临床投资杂志。2002年11月15日；110(10): 1493–1501.
用非特异性炎症刺激拯救CD8 T细胞介导的抗菌免疫
美国纽约州纽约市斯隆-凯特琳纪念研究所医学和免疫学系传染病服务
通信地址：Roman A.Tuma，美国纽约州纽约市约克大道1275号纪念斯隆-凯特琳研究所传染病服务处，邮编：10021。电话：（212）639-7809；传真：（212）717-3021；电子邮件：gro.ccksm@ramut公司. 收稿日期：2002年7月8日；2002年9月10日接受。
摘要
通过过继转移病原特异性T细胞重建保护性免疫在细胞免疫受损患者中已取得成功。然而，体外扩增CD8 CTL的体内有效性是可变的。例如，收养转移单核细胞增多性李斯特菌–如果T细胞输注后48小时内发生挑战性感染，特异性CD8 CTL只能提供保护性免疫。在这里，我们显示转移的CTL在淋巴腔中持续存在数周，但在转移后的第一周内，它们对细菌挑战的反应降低。虽然在感染前不到48小时转移的T细胞增殖，但在感染前7天转移的T细胞死亡。值得注意的是，在T细胞输注时用抗CD40抗体治疗小鼠，可重新编程转移T细胞，使其增殖，并在7天后细菌攻击时产生保护性免疫。我们的研究首次证明，CD40介导的刺激可以独立于并发抗原暴露影响CD8 T细胞活化。通过短暂的非特异性炎症刺激调节CD8 T细胞长期反应性的能力对过继免疫治疗具有重要意义。
介绍
过继性T细胞治疗可以恢复病因特异性免疫，有效治疗了骨髓移植受者的EB病毒相关恶性肿瘤，并预防了巨细胞病毒感染(1–三). 优化T细胞输注产生保护性免疫的持续时间仍然是一项重要挑战。对骨髓移植受者和艾滋病患者的研究以及动物模型的研究表明，功能性CD8 CTL的持续存在因CD4 T淋巴细胞的缺失而减少(4–6). 转移后提高CD8 CTL存活率的方法包括联合应用IL-2，用嵌合GM-CSF/IL-2受体转染CTL，以及共同转移病原特异性CD4 T细胞(7,8). 最近的研究表明，CD40结扎可用于增强CD8 T细胞对两种持久性病毒HIV和单纯疱疹病毒的反应(9–11).
CD40是TNF受体家族的成员，在多种细胞上表达，包括B和T淋巴细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和内皮细胞(12). CD40的配体CD154对CD40的刺激具有蛋白质免疫调节作用，包括上调B7.1/B7.2共刺激分子(13–15). 已经在病毒和细菌感染模型中研究了B7/CD28共刺激途径对CD8效应T细胞反应的诱导和维持的贡献，根据病原体的不同结果不同。CD8 CTL反应对CD40介导信号的相对依赖性可能反映了先天性炎症反应激活的差异(16–18).
单核细胞增多性李斯特菌是一种兼性细胞内细菌，可诱导强大的CD8 T细胞反应，介导小鼠的长期保护性免疫(19,20). 可能是因为这种细菌感染诱导了强烈的炎症反应，所以在初次感染期间启动CD8 T细胞并不依赖于CD40/CD154信号通路的激活(18,21). 然而，在没有CD28的情况下，CD8 T细胞反应降低，表明除CD40外的炎症机制促进B7/CD28共刺激(17).
收养转让单核细胞增生李斯特菌–特异性CD8 T细胞赋予幼稚受体小鼠保护性免疫(22,23). 值得注意的是，转移的CD8 T细胞迅速失去效力，一般发现T细胞输注1周后受到攻击的受体小鼠失去了保护性免疫力(24,25). 这种失去保护的机制仍不明确。在这项研究中，我们描述了过继转移的存活、激活和增殖的特征单核细胞增生李斯特菌–受体小鼠的特异性CTL。我们发现，在输注后的第一周内，转移的T细胞持续存在，但失去增殖和提供保护的能力。值得注意的是，CD40信号通路的非特异性激活可以显著提高转移的CD8 T细胞的反应性和保护能力。这些研究表明，通过非特异性炎症刺激调节T细胞室可以影响抗原特异性T淋巴细胞的抗菌能力。
方法
老鼠和细菌。
BALB/c小鼠取自美国缅因州巴尔港的杰克逊实验室。Thy1.1小鼠最初取自Charles Surh（美国加利福尼亚州拉霍亚市斯克里普斯研究所）。单核细胞增生李斯特菌菌株10403S（得自Daniel Portnoy，美国加州大学伯克利分校）和单核细胞增生李斯特菌LLO公司92系列突变株（李斯特菌溶血素92位酪氨酸突变为丝氨酸）(26)在脑心灌注肉汤中生长。
用单核细胞增生李斯特菌免疫小鼠并产生LLO特异性CD8 T细胞系。
静脉注射2×10免疫BALB/c Thy1.2小鼠三
单核细胞增生李斯特菌进入尾部外侧静脉。免疫后7-10天取出脾脏，通过铁丝网分离脾细胞，并用氯化铵溶解红细胞。脾细胞重新悬浮在RP10+中，由RPMI 1640（GIBCO BRL；美国马里兰州盖瑟斯堡生命技术公司）组成，辅以10%FCS，L（左）-谷氨酰胺、HEPES（pH 7.5）、β-巯基乙醇、青霉素（100 U/ml）、链霉素（100μg/ml）和庆大霉素（50μg/ml。我们孵化了40×10630×10存在下的应答脾细胞6在37°C下用10个肽脉冲照射同基因脾细胞1小时–9M LLO公司91-99肽。细胞系在添加0.5 ng/ml IL-2和4 ng/ml IL-7的10 ml RP10+培养基中培养（美国明尼苏达州明尼阿波利斯R&D Systems Inc.）。7天后，如上所述重新刺激应答者T细胞。第二次体外再刺激后1至2周，用PBS洗涤CD8 CTL，并以6×10的浓度重新悬浮6每250μl PBS注射到同基因小鼠的表位特异性CD8 CTL。
四聚体H2-Kd日–肽复合物。
如前所述产生用于表位特异性T细胞染色的MHC肽四聚体(27).
染色和流式细胞术分析。
来自T细胞培养的10万CD8 CTL或2×106将脾细胞加入96周板孔中。在4°C下用未结合的链霉亲和素（0.5 mg/ml；Molecular Probes Inc.，美国俄勒冈州尤金市）和Fc Block（BD PharMinen，美国加利福尼亚州圣地亚哥市）在FACS染色缓冲液（SB:PBS[pH7.45]0.5%BSA和0.02%叠氮化钠）中培养20分钟后，用FITC-结合的抗CD62L（BD-Pharminen）对细胞进行染色，藻红蛋白结合H2-Kd日LLO公司91-99四聚体（0.25–0.5 mg/ml）、哌替啶叶绿素蛋白结合抗Thy1.1（BD-PharMinen）和别藻蓝蛋白结合抗CD8α（BD-ParMinen）在4°C的SB中放置60分钟。细胞也被FITC-或藻红蛋白结合的抗CD25或抗CD44和FITC-结合的抗T细胞受体Vβ（抗-TCR Vβ）片段（TCR Vβ2、3、4、5、6、7、8.1、8.2、8.1–8.3、9、10、11、12、13、14、17）染色。随后，在SB中清洗细胞三次，然后用1%多聚甲醛/PBS（pH 7.4）固定。使用FACSCalibur或LSR流式细胞仪进行四色流式细胞术，并使用CellQuest软件（Becton Dickinson Immunocytometry Systems Mountain View，California，USA）分析数据。
细胞内细胞因子染色。
第二次体外刺激后1至2周，5×106每毫升RPMI+的CD8 CTL在37°C和5%CO下培养5小时2在涂有抗CD3单克隆抗体（10μg/ml）（BD-PharMinen）的24孔平底板中加入1μg/ml布雷费尔丁A（BD-Parminen）。通过在4°C下用Cytofix/Cytoperm（BD-PharMinen）培养20分钟来固定细胞。此后，用1×Perm/Wash缓冲液（BD-PharMinen）洗涤细胞两次，并用FITC-偶联抗IFN-γ、FITC-共轭抗TNF或FITC-结合IgG1等型对照物在4℃下染色30分钟。最后，用1×Perm/Wash缓冲液再次清洗细胞，并将其重新悬浮在FACS SB中进行流式细胞术分析。
CTL分析。
使用标准铬释放测定51如前所述，进行Cr标记的P815靶细胞(28). 对于肽滴定，在一系列不同的肽浓度下，以大约20:1的恒定效应物与目标物的比率测定特定溶解百分比。
羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰酯标记。
CD8 CTL用PBS清洗并在5×10的条件下重新悬浮7每毫升PBS中含有1μM羧基荧光素二醋酸酯琥珀酰亚胺酯（CFSE；Molecular Probes Inc.）。细胞悬浮液在37°C、5%CO下培养210分钟后，立即用冷RPMI 1640/10%FCS清洗，然后转移到小鼠体内。
小鼠感染单核细胞增生李斯特菌、脾脏采集和细菌定量。
转移6×10后30分钟、48小时或7天6LLO公司91-99–特异性Thy1.1 CD8 CTL，Thy1.2受体小鼠感染5×10三
单核细胞增生李斯特菌10403S或LLO92系列通过尾侧静脉注射。感染72小时后，将脾脏和肝脏切除，通过钢丝网将组织均匀化至含有0.05%Triton X-100的PBS中，评估这些器官中的活菌数。随后，将等分样品置于脑心灌注琼脂平板（Life Technologies Inc.）上，并在培养24-48小时后对CFU进行计数。
体内注射单抗。
从FGK-45杂交瘤中纯化抗CD40单克隆抗体，并在指定的时间点将100μg腹腔注射到受体小鼠。
结果
体外生成的表位特异性CD8 CTL株的特性。
为了表征过继转移CD8 T细胞授予保护性免疫的能力，我们生成了LLO91-99-通过体外肽刺激的特异性CD8 T细胞系。该表位诱导具有复杂TCR库的免疫显性T细胞反应(29). 先前的研究表明，激活状态可能会影响CD8 T细胞授予保护性免疫的能力(29,30). 因此，我们对LLO进行了表征91-99–特异性CD8 CTL系通过表面染色获得激活标记，并通过细胞溶解试验和细胞内细胞因子染色评估其效应器功能。我们还测定了体外刺激后他们的TCR Vβ谱。超过97%的表位特异性CD8 CTL表达低水平CD62L和高水平CD44和CD25（图a） ●●●●。用靶向肽滴定法进行的细胞毒性试验表明，特异性裂解程度高，肽敏感性与短期体外再刺激原发性和召回性LLO后的肽敏感性相当91-99–特异性T细胞(31)（图b） ●●●●。细胞内细胞因子染色显示，体外扩增的LLO的整个群体91-99–特定CD8 CTL产生TNF和IFN（图c） ●●●●。在两次体外再刺激后，T细胞系的Vβ谱保留了与LLO中相似的分布91-99–体内经历召回反应的特定T细胞(29)（图d） ●●●●。综上所述，这些结果表明体外扩增的CD8 CTL是具有广泛TCR储备的表位特异性效应T细胞群体。
体外-扩增LLO91-99–特异性CD8 CTL具有效应表型，并在肽脉冲APC第二次体外刺激后7-14天保留不同的TCR Vβ谱。(一)用单克隆抗体染色CD8α、CD62L、Thy1.1、CD44、CD25和H2-K的CD8 CTL株d日四聚体与LLO络合91-99左面板：活CD8和Thy1.1 T细胞上的点图门控。中间和右侧面板：活体CD8 T细胞上的点图。上象限中的数字表示CD8 T细胞总数的百分比。(b条)LLO特异性溶解度百分比91-99–存在不同浓度LLO的特定CD8 CTL线91-99肽的测定方法51使用P815（H2）进行Cr释放试验d日)目标细胞。(c（c）)体外刺激后，通过标准细胞内细胞因子染色评估CD8 CTL株产生的TNF和IFN-γ。(d日)用TCR Vβ特异性抗体对CD8 CTL细胞系进行TCR Vα表达染色。LLO的百分比91-99-用每种TCR抗体染色的特异性CD8 CTL显示出来。数据代表了两个独立的实验。
接下来，我们研究了将体外扩增的CD8 CTL转移到同基因受体小鼠体内后的回收率。CTL线路（Thy1.2）和接受者（Thy1.1）之间的Thy1差异使我们能够跟踪转移的细胞。6×106LLO公司91-99–提前2-3天传输的特定CTL，约2.5×104从受体脾脏中回收表位特异性CTL，占CD8 T细胞总数的0.3–0.4%。转移后七天，这些数字基本保持不变（图、a和b）。有趣的是，转移的CTL在初始受体内没有增殖，正如转移后72小时它们的高CFSE荧光所证明的那样（图c） ●●●●。虽然转移的T细胞保持CD62L低和CD44高，但与体外维持的T细胞系相比，其CD25表达水平确实降低（图d） ●●●●。
CD8 CTL维持效应器表型，在转移到原始、同基因受体后不会增殖。(一–d日)6×10转让后三天和七天6Thy1.1 CD8 CTL进入Thy1.2 BALB/c受体，对脾细胞进行CD8α、Thy1.1、CD44、CD25和LLO染色91-99氢-Kd日四聚体。(一)活CD8 T细胞上的点图是门控的，Thy1.1阳性细胞的百分比(年轴）和LLO91-99(x个轴）。(b条)Thy1.1和LLO染色阳性的细胞绝对数91-99转移后第3天和第7天；每个点代表一只单独的鼠标。(c（c）)LLO公司91-99–转移前用CFSE标记特异性CD8 CTL，以及CFSE的百分比+提示转移后3天的Thy1.1 CD8 T细胞。(d日)LLO的激活标记物表达91-99–转移72小时后测定特异性T细胞。Thy1.1的着色显示在x个轴，并用LLO染色91-99氢-Kd日CD62L、CD25和CD44的四聚体和年轴。活CD8 T细胞上的点图被选通。(一,c（c）、和d日)点图代表每组三到四只小鼠。
CTL系对单个显性表位具有特异性的保护性免疫。
接下来，我们评估了体外生成的CD8 CTL对原始同基因受体的保护能力。在这些研究中，我们注入了6×106LLO公司91-99–静脉注射特定CTL并激发受体单核细胞增生李斯特菌10403S 30分钟或48小时后。感染72小时后获得的肝脏和脾脏细菌计数表明，接受CTL的动物具有高度的保护性免疫力（图a） ●●●●。这种保护水平与免疫动物对再次感染的反应相当（结果未显示）。为了证实CD8 CTL介导的免疫的特异性，我们用LLO攻击受体小鼠92系列
单核细胞增生李斯特菌该突变株保留了毒力，但LLO91-99–特异性T细胞无法识别感染，因为LLO的关键锚定残基发生突变91-99.如预期，收件人为6×106LLO公司91-99–特异性CTL完全容易感染5000个LLO92系列
单核细胞增生李斯特菌（图b） ●●●●。
LLO公司91-99–特异性CD8 CTL对野生型具有高度的保护性免疫力单核细胞增生李斯特菌T细胞输注后30分钟或48小时（Lm）感染(一). T细胞受体没有受到LLO挑战的保护92系列
单核细胞增生李斯特菌CTL输注后30分钟，显示体内抗原特异性(b条). 每个器官的CFU显示在年对数刻度轴。指示了CTL转移和感染之间的时间间隔。对照组动物接受PBS，而实验组动物接受6×106LLO公司91-99–特定CD8 CTL*检测下限。数据是每组2到3只动物的平均值和SD，是两个独立实验的代表。
CD8 CTL所赋予的保护性免疫与它们的快速扩张相关。LLO的离体四聚体染色91-99–特异性CTL清楚地表明，在感染后3天，转移的CD8 CTL已经扩大，此时人群规模大约增加了2.7倍，约占CD8 T细胞总数的1%（图a） ●●●●。鉴于脾脏中转移的CTL回收率较低，我们想知道观察到的扩张是由于T细胞向脾脏中募集还是原位增殖。因此，将CTL系标记为CFSE，并在输注T细胞30分钟后感染受体。感染后三天，所有转移的CTL均为低CFSE，表明观察到的扩张是由T细胞增殖引起的（图b） ●●●●。就抗原特异性T细胞的绝对数量而言，虽然转移后30分钟的感染导致表位特异性T淋巴细胞的最大扩增，但输注CTL后48小时的感染导致显著较低的扩增（图c） ●●●●。在感染的早期，未发现宿主内源性CD8 T细胞群的扩张(27). 此外，感染LLO的动物中未发现CD8 CTL扩增92系列
单核细胞增生李斯特菌，再次确认转移CTL的体内特异性（图、a和c）。
转移的CTL所产生的保护性免疫与感染72小时后的扩张相关。(一)我们注射了6×106T细胞进入受体，随后感染野生型单核细胞增生李斯特菌或LLO92系列
单核细胞增生李斯特菌转移后30分钟或48小时。感染72小时后，对脾细胞进行CD8α、Thy1.1和LLO染色91-99氢-Kd日四聚体。活体CD8淋巴细胞上的点图是门控的。Thy1.1的着色显示在年轴，四聚体染色x个轴。点图表示每组4-6只动物。(b条)CD8 CTL用CFSE标记，并转移到感染或未感染的受体小鼠中。转移Thy1.1 CFSE荧光72小时后+、LLO91-99–测定特异性T细胞。(c（c）)由Thy1.1和H2-K测定的转移T细胞绝对数d日四聚体在各种条件下绘制。车道1，Lm92系列CTL转移后30分钟感染；第2车道，CTL转移后30分钟Lm感染；3巷，CTL转移48小时后Lm感染；第4泳道，CTL转移后7天Lm感染；第5通道，无Lm感染，CTL转移后第3天；第6通道，无Lm感染，CTL转移后第7天；第7泳道，CTL转移后7天Lm感染。5、6和7在输注CTL前2天和1天以及感染后12小时腹腔注射100μg抗CD40抗体。每个点代表一个单独的鼠标*,†条件*和之间转移的T细胞绝对数量的差异†达到统计显著性(P（P）<0.05（学生）t吨测试）。
以前的研究表明单核细胞增生李斯特菌当挑战性感染延迟超过24-48小时时，过继性转移的T细胞会丢失(24,25). 为了用我们的系统证实这一点，我们在LLO转移后将激发感染延迟了7天91-99–特定CTL。正如预期的那样，根据感染72小时后肝脏和脾脏的细菌计数评估，受试者没有受到保护（图a） ●●●●。然而，保护丧失不能用转移的T细胞的丧失来解释，因为转移后7天从受者身上回收的转移细胞的绝对数量与转移后2天和3天的数量相当（图a和c） ●●●●。缺乏保护性免疫的同时，针对感染的表位特异性CTL的数量急剧下降。体外LLO91-99感染72小时后，四聚体染色在受体的脾脏中未检测到任何CD8 CTL（图b） ●●●●。这些结果表明，在转移后的7天内，转移的CTL在体内出现了功能缺陷。
输注7天后，转移的CTL失去了保护性免疫力和扩张能力。抗CD40抗体（FGK45）治疗可防止保护性丧失。(一)收件人收到6×106LLO公司91-99–特定CTL并感染野生型单核细胞增生李斯特菌7天后。在感染72小时后，对肝脏和脾脏中的细菌进行计数。左面板：无FGK45；在CTL转移前2天和1天以及感染后12小时，对右侧面板100μg FGK45进行腹腔注射。对照组动物接受PBS(b条)左面板：LLO正向散射（FSC）91-99–在FGK45存在（灰度直方图）或不存在（黑线）的情况下转移后7天的特定CTL。右侧面板：每组2-3只小鼠的平均FSC强度。(c（c）)感染72小时后，对脾细胞进行CD8α、Thy1.1和LLO染色91-99氢-Kd日四聚体。右上象限显示CD8淋巴细胞总数的百分比。(d日)CTL转移和FGK45给药后两周，如一但在不感染受体的情况下，用LLO在体外重新刺激脾细胞91-99.存在不同浓度LLO的特异性溶解百分比91-99肽由标准品测定51铬释放测定，使用P815（H2d日)目标细胞。钻石，加上体内FGK45；正方形，不含体内FGK45。中的数据一是每组2到3只动物的平均值和SD，是两个独立实验的代表。点图位于c（c）代表五到六种动物。中的数据d日是两种动物的平均值和SD。
CD4 T细胞记忆不能恢复输注LLO的能力91-99–特异性CD8 CTL，在转移后7天扩大或授予保护性免疫力。(一)我们转移了6×106LLO公司91-99–特定CTL进入受体小鼠并感染野生型小鼠单核细胞增生李斯特菌7天后。感染前30分钟，50×106早于28天用LLO免疫BALB/c小鼠的脾细胞92系列
单核细胞增生李斯特菌注入CTL受体。感染后72小时，对脾脏和肝脏进行培养；细菌计数绘制在年轴。(b条)我们转移了6×106LLO公司91-99–感染LLO的受体小鼠的特异性CTL92系列
单核细胞增生李斯特菌提前28天以上。输注CTL七天后，受体感染了野生型单核细胞增生李斯特菌，72小时后，对脾细胞进行CD8α和Thy1.1染色，并用LLO染色91-99氢-Kd日四聚体。活CD8 T细胞上的点图被选通。Thy1.1的着色显示在年轴，四聚体染色显示在x个轴。右上象限中的数字表示CD8 T细胞总数的百分比。数据代表每组两只动物。
CD4记忆性T细胞不能维持CD8 CTL介导的保护性免疫。
我们实验室以前的工作表明，CD8 T细胞反应和记忆不需要CD4 T细胞帮助单核细胞增生李斯特菌感染(32). 然而，体外培养的LLO是可能的91-99–特定CTL可能需要单核细胞增生李斯特菌–特异性CD4 T细胞的反应性。为了解决这种可能性，我们注入了5×10三LLO公司91-99–将特异性T细胞导入受体小鼠。七天后，用LLO免疫的“记忆”小鼠的脾细胞92系列
单核细胞增生李斯特菌被转移到受者体内，30分钟后感染5×10三
单核细胞增生李斯特菌10403秒。所含“记忆”小鼠脾细胞单核细胞增生李斯特菌–特异性CD4 T细胞，但无LLO91-99–特异性T细胞，避免抗原提呈细胞（APC）表位特异性CD8 T细胞之间的竞争。图a表明免疫脾细胞的转移并不能恢复CD8 CTL系所赋予的保护作用。确定现有单核细胞增生李斯特菌–特异性免疫隔间可以挽救CTL扩张，LLO91-99–将特异性T细胞转移到之前用LLO免疫的小鼠中92系列
单核细胞增生李斯特菌。7天后这些小鼠的感染并未导致转移的CD8 CTL的扩张（图b） ●●●●。这些实验表明，CD4 T细胞的帮助并不能提供足够的刺激来维持反应性。
激活CD40可以恢复保护性免疫。
最近的一些研究表明，CD40-CD154连接可以增强效应T细胞对病原体的反应(9–11). 我们推断，CD40活化诱导的炎症刺激可能会增强转移的CTL对延迟感染的反应性。
在CTL转移前2天和1天，我们腹腔注射100μg激动性抗CD40抗体。小鼠感染了单核细胞增生李斯特菌T细胞输注后7天，他们接受了另一剂量的抗CD40。值得注意的是，转让了LLO91-99–特异性T细胞因感染而扩增（图c和c） ●●●●。值得注意的是，抗CD40抗体并没有改变感染前CTL的绝对数量（图c） ●●●●。此外，从接受抗CD40抗体的小鼠中提取的CTL在前向散射谱上与从未经治疗的小鼠中分离的CTL没有差异，这表明在缺乏特异性抗原的情况下，CD40信号不会导致T细胞爆破（图b） ●●●●。最重要的是，转移CTL株后48小时内，CTL株所赋予的保护性免疫被重新建立到激发感染动物的水平（图a） 。
为了确定抗CD40治疗是否能在无感染的情况下增强转移的T细胞的反应性，我们转移了CTL并按照上述方法给予抗CD40抗体。14天后，我们分离出CTL，并用抗原肽进行短期体外再刺激后进行细胞溶解试验。只有当动物接受了抗CD40抗体时，才会出现特异性溶解，再次证明体内CD40激活有能力维持转移的CD8 T细胞的反应性（图d） ●●●●。
我们随后确定了抗CD40抗体给药的时间是否影响转移的CD8 CTL的扩张和保护能力。当在CTL转移前2天和1天给予抗CD40抗体，并在延迟感染后12小时给予增强剂时，保护作用完全恢复（图). 另一方面，仅在感染前2天和1天或延迟感染后12小时服用抗CD40抗体并不能恢复转移的CTL传递保护性免疫的能力（图). 这些结果表明，T细胞输注时启动的CD40激活使转移的CD8 CTL保持功能状态。
抗CD40抗体给药的时间决定了CTL对体内感染反应的结果。将CTL注入受体小鼠并用单核细胞增生李斯特菌7天后。感染72小时后测定肝脏和脾脏的细菌计数。动物在指定的时间点接受抗CD40抗体或同种对照。实验动物接受6×106感染前7天的CTL（1-4通道）。对照组动物腹腔注射PBS（第5和第6栏）。数据代表每组三只动物。CTL转染前1天、2天和感染后12小时的1巷CD40单抗；通道2、CD40单抗在CTL转移前1天和2天；通道3，CD40单克隆抗体感染后12小时；通道4，在CTL转移前1天、2天和感染后12小时进行同型控制；第5道，在CTL转移前1天、2天和感染后12小时进行同型控制；CTL转移前1天和2天以及感染后12小时，CD40单克隆抗体第6通道。检测下限，50。
体内注射激动性CD40抗体可使转移的CTL株形成长期记忆群体。
CD40刺激促进记忆性T细胞从注入的CTL生成。在各种模型系统中的研究表明，CD40介导的刺激对于维持记忆性T细胞或生成次级效应性T细胞来说并不是必需的，相反，它可能在CD8 CTL扩增的死亡阶段发挥作用，并影响随后记忆群体的大小(33–35). 因此，我们推断，在CD40刺激增强的情况下，体外扩增的CD8-CTL对体内感染做出反应，可能会产生更大的记忆T细胞群。为了验证这一假设，在转移6×10的CD40抗体前2天和1天，向小鼠腹腔注射100μg抗CD40抗体6CTL。七天后，这些动物被感染了单核细胞增生李斯特菌当时，他们接受了另一剂量的抗CD40抗体。首次感染后21天，小鼠接受了反复的细菌挑战单核细胞增生李斯特菌令人惊讶的是，LLO的四聚体染色91-99–特异性CD8 T细胞在体内显示LLO的再膨胀91-99–T细胞输注产生的特异性CTL（图a） ●●●●。由于这些小鼠对第一代CTL产生了内源性免疫反应，因此无法轻易评估转移的CTL系所赋予的保护性免疫单核细胞增生李斯特菌感染。
体内CD40刺激促进记忆性T细胞与输注效应性T细胞的分化。(一)将CTL注入1天和2天前接受抗CD40抗体的受体小鼠。受试者在7天后被感染，并在感染12小时后再次服用抗CD40抗体。三周后，小鼠被重新注入10万只野生型单核细胞增生李斯特菌72小时后，对脾细胞进行CD8α、Thy1.1和CD62L染色，并用LLO染色91-99氢-Kd日四聚体。活CD8 T细胞上的点图被选通。Thy1.1显示在年轴，四聚体染色显示在x个轴。上象限中的数字表示CD8 T细胞总数的百分比。(b条)在CTL输注后30分钟，在未注射抗CD40抗体的情况下感染受体小鼠。3周后对这些受试者进行挑战，并按照一这些地块代表每组三只动物。
当受者在T细胞输注时未接受抗CD40抗体时，转移的CD8 T细胞不会再次膨胀为二次激发（图b） ●●●●。这些结果表明，体内CD40激活使分化的效应器CTL在感染后发展为记忆群体。
讨论
在本报告中，我们证明了单核细胞增生李斯特菌–特异性CD8 CTL在受体中持续存在，但失去增殖和授予保护性免疫的能力。因此，上述发现表明，过继性转移的T细胞只能暂时保护机体免受单核细胞增生李斯特菌不是由于抗原特异性T细胞的缺失，而是由于过继转移的T细胞丧失了有效应对感染的能力。我们证明，给予抗CD40抗体可以恢复转移的T细胞介导保护的能力，在反复细菌攻击时促进其增殖，并增强免疫记忆的发展。
CD40刺激的佐剂作用已在不同可溶性和细胞相关抗原的免疫环境中得到证实(13–15,36). 在这些研究中，体内抗原提呈和CD40刺激同时发生，支持了广泛接受的模型，即CD40介导的信号上调向T淋巴细胞提呈抗原的细胞上的协同刺激分子。然而，在我们的研究中，体内CD40刺激及其对转移的T细胞的影响发生在缺乏体内抗原呈递的情况下。虽然在输注CTL时有可能将少量抗原转移到受体小鼠体内，但由于一些原因，这似乎不太可能。首先，LLO的浓度91-99用于刺激的只有10个–9M、 刺激时从细胞中清除多余的肽。其次，用于CTL刺激的APC在刺激过程中受到照射并被破坏。第三，CTL培养物在输注给受体之前至少培养7天，为血清和细胞蛋白酶提供充足的时间来破坏残留的LLO91-99因此，体内CD40刺激刺激单核细胞增生李斯特菌–与特定MHC表位复合物无同源相互作用的特异性CD8 T细胞。这一结果表明，效应CD8 T细胞以抗原依赖的方式与周围细胞相互作用，接受改变其分化和记忆功能潜能的刺激。在没有同源抗原的情况下，T淋巴细胞和树突状细胞之间产生免疫突触，这与抗原依赖性的细胞间相互作用可能提供有意义的刺激来改变T细胞功能的观点是一致的(37,38).
由于CD40刺激并没有增加转移的数量单核细胞增生李斯特菌–在初次受体中特异性CD8 T细胞，体内存活率增加或输注CTL的增殖不太可能导致其提供保护的能力增强。更有可能的是，CTL在输注后被重新编程，从而优化其增殖能力，并在细菌挑战时发挥效应器功能。最近的几项研究表明CD8 T细胞含有调节其增殖和分化的内部程序(39–42). 抗CD40抗体可能直接连接转移的CD8 T细胞上的CD40。事实上，在体外扩增的CTL上可以检测到低水平的CD40受体表达，并且在转移到未经处理或抗CD40抗体处理的小鼠后没有变化（数据未显示）。最近在野生型和CD40缺乏小鼠中研究了CD8 T细胞上表达的CD40的作用。在野生型小鼠中，激动性CD40抗体给药导致对可溶性卵清蛋白反应的原始转基因CD8 T细胞完全激活。然而，这种效应在CD40受体中是间接的+/+CD8 T细胞转入CD40受体–/–小鼠对卵清蛋白免疫和CD40刺激无反应(43). 因此，CD40结扎更有可能重塑免疫室，通过上调MHC、共刺激分子和/或粘附分子等，为CTL扩张提供更合适的环境(44,45).
虽然直接细胞间接触可能介导CD40刺激在我们系统中的作用，但细胞因子如IL-2、IL-7和IL-15也可能有助于维持CD8-CTL反应性。Ostrowski等人在肽脉冲的树突状细胞共培养系统中研究了CD40连接对HIV-1感染者T细胞反应的影响。在没有CD4 T细胞的情况下，CD40激活可诱导IL-15，但不能诱导IL-2(9). 因此，CD40激活可能会将平衡转向促进CTL生存的细胞因子。葡萄球菌肠毒素A的T细胞反应小鼠模型显示CD40活化具有抗凋亡作用，导致CD4和CD8 T细胞扩增增强(46). 最后，CTL的扩增可能反映了由于CD40增强的趋化因子-趋化因子受体相互作用，T细胞向脾脏的转运增强(47). 区分这些不同机制需要进一步调查。
我们的发现支持CD40活化的治疗潜力(48–51)并将其潜在应用于过继转移的病原特异性CTL的抢救。特别是在严重的CD4 T细胞缺乏状态下，如HIV疾病，以及在骨髓移植患者中，用抗原特异性CD8 T细胞重建细胞免疫仍然是一项艰巨的挑战。体内CD40结扎可能是提高过继转移病原体和肿瘤特异性T细胞体内疗效的另一种方法。
致谢
这项工作得到了NIH向R.A.Tuma授予AI 51108-01，向E.G.Pamer授予AI 42135和AI 39031的支持。
脚注
参见第页开始的相关评注1415.
利益冲突：提交人声明，不存在利益冲突。
使用的非标准缩写：T细胞受体；抗原呈递细胞（APC）；羧基荧光素二乙酸丁二酰酯（CFSE）。
工具书类
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