孕酮增加生殖器疱疹感染的敏感性并降低免疫反应

动物感染。

小鼠通过腹腔注射麻醉剂（氯胺酮-噻嗪[0.75 ml:0.25 ml]）麻醉，用棉签在阴道内擦洗，放在背上，并在阴道内感染10μl野生型HSV-2株333或减毒株HSV-2、TK-HSV-2。在麻醉的影响下，将小鼠仰卧45分钟至1小时，以使接种物感染。

阴道涂片和灌洗收集。

将30μl磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）从阴道内外多次吸出，收集用于生殖周期分期和菌斑分析的阴道灌洗液。对于阴道涂片，将液体涂在玻片上，并通过光学显微镜进行检查，以确定如上所述的发情周期的阶段(21). 以下分类用于确定周期的阶段：发情期，>90%的角化上皮细胞；间期，>75%的多形核细胞；发情间期，50%上皮细胞，50%多形核细胞。对于菌斑分析，阴道清洗后用棉签涂抹器擦拭。清洗和涂抹器均与0.97 ml PBS混合，并在−70°C下冷冻。每个阴道冲洗上清液的稀释度为10⁻².

生殖道中的病毒复制和病理学。

每日监测HSV-2感染后的生殖器病理，并按5分制评分：0分，无感染；1、外阴道轻度发红；2、外阴道红肿；3、阴道及周围组织严重红肿，生殖器区脱发；4、生殖器溃疡，生殖器及周围组织严重红肿脱发；5、严重的生殖器溃疡延伸至周围组织。第4阶段后处死动物。

阴道冲洗液或组织匀浆通过菌斑测定法分析病毒滴度。Vero细胞在添加了10%胎牛血清（FCS；GIBCO，加拿大伯灵顿）、1%青霉素-链霉素和我-谷氨酰胺（GIBCO）。对于斑块分析，Vero细胞在24孔板中生长汇合。稀释样品，并将其添加到单层中，一式两份。感染的单层细胞在37°C下孵育1小时，每15分钟摇动一次以进行病毒吸收。感染的单层细胞上覆盖有添加了0.05%人类免疫血清球蛋白的α修饰Eagle's培养基（加拿大血液服务局）。在37°C下感染48小时。然后固定单层并用结晶紫染色，并在光学显微镜下计数病毒斑块。阳性对照组在每次检测中都使用以前滴度较高的HSV-2实验室库存（333株）。每毫升PFU的数量是通过每个样本的菌斑计数平均值并考虑稀释系数来计算的。

ELISA检测抗HSV-2 gB-IgG和IgA。

HSV-2 gB特异性抗体滴度通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测定，该试验是根据之前描述的方案修改的(2). 简言之，在4°C的PBS中用2.5μg重组gB蛋白（Chiron Inc.，Emeryville，Califor.）/ml在Maxisorp 96-well板（Invitrogen，Burlington，Ontario）上涂布过夜。在室温下用2%牛血清白蛋白封闭平板2小时，并加载100μl样品或对照品的两倍系列稀释液。在室温下孵育1至2小时。清洗平板，并与以下生物素化抗体之一反应1小时：山羊抗鼠IgG或山羊抗鼠-IgA，1:1000稀释（Pharmingen，Mississauga，Ontario，Canada）。用外维定过氧化物酶（1:2000稀释）和四甲基联苯胺制成平板。测定终点滴度，并将其表示为几何平均滴度±平均值标准误差。通过使用非免疫小鼠阴道灌洗液获得背景值。背景光密度值的两倍是确定正值的截止值。

鼻内接种gB。

用10μg重组gB的HSV-2（Chiron，Emeryville，CA）/小鼠加CpG寡核苷酸（ODN）（10μg/小鼠）以15μl的体积免疫小鼠，如前所述鼻内给药(1). 简单地说，将小鼠麻醉并倒置，使其鼻子向下，直到将滴在其外鼻孔上的溶液完全吸入。

孕酮剂量对生殖器HSV-2感染的易感性没有影响。

由于大多数研究使用长效孕激素制剂Depo使小鼠对生殖器HSV-2感染敏感，我们研究了P-sal是否也会使小鼠对类似或较小剂量的HSV-2敏感。三组小鼠皮下注射2、1或0.5 mg孕酮混悬液。通过阴道涂片监测这些动物的生殖周期性。4至6天后，当小鼠开始不规则地循环时，将小鼠分为发情期或中期，并接种10只⁵HSV-2菌株333的PFU。随访阴道病理6天，每天收集阴道冲洗液以监测病毒滴度。外部病理学评分显示，在所有三个剂量的孕酮治疗组中，在发情期接种的小鼠没有或仅有轻微的阴道病理学症状。另一方面，在感染后48小时内，所有剂量组在月经间期接种的小鼠开始出现阴道病变，到第6天时，所有小鼠的评分均为4或5分，必须处死。病毒滴度与病理学表现出良好的相关性（图。​（图2）。2). 在发情期接种的小鼠阴道冲洗液中，三组均未检测到病毒脱落。相反，在第2天，所有在间情期接种的小鼠在阴道冲洗液中都有病毒滴度，直到第6天被处死。这些结果表明，黄体酮治疗后，处于疾病期的小鼠易受生殖器HSV-2感染。尽管有黄体酮治疗，但开始骑行并处于发情期的小鼠对这种剂量的病毒攻击不敏感。此外，在这些研究中使用的所有剂量中，孕酮使处于疾病期的小鼠容易受到生殖器HSV-2感染，而激素剂量的增加并没有改变敏感性。

在单独的窗口中打开

图2。

黄体酮治疗后小鼠的病毒滴度。三组小鼠(n个=6）皮下注射孕酮剂量为2、1或0.5 mg/只小鼠。按照材料和方法中的描述，每天进行阴道涂片检查。小鼠阴道内接种10⁵HSV-2（333株）在发情期（）或间期（○）的PFU。每天收集阴道冲洗液，并按照材料和方法进行病毒斑块分析。对斑块进行计数，并将病毒滴度表示为PFU/ml。每组显示几何平均值。星号表示值>10⁸PFU，检测上限。虚线显示分析的检测下限。结果代表了三个具有类似结果的独立实验。

不同剂量病毒对Depo治疗后敏感性的影响。

为了研究Depo治疗如何影响生殖器HSV-2感染的易感性，在Depo治疗后，小鼠阴道内接种不同剂量的HSV-2菌株333。图​图3三显示了感染后3天从接种不同感染剂量的小鼠阴道冲洗液中收集的病毒滴度，从10^三到10⁵PFU。只有50%的小鼠接种了10^三PFU表现出明显的病毒脱落，这与病理学和生存率有关。百分之一的老鼠在10倍剂量下受到严重感染⁴和10⁵PFU，如感染后三天的病毒滴度所示。所有这些老鼠都死于感染。

在单独的窗口中打开

图3。

Depo治疗后小鼠的病毒滴度。三组小鼠(n个每组=5至6只小鼠）皮下注射Depo（2mg/只），5天后阴道内接种不同剂量的HSV-2（10^三到10⁵PFU）。每天收集阴道冲洗液，并按照材料和方法进行病毒斑块分析。对斑块进行计数，并将病毒滴度表示为PFU/ml。每个符号代表一种动物。实验重复了两次，结果相当。

孕酮启动后不同剂量病毒对敏感性的影响。

小鼠皮下注射P-sal（1 mg/小鼠）。五天后，根据P-sal处理小鼠的阴道涂片，将其分为间情期和发情期，并在阴道内接种HSV-2菌株333。三种不同的接种剂量（10⁵, 10⁶，或10⁷各组均使用PFU），并在感染后3天的阴道冲洗液中测量病毒滴度。结果如图所示。​图4。4在三种感染剂量下，用孕酮治疗并在月经间歇期接种的小鼠在三天内都有病毒脱落。最低感染剂量（10⁵PFU）从第1天到第2天，病毒的脱落增加了一个对数（图。​（图4A）。4A级). 所有这些老鼠最终都死于感染。黄体酮处理和动情期接种小鼠的病毒脱落动力学表明，小鼠感染具有剂量依赖性。接种10只小鼠后，没有一只小鼠在阴道冲洗液中有明显的病毒脱落⁵PFU。只有五分之二的小鼠在剂量为10时有明显的病毒滴度⁶PFU。然而，接种剂量为10⁷PFU，五分之四的小鼠在所有三天内都有显著的病毒脱落（图。​（图4B4B类).

在单独的窗口中打开

图4。

P-sal治疗后感染不同剂量HSV-2（333株）的小鼠的病毒滴度。（A） 用P-sal（1 mg/只）治疗小鼠，并在不同感染剂量的月经间期进行阴道内接种。（B） 用P-sal处理小鼠，并在发情期以不同的感染剂量进行阴道内接种。每天收集阴道冲洗液，并按照材料和方法进行病毒斑块分析。对斑块进行计数，病毒滴度表示为PFU/ml。每个符号代表一只动物(n个=每组5至6只小鼠）。显示的结果代表了两个单独的实验。

不同剂量病毒对正常小鼠生殖周期不同阶段敏感性的影响。

为了回答孕酮或Depo治疗是否改变了生殖器感染易感性的问题，我们检测了发情周期不同阶段小鼠对HSV-2的易感性。将处于周期发情期或中期的正常小鼠阴道内接种HSV-2（333株），并在感染后3天测定阴道冲洗液的病毒滴度。在发情期接种10只小鼠⁵, 10⁶、或10⁷PFU。HSV-2（333株）在阴道涂片中没有病毒脱落。即使在21天后，也没有观察到任何外部病理学迹象。接种10⁴和10⁵PFU在阴道冲洗液中没有病毒脱落（数据未显示）。然而，剂量为10⁶在阴道冲洗液中观察到PFU显著的病毒脱落，并伴有外部病理。结果如图所示。​图5。5这些结果表明，如果不使用任何孕酮治疗，小鼠在发情期不易感染HSV-2，并且在发情间期需要比使用Depo或孕酮治疗的小鼠更高的感染剂量。

在单独的窗口中打开

图5：。

正常、未经治疗的小鼠感染HSV-2后的病毒滴度。按照材料和方法中的描述，每天进行阴道涂片检查。小鼠阴道内接种10⁶HSV-2（333株）在发情期（○）或间歇期（）的PFU。每天收集阴道冲洗液，并按照材料和方法进行病毒斑块分析。对斑块进行计数，病毒滴度表示为PFU/ml。每个符号代表一只动物(n个=每组5至6只小鼠）。虚线显示分析的检测下限。结果代表了两个单独的实验。

激素治疗对TK-HSV-2免疫的影响以及随后对野生型病毒攻击的保护。

上述实验的数据清楚地表明，Depo和P-sal治疗增加了生殖器HSV-2的易感性。在之前的研究中，我们已经发现激素治疗也会影响免疫反应(19). 因此，研究了激素治疗对HSV-2疫苗接种效果的影响。P-sal处理的小鼠在5天后分为发情期或发情期，并用TK-HSV-2阴道内免疫。在Depo单次治疗15天后，用相同剂量的HSV-2免疫Depo治疗的小鼠。免疫后三周，所有三组均在发病期（即易感期）进行HSV-2 333株阴道内攻击。六分之四的Depo治疗小鼠未能表现出对挑战的保护作用（图。​（图6）。6). 激发后3-4天，在这些动物中观察到严重的病理和损伤，在10天内，必须处死六只动物中的四只。在发情间期或发情期免疫并在发情期激发的两组小鼠表现出完全的保护作用。两组患者在几天内都出现了一些病理变化，然后完全康复。虽然在发情间期免疫的小鼠需要9至10天才能恢复正常，但发情时免疫的小鼠恢复时间相对较快（6至8天）（图。​（图66).

在单独的窗口中打开

图6。

用TK-HSV-2免疫并用野生型HSV-2攻击的小鼠的病理学。一组小鼠皮下注射Depo（2mg/只），并用10⁵15天后TK-HSV-2的PFU。第二组小鼠皮下注射孕酮（1 mg/只）。检查阴道涂片，并根据周期阶段（间期或发情期）对小鼠进行分类，并用10⁵TK-HSV-2的PFU。所有三组的所有小鼠(n个=每组5至6只小鼠）在免疫后15天内用10只⁶HSV-2（333株）在发情间期的PFU。如材料和方法所述，对所有动物的病理学和存活率进行评分。实验重复了两次，结果相当。

这项工作得到了加拿大CIHR（K.L.R.和C.K.）和Bickell基金会（C.K。

我们感谢Jen Newton、Amy Patrick和Amy Gillgrass提供的技术帮助。我们还感谢丹尼斯·斯奈德和达里奥·迪卢卡对手稿的批判性阅读。