Tor通路通过将营养感应与组蛋白乙酰化联系起来调节基因表达

染色质免疫沉淀和定量PCR。

含HA菌株MCY47的指数生长培养物_三表位标记的Esa1用100 nM雷帕霉素处理0、15、30和60分钟。将培养物调整为1%甲醛，并在室温下轻轻摇晃培养20分钟。将甘氨酸添加到150 mM的最终浓度，并持续培养5分钟。细胞收集在预冷的瓶子中，并用冰镇磷酸盐缓冲盐水清洗两次。染色质的制备基本上如前所述，并进行了以下修改，整个过程在4°C下进行(14,20). 将细胞重新悬浮在0.8 ml溶解缓冲液中（50 mM HEPES[pH7.5]、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1%Triton X-100、0.1%脱氧胆酸钠、25 mMβ-甘油磷酸、25 mM-NaF和蛋白酶抑制剂[1 mM苯甲基磺酰氟，1μg胃蛋白酶抑制素ml⁻¹，1 mM苯甲脒，1%抑肽酶]），添加等体积的0.5 mM直径玻璃珠，剧烈摇晃破坏细胞。如图所示，玻璃珠被丢弃(14)，细胞裂解物以200000×离心克用20分钟恢复交联染色质。将染色质重新悬浮在0.8 ml的裂解缓冲液中，进行超声处理，以产生平均大小为350 bp的片段（在装有微尖的Bradson声波仪中设置3时，6次10 s），并在10000×克持续15分钟。测定不同样品中的蛋白质浓度，并将1.8 mg与抗体孵育2小时。使用的抗体是圣克鲁斯生物技术公司的抗HA单克隆抗体F-7、抗Rap1（yC-19）、抗Abf1（yC-20）、抗Rpd3（yN-19和yC-19）以及抗K5、-K8、-K12和-K16-乙酰化组蛋白H4，染色质免疫沉淀等级，来自Upstate Biotechnology。通过添加30μl（珠体积）蛋白A-葡聚糖或蛋白G-葡聚糖回收免疫复合物。在旋转器上培养1 h后，用裂解缓冲液洗涤珠子两次，用含有0.5 M NaCl的裂解缓冲液冲洗两次，再用10 mM Tris-HCl（pH 8.0）-0.25 M LiCl-1 mM EDTA-0.5%NP-40-0.5%脱氧胆酸钠洗涤两次，并用Tris-EDTA（TE）洗涤一次。用1.5 ml的容量在旋转器上进行5分钟的所有清洗。通过在65°C下将珠子在100μl TE-1%十二烷基硫酸钠中孵育10分钟来洗脱免疫复合物。为了逆转交联，将样品在65°C下孵育过夜，并通过在37°C下用100μg蛋白酶K消化2小时来去除蛋白质。在用酚氯异戊醇萃取后，添加5μg糖原和1/10体积的5 M LiCl-50 mM Tris-HCl（pH 8.0），并在−20°C下乙醇沉淀DNA过夜。

如前所述，对每组引物和DNA进行线性范围内的定量PCR(20)进行了以下修改。用于免疫沉淀PCR的DNA数量为总样本的1/50至1/1000，用于输入的DNA数量是总样本的1/15000至1/10000。用含有1μM引物的15μl，125μM脱氧核苷三磷酸，0.1μCi[³²P] dCTP毫升⁻¹（比活性，3000 Ci mmol⁻¹)，0.37 U防爆-塔克聚合酶和5μl DNA模板。PCR扩增28至30个周期，包括94°C下30 s，55°C下30s，72°C下30min，最后72°C时5min。用于扩增较长的PCR产物（见图。​图4C），4摄氏度)PCR扩增35个周期，包括94°C下30 s，55°C下30s，72°C下2min，最后72°C时5min。用Storm 860荧光成像仪（分子动力学）对PCR产物（通常为275至300 bp）进行定量，并通过将免疫沉淀DNA获得的PCR产物数量除以总DNA（输入）获得的数量来计算启动子占用率。

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图4。

Rpd3-Sin3复合物是适应营养限制所必需的。（A） 等基因野生型（MLY41a）和转速3（JRY16a），正弦3（JRY17a），以及萨普30（JRY18a）突变株在YEPD中生长到早期指数期。通过离心收集培养物，清洗并在SD-N培养基中重新悬浮。如图所示，在0、15、60和120分钟时采集样品。用与左图所示基因杂交的放射性探针进行Northern杂交，制备并分析RNA。与行动1消息用作加载控件。（B） 等基因野生型（MLY41a），以及转速3（JRY16a），正弦3（JRY17a），以及萨普30（JRY18a）突变菌株在30°C的YEPD固体培养基上培养过夜，以实现融合生长。细胞被复型电镀到SD-N培养基上，培养12天，复型电镀回YEPD，生长24小时，并拍照。

饥饿测定。

氮饥饿培养基（SD-N）含有0.17%的不含氨基酸或硫酸铵的Bacto酵母氮基、2%的葡萄糖和0.2%的尿嘧啶。酵母菌株在30°C的酵母提取物-胃蛋白酶-葡萄糖（YEPD）平板上生长24小时，并将复制品镀到SD-N培养基上。在30°C下培养12天后，将细胞复型镀回YEPD，并在30℃下培养24小时，然后拍照。

Tor在不影响Rap1或Abf1结合的情况下调节RP基因启动子处Esa1的维持。

大多数RP基因启动子包含转录因子Rap1和Abf1的结合位点(21). 此外，已有证据表明Esa1被Rap1和Abf1招募到RP基因启动子中(37). 我们检测了雷帕霉素对Rap1和Abf1占据RP基因启动子的影响。Rap1和Abf1在RPL9A型和RPS11B型在雷帕霉素治疗过程中，启动子保持不变（图。​（图1A）。1安培). 相比之下，Rap1和Abf1在行动1启动子缺乏这些因子的结合位点（图。​（图1A）。1安培). 这些结果表明，Tor通路调节Esa1对RP基因启动子的占有，而不影响Rap1和Abf1与这些启动子的结合。类似地，先前的结果表明，氨基酸剥夺诱导RP基因启动子释放Esa1，但对Rap1或Abf1结合没有影响(37).

Tor通路参与调节蛋白质稳定性的研究以前已有报道。雷帕霉素处理导致色氨酸氨基酸通透酶Tat2和翻译起始因子eIF4G快速失稳(三,42). 然而，在我们的研究中，在雷帕霉素治疗的时间过程中，Esa1、Rap1和Abf1蛋白的稳态水平没有受到影响（图。​（图1C）。1摄氏度). 因此，RP基因启动子中Esa1和乙酰化组蛋白H4的丢失不能归因于蛋白质水平的降低。

Rpd3-Sin3复合物在没有Tor信号的情况下介导RP基因抑制。

组蛋白脱乙酰酶复合物对染色质的脱乙酰化与基因的阻遏有关（参考文献综述11,12、和28). Tor信号转导和Esa1依赖性乙酰化之间的联系促使我们研究组蛋白去乙酰化酶复合物在RP基因抑制中的作用。我们检测了一组缺乏Hda1、Hos1、Hos2、Hos3、Sir2或Rpd3组蛋白脱乙酰酶的等基因酵母菌株对雷帕霉素的敏感性。Rpd3-Sin3组蛋白脱乙酰化酶复合物（包括Sap30）的突变使雷帕霉素抗性明显增加（图。​（图2A），2年)而其他被测脱乙酰酶的突变没有影响（图。​（图2A2年和数据未显示）。为了支持这些结果，我们注意到，在大规模筛选酵母缺失联盟菌株系列中，最近发现，编码Sap30或Sin3-相关蛋白Sbt3的基因缺失导致雷帕霉素耐药(7).

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图2。

Rpd3独立于Tor信号或RP基因激活剂定位于RP基因。（A） 等基因野生型（S288C），以及软管1,软管2,软管3,hda1型,rpd3、，和萨普30突变菌株在含有100 ng雷帕霉素ml的YEPD（非药物）或YEPD上生长⁻¹。在30°C下孵育3天后，对平板进行拍照。（B） 将菌株MCY47的指数生长培养物用100 nM雷帕霉素处理0、15、30或60 min，并与甲醛交联。制备染色质并用Rpd3特异性抗体进行免疫沉淀。PCR是在总染色质（输入）或免疫沉淀DNA中用特异性引物进行的RPL9A型,RPS11B型、和行动1右侧显示的基因启动子。对照组使用蛋白G珠。所示结果代表了两个独立的实验。（C和D）如图所示的实验中，来自雷帕霉素干预细胞的Rpd3免疫沉淀DNA。​图2B2B型用特异性引物扩增RPL9A型（面板C）或RPL18B型（面板D）。PCR产物编码以下序列：RPL9A型，−398至−98（1），35至300（2），917至1154RPL18B型、−410至−151（1）和1216至1500（2）。作为对照，我们用模拟免疫沉淀（没有抗体，但有来自同一实验的珠）获得的DNA和不同的引物进行PCR。所得结果与图中所示的珠子控制结果非常相似。​图2B2B型.

Rpd3-Sin3组蛋白去乙酰化酶复合物以前没有与RP基因启动子调控相关。因此，我们检测了雷帕霉素存在下RP基因启动子上Rpd3的占有率。染色质免疫沉淀显示Rpd3特异性地占据RPL9A型和RPS11B型，并且这种占用不受雷帕霉素治疗的影响（图。​（图2B2B型和数据未显示）。我们发现Rpd3的占有率不仅限于RP基因启动子，而且Rpd3也存在于基因的编码区RPL9A型和18亿卢比基因（图。​（图2C2摄氏度和D）。更广泛的PCR分析排除了Rpd3的结合是一种伪影，这种伪影是与同样包含编码区的长片段免疫沉淀DNA中的启动子结合。该分析表明，Rpd3与RPL9A型和最远端的3′编码区（片段3），尽管没有检测到跨越这两个区域的PCR产物（图。​（图2C）。2摄氏度). 此外RPL18B型启动子缺乏Rap1和Abf1结合位点(37)表明Rpd3不是这些转录因子针对RP基因的靶点。这些数据与最近的一份报告相一致，该报告表明，Sin3复合体与染色质以非靶向方式构成关联(22).

通过Northern印迹和染色质免疫沉淀测试RP基因启动子处Rpd3占据的功能意义。中的突变零售价3,SIN3号机组，或SAP30系列基因导致雷帕霉素诱导的RP基因抑制缺陷（图。​（图3A）。3A级). 虽然这种效应是适度的（通过磷光成像测量为三到五倍），但在两种不同菌株背景（∑1278b和S288C）构建的一组突变体中具有高度的可重复性。重要的是，删除零售价3或SAP30系列基因也在很大程度上防止了野生型细胞中伴随雷帕霉素处理的RP基因启动子乙酰化组蛋白H4的损失（图。​（图3B）。3B公司). 总之，我们的数据表明，Rpd3-Sin3组蛋白去乙酰化酶复合物有助于在缺乏Tor信号的情况下抑制RP基因。

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图3。

Sin3-Rpd3复合物是雷帕霉素诱导的RP基因的适当抑制所必需的。（A） 等基因野生型（MLY41a），以及转速3（JRY16a），正弦3（JRY17a），以及萨普30（JRY18a）突变株生长到早期指数阶段，并用或不用200 ng雷帕霉素ml处理⁻¹如图所示，持续15、30和60分钟。用与左图所示基因杂交的放射性探针进行Northern杂交，制备并分析RNA。（B） 雷帕霉素治疗后，如图所示。​图3A，3A级，培养物与甲醛交联。制备染色质并用组蛋白H4超乙酰化特异性抗体进行免疫沉淀。PCR是在总染色质（输入）或免疫沉淀DNA中用特异性引物进行的RPL9A型发起人。所显示的结果代表了两个独立的实验。

我们感谢Kevin Struhl慷慨赠送质粒YIplac211 HA-Esa1。我们还感谢约瑟夫·海特曼、米格尔·阿雷瓦洛·罗德里格斯、罗宾·沃顿、约翰·麦库斯克和布莱恩·库伦对手稿的建议和批判性阅读。

这项工作得到了NCI（向M.E.C.）颁发的K22奖CA94925-01的支持。