酵母基因组中广泛的低亲和力转录相互作用

ChIP数据和PWM预测在宽动态范围内相互关联

通过比较TF亲和力与ChIP结合比率的基于序列的预测，我们可以测试ChIP检测到的低特异性结合是否为体内结合强度的可变性提供了定量指示，或者大体上是高特异性靶标的生物学情况的嘈杂指示。根据序列预测TF-DNA相互作用的常用方法是基于位置权重矩阵（PWM）(1989年Stormo和Hartzell III)，已知其为体外结合作用提供了合理的能量近似值(刘和克拉克2002). 根据我们的结果（见补充表2），PWM预测和ChIP结合率高度相关。分析首先使用的PWM来自Harbison等人（2004）只使用基因到hits中的定性分割生成研究和(P（P）<0.001）和非命中(P（P）> 0.001). 虽然没有使用定量信息来推断PWM，但即使仅限于具有ChIP的启动子集，ChIP与PWM的相关性也很强P（P）-值高于常见的0.001阈值，甚至更宽容的0.01阈值。图​图2A2安培事实上，没有阈值可以将基因分为两组，在这两组中，序列不能预测ChIP，并且通常阈值以上和以下的基因都存在相关性。例如，对于MBP1，即使对于具有ChIP结合的基因，也可以观察到ChIP值和序列之间的高度依赖性P（P）-值超过0.2，该值当前不被视为指示正在发生任何绑定。

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图2。

定量ChIP与序列相关。(A类)高于和低于a的ChIP和PWM相关性P（P）-值阈值。显示的是日志P（P）-ChIP结合比和PWM能量预测之间的Spearman相关性值(年-轴）。使用一系列可能的阈值(x个-轴），分别计算ChIP值低于阈值（红色）和高于阈值（黑色）的基因的相关性。在所有情况下，在这两组基因和所有阈值选择中都观察到显著的相关性。(B类)序列-ChIP相关性显示体内低特异性结合。所示为特定间隔内具有ChIP值的基因组PWM结合能的平均值和累积概率分布（CPD）。在所有情况下都观察到显著的单调性，并且预测了具有更高重要性的群的能量P（P）-值(左边)始终高于不显著组P（P）-值(正确的). 这种单调性适用于非常低的特异性范围，表明ChIP谱在广泛的动态特异性范围内具有信息性。

图3、B和C，进一步说明了广泛的ChIP-序列相关性。显示了PWM预测是如何随着ChIP值的降低而单调下降的，即使ChIP范围远低于高显著性水平。例如，Mbp1曲线的分布表明，PWM对ChIP基因的预测P（P）-0.3-0.5范围内的值显著高于ChIP基因的值P（P）-0.5–0.75范围内的值(P（P）< 10⁻¹⁰; KS试验）。

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图3。

Motif回归揭示了已知和新的结合位点。(A类)PREGO算法。PREGO算法用于将PWM模型拟合到原始ChIP-on-ChIP配置文件。该算法结合ChIP和序列数据，在整个亲和谱上建立具有最佳预测精度的PWM模型。(B类)PWM能量预测的稳健性。将PREGO算法独立应用于单个实验，证明了导出的能量模型的稳健性。这里显示的是两个Aft2实验之间的相关性(左边)，从中导出的两个PWM模型(中间的)以及这两个PWM的能量预测相关性。显著的再现性表明，可以定量使用PREGO衍生PWM。(C类)使用低亲和力启动子可以提高基序识别敏感性。图中显示了由PREGO算法从ChIP剖面推断出的PWM示例，其中模体查找方法无法找到模体。文献中的其他证据证实了所有病例。有关PWM分数的定义，请参见方法。“模型对_秒“表示使用两个不同阵列生成的PWM能量预测的Spearman相关性。“数据对_秒“表示用于构建两个PWM的两个原始ChIP配置文件的Spearman相关性。

使用定量ChIP曲线进行PWM回归

基于上述PWM预测和ChIP测量之间相关性大小的结果，开发了一种将PWM模型回归到整个ChIP结合曲线的算法。PREGO算法利用了全谱结合能中的信息，与现有的模体查找算法有很大不同，这些算法搜索区分“点击”和“非点击”的PWM模型。为了使用ChIP数据作为TF绑定能量的定量代理，对775份原始ChIP剖面进行了广泛的低水平分析（补充说明1）。消除了以前未考虑的重大实验偏差。这些主要包括与可变探针GC含量相关的影响（补充图1），但也包括低复杂度序列的系统影响[如聚（A/T）束]。PREGO算法内在地控制着这种影响：它报告了PWM模型，这些模型在缺乏核苷酸组成或低复杂性序列基序相关性的标准化轮廓下非常重要（方法）。整个算法管道（图。​（图3A；3A级; 补充图2）分别应用于单个阵列，以比较来自三次实验的原始数据的结果，并确保推断模型的质量（图。​（图3B3B公司).

PREGO算法应用于来自Harbison等人（2004）研究。在使用motif finding方法之前在这些数据中检测到的所有已知PWM也使用PREGO进行检测，在许多情况下，该算法检测到的PWM与文献证据相匹配，但之前在ChIP数据中无法检测到。图​图4C4摄氏度提供了几个示例来证明该方法的有效性（我的网站上有其他信息，网址：http://ukbar.rockefeller.edu/~atanay/prego公司).

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图4。

测试数字模型。(A类)规范化ChIP数据。PREGO对ChIP数据进行内部归一化，以消除结合比率与单核苷酸或二核苷酸组成或低复杂度序列[通常为聚（A）或聚（T）束]的任何相关性。图中显示了原始Mbp1-ChIP结合比与推断校正的散布和趋势，涉及几个二核苷酸和AAAA/TTTT基序的贡献。还显示了归一化和ChIP数据中使用的每个序列特征的Spearman相关性(正确的). (B、 C类)离散模型与模拟模型。如果TF-基因相互作用可以合理近似为发生或不发生（命中或未命中），那么ChIP和PWM预测的联合分布应反映出这两个理想基因组子集内的零协方差(左边). 如果ChIP和PWM提供了体内结合亲和力的定量估计，那么基因组的任何分割都无法消除它们的相关性(正确的). 因此，可以通过对数据拟合两种分布并分析其参数来测试数字假设的有效性。(天)ChIP序列相关性反映了一种模拟行为。对三个TF的ChIP/PWM联合分布的分析表明，由于两种分布的混合，无法解释它们的定量相关性（方法）。所示为推断出的命中（较暗）和未命中（较亮）的最大似然分布。混合系数（ρ）和相关系数(对)显示。分析表明，约五分之一的基因组受每个TF的影响，并且至少五分之一基因组的ChIP和基于序列的亲和力估计值以定量方式相关。

利用模体回归发现已知和新的PWM

Gat1是一种GATA因子，在调节氮分解代谢中具有已知功能(Kuruvilla等人，2001年). 该因子的已知结合基序（GATAAG）无法使用Harbison等人（2004）。仅使用对比分析成功检测到基序酵母菌属物种。将PREGO应用于三个原始Gat1-ChIP图谱（用雷帕霉素治疗后测量），并在所有病例中成功地恢复了已知的基序，无需使用额外数据，且具有良好的重复性(对_秒两个不同阵列的结合能预测值=0.99）。对雷帕霉素作用下的三个Dal82结合图谱的分析表明了PREGO的不同重要优势。已知Dal82参与DAL基因的调节，并与UIS相关_所有使用标准报告分析的元素(Dorrington and Cooper 1993年). 自UIS以来_所有元素相当长，Dal82精确的绑定首选项尚不详细。此前，将主题发现应用于62个Dal82 ChIP点击集，得到了GATAAG主题(Harbison等人，2004年). 然而，PREGO分析表明GATAAG与Dal82结合无关，提示AANNTGCG为功能基序。有趣的是，已知的UIS_所有序列中不包含GATA元件，但所有序列都包含AANNTGCG的拷贝，这表明GATAAG被识别为Dal82相关基序是GATA盒和UIS同时出现的结果_所有在DAL启动子中，并且可以使用本文报道的基序更准确地模拟Dal82结合偏好。因此，PREGO可以有效地控制共现伪影，这些伪影可能会使标准基序查找器的结果产生偏差。

通常在酵母数据集中，ChIP分析对特定TF产生的高特异性点击很少或没有。即使在这种情况下，PREGO也可以利用整个特异性范围来表征TF的结合偏好。众所周知，Opi1因子参与磷脂基因的调节。它的ChIP配置文件只产生了三个重要的点击，阻止了模体查找器检测到任何PWM。PREGO分析显示，在两个三倍体中存在CCGGTTCG基序，而在第三个三倍体中有一个更短的基序（GGTTC）。该基序类似于先前确定的Opi1-bound元件（反向补语TCGAAyC）。Xbp1是一种已知的压力调节器，可能在细胞周期和细胞大小的调节中发挥作用(Mai and Breeden 1997年;Miled等人，2001年). 尽管在轻度H₂哦₂在治疗之前，即使使用比较基因组学，也无法在它们中发现基序。PREGO算法能够将模体CTCGAG与三个可用Xbp1配置文件中的每一个都紧密关联，从而证实了之前关于Xbp1结合共识GC的报告CTCGAR公司GMGR公司(Mai and Breeden 1997年). 有趣的是，在之前的工作中(Tanay等人，2004年a)，我们已经通过进化分析确定CTCGAG是一个可能的基序，但无法将其与TF关联。之前通过CIT2 UAS突变分析显示Rtg3因子结合GGTCAC基序_对(Jia等人，1997年). PREGO分析显示GTCAT基序与雷帕霉素和H下的Rtg3亲和力谱显著相关₂哦₂.图案GTCACG，更类似于UAS_对也与雷帕霉素谱有关，但比GTCAT弱。与之前的案例一样，模体发现算法未能在与Rtg3相关的52个基因集中找到任何丰富的重要模体。

量化低特异性TF–DNA结合量

使用整个ChIP值范围推断PWM在上文中已证明具有相当大的实用性。然而，低特异性ChIP值与序列之间的相关性性质尚不清楚。重要的是，这种相关性不太可能是由于对某些核苷酸、二核苷酸或任何其他低复杂度序列特征的系统偏见而导致的实验伪影，因为这些特征是通过PREGO算法标准化的（见图。​图4A4A级例如）。

低特异性靶点的ChIP序列相关性令人费解的一个可能原因可能是ChIP实验的不完善性。可以说，TF的目标本质上是“数字”的（命中或未命中），但由于实验噪声，随着ChIP值的降低，它们反映出观察到命中的概率较小，因此与（同样不完美的）基于序列的预测呈正相关。如果是这种情况（图。​（图4B），4B类)然后，将基因按点击和非点击进行一些（未知）划分将消除ChIP与序列的相关性：例如，如果我们能够准确地知道非点击集，我们应该观察到ChIP和其内部PWM预测之间的零相关性。基于这种直觉，我们可以通过将ChIP–PWM二维分布拟合为两种分布的混合物来估计ChIP数据中定量信息的范围：一种表示“命中”的典型ChIP和PWM值，另一种表示这些“非命中”（方法）。然后，我们可以测试这些分布的相对权重（指示有多少基因可以归类为“hits”）和分布的协方差（指示数据中存在多少定量信息）。

图​图4D4D（四维）显示了三个TF的这种分析结果，清楚地表明数据是惊人的非“数字”数据-使用两个协方差为零的分布来解释ChIP和PWM的相关性是不可能的，事实上，在这三种情况中的每一种情况下，约20%的启动子被推断与TF相互作用，并且观察到高度显著的ChIP–序列相关性。因此，与非常弱的位点结合的频率可能足以在ChIP实验中进行检测。个体的低亲和力启动子不能被确定为确定的TF靶点，因为结合在体内发生的概率很高，但我们仍然可以从序列中大致预测这种结合的水平。

即使缺乏强结合位点，结合能也在进化上保持不变

启动子序列和低亲和力ChIP值之间的显著相关性，以及回归方法在检测以前在ChIP数据中无法检测到的PWM模型方面的成功，表明（1）TF与低亲和力结合位点的概率或瞬时结合经常发生，在ChIP实验中可以量化，并且（2）这种结合的大小由启动子序列决定（因此可由PWM预测）。测试这些丰富而微弱的TF-基因相互作用是否具有功能相关性的一种方法是评估它们的进化保守性水平。比较基因组学被广泛用于将TF结合位点表征为保守位点(Cliften等人，2003年;Kellis等人，2003年)提出了几个模型来描述影响它们的选择压力(Moses等人，2003年;Tanay等人，2004年a). 如果TF与低亲和力启动子的结合在功能上很重要，那么我们可以观察到选择不仅在单个结合位点上起作用，而且在每个启动子与TF的总亲和力上也起作用。在进化过程中，受TF弱调控的基因可能会被推到保持这种状态，但压力不会集中在一个特定的位点上，而是分散在整个启动子上，在许多可能的弱位点上选择综合结合能。为了测试这种选择是否存在，我使用了同源酵母启动子，并制定了一个保守性评分，将预测的启动子总结合能中观察到的进化变化与中性模型中预期的进化变化进行比较（方法）。因此，该分析测试了TF和整个启动子的积分相互作用能是否比偶然预期的更保守。对具有类似启动子的组进行了保守性分析酿酒酵母结合能，可以表征亲和力和守恒之间的关系。分析如图所示​图55表明能量守恒超越了结合位点的守恒。

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图5。

预测结合能的进化守恒。绘制了低基因的保守性得分(左边)到高(正确的)TF-结合能。(x个-轴）酿酒酵母结合能百分位数。(年-轴）保护得分（方法）。在所有情况下，高亲和力启动子的结合能都是保守的。对于一些TF，在基因组的很大一部分（10%-20%）上观察到保守，这反映了对缺乏高亲和力结合位点的启动子的结合能的广泛选择。

根据结果，在大量启动子中可以检测到能量守恒，大大超过了预测具有显著结合位点的前几个亲和力百分位数。例如，据估计，Gcn4和Cbf1大约影响基因组的10%（Gcn4可能影响更弱，额外影响10%）。预测其他TF的能量守恒可能更广泛。Mbp1和Ume6的保守性峰值位于前5%，但在亲和谱的一半上仍然显著。Mbp1结合细胞周期盒ACGCGT（带有附加因子）(Simon等人，2001年). 它在调节细胞周期中的作用可能取决于结合相互作用的精确定量性质，因此增加了选择压力。对于减数分裂的关键调节因子Ume6(Strich等人，1994年)此外，结合能的广泛守恒可能与该因子在广泛存在的基于Rpd3–Sin3的染色质修饰中的作用有关(卡多什和斯特鲁尔1997).

图形分析​图55基于许多简化假设（例如，求和PWM概率以估计结合能，模拟中性模型，忽略TF之间的组合相互作用）。仍然有证据表明，观察到的弱相互作用能量守恒反映了真正的选择。仿真中使用的中性模型基于所分析的精确区域的进化动力学，建模与环境相关的突变，并使用直接从数据中估计的参数（方法）。因此，观察到的保守性不太可能是GC含量保守性或其他简单背景效应的结果。分析几种酵母菌的序列时也得到了类似的结果（参见支持网站，http://uqbar.rockefeller.edu/~atanay/prego公司，了解详细信息）。作为额外的对照，对活性较低的启动子部分（−600到−350）和通常活性较高的启动子的部分（−350到−100）重复进行保守性分析。事实上，在不太活跃的范围内，观察到的序列结合能守恒性要少得多（参见支持网站，http://uqbar.rockefeller.edu/~atanay/prego公司). 应该注意的是，在某些情况下，在分析一种TF的弱结合能时观察到的守恒可能是另一种TF的最佳结合位点选择的副产品。由于观察到的守恒常偏向于亲和力的上百分位，这种间接影响可能主要适用于结合非常相似PWM的TF。对弱结合能的选择压力广度的惊人估计的另一个支持来自对基因表达的分析（见下文）。

ChIP归一化

作为PREGO预处理的一部分，对所有ChIP剖面进行了归一化（补充图2）。归一化确保单核苷酸和二核苷酸探针频率以及长度大于5的Poly-X或Poly-XY形式的序列与归一化ChIP谱无关。

测试定量ChIP–序列相关性

将每个TF的ChIP数据和PWM预测结合起来，生成二维联合分布。使用EM算法检测给定数据的两个二正态分布的最大似然混合。混合模型通过两个分布的均值和协方差矩阵（一个表示“命中”，另一个表示非命中）以及确定两个分布相对权重的混合系数进行参数化。EM是从多个起点进行的，具有完美的收敛一致性，表明发现了全局最优。在假设两个分布的协方差均为零（如数字假设所示）的模型上执行EM会产生显著较低的可能性。此外，从这种零方差模型重新估计后验分布在所有情况下都产生了显著的协方差，再次确认了ChIP和序列之间的相关性确实是定量的，无法用数字现象的噪声近似值来解释。

预测结合能

一个PWMP（P）长度的我正在定义概率分布我-通过设置Pr的mer序列(秒₁. . .秒_我)至∏_我第页(i、 秒_我). 给定启动子序列秒，我们将PWM预测结合能定义为秒作为E类(P、 秒) = ∑_j个Π_我第页(i、 秒_我+j个)（总结所有可能职位的贡献）。除非另有说明，否则本研究的结果是使用启动子位置−600到0得出的。

能量回归算法

给定芯片配置文件R（右）_克，指定每个启动子的结合比率克∈G公司，和一组启动子序列秒_克，我们希望搜索PWM模型P（P）这样的话E类(P、 秒_克)最佳预测R（右）_克.使用Spearman相关性量化预测精度E类(P、 秒_克)和R（右）_克使用新开发的PREGO程序将PWM拟合到原始ChIP轮廓。PREGO算法由两个阶段组成。在第一阶段（类似于REDUCE算法[Bussemaker等人，2001年]，但使用非参数秩相关统计），PREGO筛选了大量组合基序（全部k个-只有一个缺口的mers，这里k个< 9). 对于每个组合基序，该算法快速逼近k个-启动子中mer的出现和ChIP结合率。该算法计算P（P）-基于相关系数的独立性假设值，并使用Bonferroni因子对其进行多重检验。每当它发现k个-mer与P（P）-值超过显著性阈值(P（P）<0.01），继续到第二阶段。在第二阶段，PREGO使用相关k个-mers启动PWM回归算法。PWM是非线性的，因此不可能进行精确的线性回归。相反，开发了一种有效的局部优化程序，使模型的相关性最大化。补充图1给出了算法伪码。

进化分析

研究中酵母启动子区域的中性进化模拟是使用考虑突变背景的模型进行的(Siepel和Haussler 2004年). 该模型用于模拟启动子序列，例如，S.mikatae公司给定直系同源序列酿酒酵母发起人。要模拟S.mikatae公司核苷酸位置我，该模型使用酿酒位置二核苷酸我− 1,我和模拟米卡塔核苷酸位置我− 1. 模型参数是通过计算多个比对中的二核苷酸比对来估计的严格的感觉发起人(Cliften等人，2003年). 表示对齐的数量酿酒-米卡塔二核苷酸ab和cdn个_{美国广播公司}然后定义Pr(d日|美国广播公司）=n个_{美国广播公司}/∑_x个(n个_{美国广播公司x个}). 测试PWM预测的结合亲和力的守恒性第页2500个同源基因S.mikatae公司已鉴定出至少含有400bp的启动子。然后将启动子分为20组，每组具有特定范围的PWM能量酿酒酵母（因此，每组由五个能量百分位数组成）。使用中性模型，然后生成10个模拟的全基因组直系启动子集合（10个足以获得具有统计意义的结果，因为使用了每组中的基因集合）。结合能在每个酿酒酵母启动子及其真随机性S.mikatae公司计算正交曲线，并收集20组中每一组的能量变化绝对值。使用Kolmogorov-Smirnov统计，比较了实际能量变化和随机能量变化的分布P（P）-计算值以拒绝每个垃圾箱中的中性假设。每组基因的保守性得分定义为−log₁₀(P（P）)，其中P（P）是KSP（P）-值。

我感谢R.Shamir、I.Gat Viks、M.Kupiec、D.Peer和E.Siggia对手稿的讨论和批判性阅读；三名匿名裁判征求意见；和罗斯柴尔德基金会提供支持。