免疫印迹。（C） HeLa NE与HMGI-Y和Sp1多克隆抗体的免疫印迹分析。未对提取物进行处理（NT），或使用固定化抗HMGI-Y和抗Sp1抗体或对照（无关兔血清免疫球蛋白G[IgG]）抗体进行一轮、两轮或三轮消耗。（D） 以IR-CAT DNA作为模板DNA，在30°C下孵育1小时，在没有或存在指示蛋白质的情况下，在免疫缺失提取物中转录IR基因（每个100 ng）。转录物通过CAT引物引物延伸鉴定，并在8%变性聚丙烯酰胺凝胶上解析。激活值1表示在没有激活剂的情况下转录的基础水平。显示了三种不同分析的代表性。（E） IR基因的转录与面板D中的相同，但Sp1或HMGI-Y的增加量（0、50和100 ng）分别在HMGI-Y或Sp1的固定量（100 ng）下使用。（F） 在没有或存在含有HMGI-Y、Sp1或C/EBPβ野生型（wt）或突变型（m）结合序列的寡核苷酸（每个10 ng）的情况下，在未经治疗的HeLa NE中测量IR基因转录。

该观察结果与使用HeLa核提取物进行的体外转录研究结果密切相关，HeLa细胞核提取物中HMGI-Y和内源性Sp1已通过免疫耗竭逐步去除（图。​（图7C）。7摄氏度). 再次，向这些提取物中添加少量HMGI-Y或纯Sp1只会微弱地刺激转录；然而，同时添加这两种激活剂导致转录显著增加（图。​（图7D）。7天). 这些结果在活化剂滴定实验中得到了证实，其中任一因素的量都在增加（图。​（图7E）第七版)并通过使用未经处理的HeLa核提取物在含有HMGI-Y、Sp1或C/EBPβ结合序列的合成寡核苷酸存在下的体外转录研究进一步支持（图。​（图7F第7页).

这项工作得到了Telethon-Italy拨款E.613的支持，部分资金来自MURST，protocollo 2002062899_002，Italy。

我们感谢K.-S.Chang、M.A.Lazar、G.Manfioletti、T.Maniatis、T.M.Penning、H.Rotheneder、G.Suske、D.Thanos、R.Tjian和E.Wintersberger提供试剂。特别感谢L.Levintow对手稿的批判性阅读。