美国国家科学院院刊。1999年1月19日；96(2): 736–741.
视紫红质敲除小鼠的形态、生理和生化变化
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J.Lem（莱姆）
*新英格兰医疗中心，以及†马萨诸塞州波士顿塔夫茨大学医学院眼科和遗传学系，邮编02111；§马萨诸塞州眼耳鼻喉医院眼科，哈佛医学院，波士顿，马萨诸塞02114；¶新英格兰地区灵长类动物研究中心，哈佛医学院，马萨诸塞州Southboro，01772；和‖马萨诸塞州波士顿市波士顿大学医学院生理学系02118
N.V.克拉斯诺佩罗娃
*新英格兰医疗中心，以及†马萨诸塞州波士顿塔夫茨大学医学院眼科和遗传学系，邮编02111；§马萨诸塞州眼耳鼻喉医院眼科，哈佛医学院，波士顿，马萨诸塞02114；¶新英格兰地区灵长类动物研究中心，哈佛医学院，马萨诸塞州Southboro，01772；和‖马萨诸塞州波士顿市波士顿大学医学院生理学系02118
P.D.卡尔弗特
*新英格兰医疗中心，以及†塔夫茨大学医学院眼科和遗传学系，波士顿，马萨诸塞州02111；§马萨诸塞州眼耳鼻喉医院眼科，哈佛医学院，波士顿，马萨诸塞02114；¶新英格兰地区灵长类动物研究中心，哈佛医学院，马萨诸塞州Southboro，01772；和‖马萨诸塞州波士顿市波士顿大学医学院生理学系02118
B.科索沃
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D.A.卡梅隆
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尼科尔先生
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C.L.马基诺
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R.L.西德曼
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撰稿人：R.L.Sidman
摘要
视杆蛋白（视杆感光细胞的视觉色素蛋白）的突变约占所有遗传性人类视网膜变性的15%。然而，疾病过程背后的生理和分子事件还不清楚。解决这个问题的一种方法是研究表达含有特定突变的视蛋白基因的转基因小鼠。这种方法的一个警告是，即使正常视蛋白的过度表达也会导致感光细胞退化。为了克服这个问题，我们通过靶向基因破坏来减少或消除内源性视杆蛋白含量。缺乏两种视蛋白等位基因的小鼠的视网膜最初发育正常，但杆外段未能形成。出生后数月内，感光细胞完全退化。具有单一视紫红质基因拷贝的小鼠的视网膜发育正常，而视紫红质棒的外段大小正常，但含有正常补体的一半。视网膜中的感光细胞也会退化，但退化的时间要慢得多。生理生化实验表明，与野生型对照组相比，具有单一视蛋白基因的小鼠的视杆对光的敏感性降低约50%，具有加速闪光反应动力学，并且含有约50%的幻觉。
视杆感光细胞视蛋白基因的突变是已知遗传病因中遗传性视网膜变性的最大比例。人类基因中已鉴定出80多种突变(1). 在疾病早期，这些突变会导致视杆感光细胞死亡。其潜在机制尚不清楚。这个问题是通过在转基因小鼠中表达突变的视蛋白基因来解决的(2–8). 然而，这种方法导致视蛋白的过度表达，并且已经证明，转基因小鼠中正常视蛋白的过量表达会导致退化表型(8). 通过在缺乏一个或两个天然视蛋白基因的情况下表达突变视蛋白基因，我们应该能够将突变视蛋白的分子和生理效应与过表达引起的效应分离开来。为了实现这一目标，我们生产了转基因小鼠，其中一个或两个视蛋白基因拷贝被靶向基因破坏所破坏。在这里，我们探讨了视蛋白的一个或两个功能等位基因的缺失对视杆感光器的形成和生理学的影响。
材料和方法
杆Opsin基因的靶向破坏。
从129SV基因组克隆中制备了靶向结构（图。)通过使用正负选择策略。J1胚胎干细胞(9)用靶向结构进行电穿孔，并在G418和更昔洛韦中进行筛选。在79个克隆中，13个被鉴定为同源重组体生态RI消化。此外，通过以下方法验证了六种假定的重组体巴姆高消化率。
通过替换Xho公司基因组视蛋白与新霉素抵抗基因（PGK-Neo）的I位点，并在第二内含子中插入胸苷激酶基因（MC1-TK）。目标视蛋白基因中的密码子1-111被删除。使用图底部所示的两种限制性消减策略来鉴定所需的同源重组体。
视网膜蛋白含量评估。
所有动物均按照视觉和眼科研究协会提供的指南进行处理。收集在14h:10-h光照：暗循环下饲养的小鼠的视网膜，并在冰镇Hepes-buffered溶液（130 mM NaCl/2.6 mM KCl/2.4 mM MgCl）中收集视网膜2/1.2 mM氯化钙2/10mM Hepes/0.02mM EDTA、pH 7.4）。视网膜立即在液氮中冷冻，并在使用前储存在−70°C下。冷冻的视网膜在涡流混合器中解冻并均质，低渗缓冲液中含有10 mM Tris-HCl、2 mM DTT、2 mM-EDTA、1 mM苯甲脒、0.1 mM苯甲基磺酰基氟化物和15μg/ml抑肽酶、亮氨酸蛋白酶和胃蛋白酶抑制素（pH 7.4）。将同化物溶解在含有2%SDS的缓冲液中，并在10000×克。样品在−70°C下冷冻在小份中。每次实验都使用一份新的等分样品。在SDS/12.5%聚丙烯酰胺凝胶上运行视网膜总匀浆，以分析所有蛋白质，但磷酸二酯酶α亚基（PDEα）和磷酸二酯酶β亚基（PDEβ）除外，其中使用15%的低交联凝胶(10). 将视网膜当量稀释液（1/100至1/1000）加载到每条车道。将蛋白质转移到硝化纤维素膜上1–1.5小时，然后在室温下用5%脱脂奶粉、0.05%吐温20（J.T.Baker）、150 mM NaCl和100 mM Tris●HCl在pH 7.4下封闭1小时。用一级抗体探测转移膜，然后用辣根过氧化物酶偶联二级抗体探测。通过添加增强化学发光底物（Pierce）和暴露于MP膜（Amersham），可以观察到蛋白质带。用Stratagene鹰眼系统扫描曝光胶片上的蛋白质带，用Scanalytics（马萨诸塞州比勒里卡）定量带密度2根棍子软件。运行校准曲线以确定所用每个抗体的方法线性范围。使用的抗体是Ret-P1(11)和K61–171C(12)，视紫红质；转导蛋白α-亚基1A（Tα1A；加利福尼亚州帕萨迪纳加利福尼亚理工学院M.Simon赠送的礼物）；β636 (13)或βN1(14)，转导蛋白β亚基（Tβ); Pat、PDEα和PDEβ（加州大学洛杉矶分校R.Lee赠送）；Gertie B，phosducin(15)视紫红质激酶（北卡罗来纳州达勒姆杜克大学R.Lefkowitz赠送）；SCT-128，逮捕(16); 和P26，恢复素(17).
差分光度法。
老鼠整夜接受黑暗适应。在红外光下，在冰镇Hepes缓冲溶液中分离视网膜。每个视网膜在1.5毫升微离心管中的涡流混合器中进行均质化，其中含有100μl均质缓冲液（10 mM NaH2人事军官4/20 mM NaF/7.5 mM EDTA，pH 7.4）。在昏暗的红光下，将10μl每种匀浆转移到含有90μl 40 mM十六烷基三甲基氯化铵的新鲜试管中。在450 nm和750 nm之间进行吸收光谱测定。在强光照射2分钟后，拍摄第二个光谱，强光使所有视紫红质变白。通过使用40000 M的消光系数，根据500 nm处两个光谱之间的差异计算出每个视网膜中的视紫红质含量−1●厘米−1.
组织学。
将麻醉小鼠用0.1M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中新制备的2%多聚甲醛/2.5%戊二醛通过心脏灌注，用于光镜和电子显微镜。通过在12点钟的位置将一片眼睑组织贴在眼睛上来标记眼睛的方位。取出眼睛，在缓冲液中冲洗，并浸入2%四氧化锇中。在渗透后处理过程中，眼睛被一分为二，或小的小土豆被切除。按照标准程序将样本脱水并嵌入Epon（加利福尼亚州雷丁市Ted Pella）。切片厚1μm，用碱性甲苯胺蓝染色，用于光学显微镜。切割80nm厚的超薄切片，用柠檬酸铅和醋酸铀酰染色，并用JEOL 1200EX透射电子显微镜检查。
显微分光光度法。
将小鼠暗适应12–24小时，然后因颈椎脱位而死亡。在含有130 mM NaCl、5.4 mM KCl、0.8 mM MgSO的培养基中，在红外线照射下采集视网膜4，1.0 mM氯化钙2，1.0 mM钠2高性能操作4，0.1 mM NaHCO三，5.0 mM葡萄糖，10.0 mM Hepes，0.1 mg/ml BSA，0.5 ml/100 ml MEM维生素（100×，Sigma），1.0 ml/100 ml MEM氨基酸（50×，Simma），pH 7.4(18,19). 用微刀轻轻切开视网膜碎片，从中分离出视网膜棒，并将其悬浮在一个70μm厚的腔室中，该腔室由两个装满介质的玻璃盖玻片固定。房间由红外电视摄像机监控，摄像机的输出被记录在录像带上。
用计算机控制的光子计数显微分光光度计测定了单根棒的吸收光谱(20,21). 在隔离棒外段的平面上，探头光束聚焦到约1×3μm的尺寸。光以与光束长轴垂直的偏振平面线性偏振。在不到1s的时间内，在5-THz箱中完成了频率范围为400–800 THz（750–375 nm）的单次扫描。对于每个棒，平均三次这样的扫描。在每种频率下，OD被确定为OD=log10我0/我t吨，其中我0是在没有电池的情况下入射到光电倍增管上的光子数量，以及我t吨是光并排通过外段后入射到光电倍增管上的光子数。对于我t吨测量时，将聚焦在400 THz的探测光束完全放置在单个棒的外段区域内，从而使探测光束的长尺寸与外段的长轴平行。
在一些实验中，从大量棒材中收集测量数据，以确定色素吸收光谱的形状。OD光谱根据基线位移进行调整，用眼睛进行标准化，取平均值，并用频率相关的八阶视觉色素吸光度模板OD/OD进行拟合最大值=∑一n个[(F类−F类最大值)/F类最大值]n个，其中F类是频率，F类最大值是OD最大值时的频率，以及系数一0–一8分别为1.0、0.0330251、−69.2795、182.066、1970.61、−9017.22、−21954.1、129796和75226.6。该模板是根据11种-顺式-基于视网膜的视觉色素海蟾蜍（海蟾蜍）红棒，范围从0.83到1.16×F类最大值（E.F.MacNichol、G.J.Jones和M.C.Cornwall，个人通信）。找到后F类最大值，模板用于分析单个棒的结果，其中一0是拟合的自由参数。所有光谱均以波长而非频率表示。
单细胞吸引电极记录。
年龄在36-179天的转基因小鼠和年龄在37-62天的室友对照组在实验前隔夜进行暗适应。视网膜组织的制备和单个光感受器闪光反应的抽吸电极记录根据Sung的方法进行等。(5)除所有解剖均采用红外线照射外。简单地说，视网膜被分离到含氧Leibovitz的L-15培养基中，并保存在冰上直到使用。将一小块视网膜在含有DNase I，type IV（Sigma）的L-15中切碎，装入记录室。用碳酸氢盐缓冲培养基（141 mM Na）灌注组织+/3.6米公里+/2.4 mM镁2+/1.2 mM钙2+/121 mM氯−/20毫米HCO三−/10 mM葡萄糖/10 mM肝素/3 mM琥珀酸盐/0.5 mM我-谷氨酸/0.02 mM EDTA/1.0 ml/50 ml MEM氨基酸（50×GIBCO/BRL）/1.0 ml/100 ml基本中鹰维生素（100×GIBCO/BRL，pH 7.4）与95%O平衡2/5%一氧化碳2温度为36–38°C。将棒的外段拉入硅烷化玻璃吸移管中，该吸移管含有相同的介质，除了HCO三−被Cl取代−。在500 nm处用20毫秒的闪光刺激电极。用电流-电压转换器（Axopatch 200，Axon Instruments，Foster City，CA）记录光电流响应，以30 Hz（−3 dB，8极贝塞尔频率设备，Haverhill，MA）进行低通滤波，并以400 Hz在线数字化。未对低通滤波引入的16.9-ms延迟进行校正。一些记录也通过高斯分布卷积以14 Hz的频率进行数字滤波(igor专业版软件、WaveMetrics、俄勒冈州奥斯韦戈湖）。
结果
Opsin-Gene中断。
一个靶向结构，删除翻译起始位点上游15 bp和视杆蛋白基因的前111个密码子（图。)，用于生产同源重组胚胎干细胞克隆。为了产生嵌合小鼠，将三个独立的重组克隆注射到第3天的囊胚中。对嵌合创始人后代制备的DNA进行Southern blot分析表明，由一个胚胎干细胞克隆产生的两个嵌合小鼠产生了生殖系传播（图。A类). 野生型（+/+）、半合子（+/-）和纯合子（−/−）小鼠以预期的孟德尔比例产生，表明该基因敲除不是胚胎致死性的。
(A类)Southern印迹生态从嵌合体视紫红质敲除创始人的同窝动物中制备的RI消化DNA。+/+，−/−，和+/-分别指定野生型、纯合子和半合子小鼠。+/+小鼠表现出5.1kb的带，表明基因组视蛋白DNA小鼠表现出6.5kb的条带，表明目标基因。+/-小鼠同时表现出这两种特性。(B类)反转录-PCR。从30天大的+/-+或+/--小鼠的视网膜中制备的RNA被逆转录，并用杆状T特异性引物扩增α或视杆蛋白。引物对跨越一个内含子。尽管Tα在−/−视网膜中未检测到opsin mRNA。RNA和DNA的转基因PCR产物分别为370 bp和846 bp。RNA和DNA的Opsin-PCR产物分别为397 bp和513 bp。G代表扩增的基因组DNA。(C类)用视紫红质特异性Ret-P1抗体进行Western blot检测。在前三个车道（从左到右）装载等量的视网膜匀浆；在最右侧车道装载50倍以上的匀浆。
视紫红质在Opsin+/-小鼠中减少，而在Opsin−/-小鼠中无法检测到。
为了确定是否产生了无效的视蛋白等位基因，检测了视蛋白mRNA和蛋白质的水平。在4周龄−/−小鼠中，Northern blot分析和逆转录-PCR均未检测到视蛋白mRNA转录物（图。B类). 用免疫印迹扫描密度法和漂白差异分光光度法测定全视网膜匀浆中视蛋白的含量。在给定的西方分析中，−/−、+/−和+/+对照小鼠是年龄匹配的室友。我们研究了五组独立的动物，年龄从23天至55天不等。这一年龄段的结果相似；+/-小鼠的视紫红质水平约为+/+对照组的57%，在−/-视网膜中无法检测到（图。C类). 在4周、10周和24周时，来自三组不同窝友+/-和+/+动物的全视网膜匀浆的差异光谱证实+/-视网膜的视紫红质含量约为正常量的50%（图。A类).
(A类)视网膜提取物的不同光谱。+/-视网膜匀浆的视紫红质含量约为年龄匹配（4周）+/+视网膜的一半。(B类)+/+（开环）棒质量的归一化平均吸收光谱；n个=6）和+/-（闭合圆；n个=5）小鼠。将模板与+/+光谱进行拟合，得出吸收峰（λ最大值)约为505 nm。(C类)单棒的显微分光光度分析。每个棒的OD光谱除以棒外段的宽度（单位：μm）。圆圈表示30+/+杆（开放圆圈）和32+/-杆（闭合圆圈）的平均比吸光度值。这些行显示了中的模板B类，缩放以适应+/+和+/-结果。
在第4周、第10周和第24周，+/+和+/-杆外段的长度差异小于10%（见下文）。为了确定视紫红质的减少是由于外段数量的减少还是由于每个细胞中视紫红素浓度的降低引起的，用显微分光光度法对棒状物进行了检查。比密度[OD atλ最大值除以单个+/+棒的外径]为0.012±0.022μm−1（平均值±标准差，n个= 30; 图。C类)类似于其他脊椎动物的光感受器(22–24). 相反，+/-棒的比密度为0.006±0.012μm−1(n个= 32; 图。C类)，一个明显较低的值(P（P）< 0.03). +/+和+/-小鼠的外节段直径（即路径长度）相同；两者均为1.4±0.2μm。因此，+/-小鼠单杆内的视紫红质分子浓度约为正常值的50%。
+/+和+/-小鼠的大量重叠杆的吸收光谱相似，并且与单个11的存在一致-顺式-含λ的视网膜色素最大值505 nm。除视紫红质外，没有任何其他色素存在的迹象（图。B类).
视网膜形态学。
对15天、30天和90天龄的半合子和纯合子基因敲除小鼠以及年龄匹配的同卵对照鼠的视网膜形态进行了检查。除非另有说明，否则对每个年龄段的每种类型的两到三只动物进行分析。因为小鼠视网膜ONL由95%的杆状核和5%的锥状核组成，所以ONL的厚度提供了对存在杆状核数量的估计。15天−/−、+/−和+/+视网膜的ONL厚度在10–12行细胞核中具有可比性（图。A类). 然而，与野生型对照组相比，−/−视网膜中缺少感光细胞外段，+/-视网膜中的感光细胞短约50%。没有观察到眼睛结构的其他严重缺陷。
视网膜形态。光学显微镜显示15天大的视网膜(A类)，30日龄(B类)和90天(C类)动物(左侧，+/+窝鼠；居中，+/-窝鼠；赖特，−/−同窝小鼠）。INL，内核层；ONL，外核层；IS，内段；OS，外段；视网膜色素上皮。（巴=20μm）(D类)用光学显微镜所用的相同组织块制备电子显微照片。箭头表示异常取向的膜。箭头指向−/−视网膜的外段。（对于+/+和+/-，Bar=200 nm；对于−/−，Bar=1μm。）
到30天时，+/-和+/+视网膜的ONL达到最大厚度，+/-外节的长度几乎正常（图。B类). 在−/-小鼠视网膜中，深染固缩细胞的数量明显增加，ONL厚度减少一到两行。如早期观察到的那样，活塞杆外段缺失。内节远端有明显的深染色凝集。
在90天+/-视网膜中，ONL厚度减少了一到两行，外节段长度略有缩短（图。C类). 在−/−视网膜中，变性几乎完全。锥体细胞由ONL残留的大部分单个、碎片状的细胞核组成。在30天的−/−视网膜中观察到的显著冷凝不再存在。
虽然在电子显微镜水平上观察到了取向错误的外节膜，但来自30天+/-视网膜的视杆通常具有适当的取向和间距的圆盘膜（图。D类). −/−小鼠的视网膜显示出很少的外节，并且出现的外节大大缩短（图。D类).
单细胞记录。
在单细胞吸波电极记录中，闪光在+/+和+/-棒中引发了振幅相似的响应（表). 然而，+/-棒对微弱闪光的响应灵敏度降低（图。 B类和C类). 平均而言，69个光子的闪光●μm−2在500nm时，+/+棒的响应为最大响应的一半，而在+/-棒中，118个光子·μm−2是必需的。转基因和对照棒的外段长度和直径相似。因此，转基因杆的低灵敏度归因于细胞内视紫红质浓度降低导致的量子捕获减少，这与显微分光光度测定结果一致。
表1
| 基因型 | 敏感我0，光子●μm−2 | 弱闪光响应动力学
| 最大响应第页最大值，pA |
|---|
| t吨第页，毫秒 | t吨我，毫秒 |
|---|
| +/+ | 69 ± 40 (10) | 140 ± 20 (10) | 270 ± 70 (10) | 9 ± 3 (10) |
| +/− | 118 ± 50 (16) | 120 ± 10 (16) | 190±50（16） | 10 ± 2 (16) |
| 重要性 | P（P） < 0.02 | P（P） < 0.01 | P（P） < 0.006 |
+/+棒的平均响应(A类)和+/-杆(B类)强度不断增加的500纳米闪光。响应被归一化为最大响应振幅（+/+棒为18 pA，+/-棒为12 pA）。下面的痕迹是来自闪光监视器的信号。+/-棒中的光响应恢复更快。(C类)标准化响应幅度A类和B类相对于闪光强度绘制。线显示数据对饱和指数的拟合：第页/第页最大值= 1 −e（电子）−ki（基色），其中我是闪光强度，k个=ln（2/我0)、和我0是引起半最大响应的闪光强度。对于+/+杆，我0为30.6光子●μm−2; 对于+/-杆，我0是182个光子●μm−2.
光响应动力学也存在差异（图。 A类和B类; 表). 在欠饱和闪光时，+/-棒的响应达到峰值，并且比+/+控制组的响应恢复得更快。积分时间的缩短表明+/-杆响应的更快恢复，积分时间定义为响应积分除以响应振幅。−/-控制棒未能形成外段，因此未进行分析。
对其他光转导蛋白表达水平的次要影响。
光反应的加速恢复时间表明，+/-小鼠中除了视紫红质外，还有一个或多个光转导蛋白发生了变化。为了检验这种可能性，通过Western blot的扫描密度测定法对另外八种光转导蛋白的水平进行了量化。使用23至183天龄的同窝出生的−/−、+/−和+/+小鼠的全视网膜匀浆（图。A类). +/− 小鼠体内T的野生型水平α(n个=5），Tβ(n个=6），PDEα(n个=5），PBEβ(n个=5），视紫红质激酶(n个=5），制动(n个=6）和恢复(n个= 6). 相反，福斯杜辛(n个=4）相对于野生型水平显著增加≈50%（图。B类).
(A类)T水平α，T型β在−/-（开条）和+/-（灰条）小鼠中，PDEα、PDEβ、phosdosin（PDC）、视紫红质激酶（RK）、arrestin（ARR）和recoverin（REC）归一化为+/+值（平均值±SD）。(B类)用磷酸腺苷抗体探测来自30天和56天龄的+/+、+/−和−/−小鼠的等量视网膜匀浆的这种蛋白质印迹。
30至70天龄的−/-小鼠体内T水平α(n个=5），Tβ(n个=4），PDEα(n个=4），PDEβ(n个=4），视紫红质激酶(n个=2），制动(n个=2）和恢复(n个=2）显著降低。Phosducin（23-30天，n个=2）蛋白质接近野生型水平（图。B类). 在141天及以上的动物中，由于杆细胞完全退化，所有蛋白质都降至无法检测的水平。
讨论
已经产生了视杆蛋白基因无突变的小鼠。−/−小鼠的视网膜缺乏视杆蛋白mRNA和蛋白质。+/-棒中存在视紫红质，但浓度为正常浓度的一半。+/-棒对光的电响应特性发生了一些变化。对光的敏感性降低了两倍，与视紫红质密度降低一致。人类视紫红质无突变携带者的光敏感性降低可能有类似的原因(25). +/-棒的闪光反应比正常情况下的动力学更快，表明介导光反应恢复的蛋白质活性发生了变化。
通过光子吸收，视紫红质诱导GTP与与转导素结合的GDP交换，使其解离为Tα-GTP和Tβγ.T型α-GTP减轻PDE的抑制作用，PDE水解cGMP，导致质膜中阳离子通透性通道的关闭。在反应恢复过程中，视紫红质在被视紫红蛋白激酶磷酸化并随后与抑制素结合后关闭；T型α-GTP水解后，GTP活性被猝灭；cGMP水平恢复，质膜中的通道重新打开(26). 任何这些过程的加速都可能导致更快的响应恢复。
作为阐明介导光反应恢复变化的机制的第一步，测量了光转导蛋白的水平。T水平α，T型β在+/-小鼠中，PDEα、PDEβ、视紫红质激酶、arrestin和recoverin（一种调节视紫红素激酶活性的蛋白质）基本正常。磷幻觉升高了50%。体外，phosdosin结合Tβγ具有高亲和力，从而调节其结合T的可用性α(14,27–29). 然而，尚不清楚磷幻觉如何解释+/-小鼠的加速反应动力学。首先，杆状体外节的磷幻觉可能不会升高，因为缺乏外节的年轻−/−小鼠的磷幻感水平是正常的。其次，如果T完全淬火α取决于它与T的重聚βγ(30)那么，给定T的水平β在+/-小鼠中没有改变，磷幻觉与T的比率增加βγ可能会延迟而不是加速光响应恢复。需要进一步的研究来确定加速反应动力学的基础和升高磷幻觉的任何影响。
Opsin基因的破坏也影响杆状细胞的形态和发育。在第15天，−/−视网膜包含正常数量的带内节的杆核，但外节未能发育。到30天时，10–15%的棒核丢失，到90天时，超过90%的棒核消失。因此，视紫红质的完全缺乏对正常的杆外段发育和杆细胞生存能力有严重影响。汉弗莱斯等。(31)在不同的视紫红质敲除小鼠系中报告了类似的组织学变化。
视紫红质突变为空的果蝇表现出相应的组织学缺陷。脊椎动物杆外节的功能等价物，最初形成但未能成熟(32). 在我们的30天−/−小鼠中，在电镜水平上检测到一些显著缩短的外节。然而，这些可能是锥体外节，因为视网膜电图显示该年龄段的锥体功能正常（K.Reuther、J.Frederick和W.Baehr，个人交流）。我们在90天大的时候无法检测到任何外节，这意味着椎体内稳态也受到了影响。这一发现可以解释为什么汉弗莱斯等。(31)在7周龄的视紫红质敲除小鼠中观察到锥体视网膜电图反应降低，以及为什么一名患有常染色体隐性视网膜色素变性的人，由于视紫红质点等位基因的零突变而对白色闪烁光产生几乎无法辨别的锥体视网膜电描记反应(25).
在半合子杆状视蛋白敲除小鼠中，早期光感受器外段发育受阻。在第15天时，杆外段长度约为野生型的一半，但随着+/-小鼠的成熟，外段延伸至近似正常的长度。然而，在发生任何明显的视网膜变性之前，单个+/-杆外节的视紫红质含量减少了一半。年龄较大的+/-动物表现出非常缓慢的视网膜退化。到90天大的时候，一排或两排感光细胞核已经丢失，剩下的杆状体的外段长度略有减少。这些结果表明，杆状细胞存活所需的视紫红质的量有下限也有上限。下限必须接近正常水平的50%。
致谢
我们感谢R.Lee对磷幻觉T的抗体β、PDEα和PDEβ，P.Hargrave和C.Barnstable检测视紫红质抗体，M.Simon检测Tα抗体，R.Lefkowitz为视紫红质激酶抗体，W.C.Smith为阻遏素抗体，A.Dizhoor为恢复素抗体，J.Dausman、M.Applebury和M.C.Cornwall为有益的讨论。这项工作得到了美国国立卫生研究院EY1008（给J.L.）、EY11160（给D.A.C.）、EY06857（给P.D.C.）和EY06631（给R.L.S.）的支持，也得到了抗盲基金会（给J.L）、防盲研究（给J.L.和C.L.M.）、视觉对抗（给J.L.）、E.Mathilde Ziegler基金会（到C.L.M）、，马萨诸塞州狮子会（致C.L.M.和J.L.）和弥尔顿基金会（致C.L.M.）。
缩写
| 在线 | 外核层 |
| PDEα | 磷酸二酯酶α亚基 |
| PDEβ | 磷酸二酯酶β亚基 |
| T型α | 转导蛋白α亚基 |
| T型β | 转导蛋白β亚基 |
工具书类
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