提供活细胞分泌的特定肽(例如毒素、信息素、毒力因子和quorum-sensing肽)信息的检测可作为诊断辅助手段。例如,可以通过检测特征分泌肽来推断特定微生物的存在和身份,这也可以用于区分给定菌株的亚型。几位作者已经描述了MS用于基于蛋白质成分以及分泌肽和蛋白质的指纹质量来识别微生物(1)。最近,完整蛋白质的电喷雾电离-源转换串联质谱(MS/MS)已应用于来自蜡样芽孢杆菌T孢子(2),并使用单阶段MS和MS/MS相结合的方法鉴定脂肪细胞分泌的蛋白质(三)。由于这些方法依赖于从高度复杂的环境中通过单级质谱对完整肽离子的初始检测,因此可能很难检测出微量的分泌肽。除了动态范围和信号抑制效应的限制外,感兴趣的低电平信号往往会消失在“化学噪声”中(4——6)。一种广泛应用于复杂混合物中痕量化合物检测的方法涉及MS/MS(7)通过使用靶向化合物分析(参考文献综述。8)。在这里,我们提出了一种基于这些先前方法的方法,通过使用多级MS(MS2和MS三)用新型矩阵辅助激光解吸/电离(MALDI)-四极离子阱质谱仪分析粗上清液混合物(9)。在这一过程中,假设上清液中存在的分泌肽离子,但其含量不足以在常规单级质谱中观察到,将受到多级质谱的影响。高度特异的片段特征能够明确识别感兴趣的肽并区分背景信号。作为示例,我们演示了快速确定酿酒酵母自身诱导肽(AIP)的检测和结构表征金黄色葡萄球菌这在群体感应和细菌干扰中起着至关重要的作用。
单倍体酵母细胞分泌两种肽信息素之一,即交配因子一或α(10——12)。它们的表达由交配型基因座的等位基因控制(但不编码)材料一或材料α.材料一细胞分泌交配因子一,与表面的受体结合材料α细胞,以及材料α细胞分泌交配因子α,该因子与细胞表面的受体结合材料一细胞。交配因子的受体结合触发交配反应,即激活细胞融合所需的蛋白质(13——15)。关于特定交配因子存在的知识是单倍体菌株的一个指示,在设计遗传研究的交配实验时,这一信息至关重要。当前的交配型分析使用的方法是用测试菌株挑战相关菌株(16)或者用PCR进行分析(17)。这些分析需要隔夜培养(18)因此,速度相对较慢(16,19)。在这里,我们展示了一种快速确定酵母交配类型的方法。
凶猛的金黄色葡萄球菌是一种侵袭性病原体,几乎可以感染任何人体组织。它有可能引发多种人类疾病,包括食物中毒(20)、皮肤感染(21),心内膜炎(22)和中毒性休克综合征(23)。葡萄球菌肠毒素等分泌蛋白属于所谓的超抗原家族,具有触发过敏性皮炎各种症状中T细胞过度异常活化的能力(24)中毒性休克综合征(23)。细胞密度依赖性肽群体感应(25——28)控制这些毒素以及各种其他毒力因子和表面蛋白的分泌。这个农业土地储备轨迹金黄色葡萄球菌(和一般的葡萄球菌)编码成分agrB公司,D类,C类,A类、和核糖核酸III对于这样的肽群体感应系统(29)。推测AgrB处理前肽前体AgrD以形成成熟的自身诱导肽(AIP)(30)其特征是硫内酯结构,由半胱氨酸的巯基与C末端氨基酸的α-羧基缩合形成的五肽环组成。这些类似于落叶松的结构被称为自诱导肽,因为当它们与受体istidine激酶AgrC结合时,会刺激几种输出蛋白的基因表达以及自身的表达(30,31)。这个农业土地储备基因座高度可变,导致农业部,B类、和C类那个分类金黄色葡萄球菌变成四个不同的农业土地储备组(32)[和>20其他假定农业土地储备其他葡萄球菌属(33)]. 来自一组的AIP通常在金黄色葡萄球菌来自不同组的菌株和其他葡萄球菌菌株的上清液通常抑制金黄色葡萄球菌(34)。这种形式的细菌干扰(34,35)被认为与感染和定植有临床相关性。因此,一种快速可靠的方法来检测和区分不同的葡萄球菌菌株,根据这些菌株分泌的AIP,具有潜在的巨大诊断价值。
材料和方法
菌株、培养基和培养条件。
W303材质一,材料α、 和2N遗传背景:ade2-1 ura3-1 his3-11,15 trp1-1 leu2-3112 can1-100;YW046材料一和材料具有遗传背景的α:ura3Δ5 leu2-3112 his3 pra1-1 prb1-1 prc1-1 cps1-3均来自M.P.Rout(纽约洛克菲勒大学);BY4741材料一具有他的3Δ1列2Δ0米15Δ0 ura3Δ0(ResGen,Invitrogen);并与前两个菌株杂交。在YPD平板上生长的酵母菌株(1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%Bacto琼脂和2%d日-葡萄糖)。
金黄色葡萄球菌使用的菌株为:RN6734(I组AIP)、RN6607(II组AIP(36)。这个中间链球菌菌株RN9423由G.Lina(法国里昂Cedex的Médecine Laennec学院)提供。
含AIP上清液的制备。
金黄色葡萄球菌菌株在CYGP肉汤中生长(10 g/L酪蛋白酸/10 g/L酵母提取物/5 g/L葡萄糖/5.9 g/L氯化钠/60 mMβ-甘油磷酸;参考文献。37)在37°C下摇晃9小时,接种量≈1.5×1075毫升肉汤中每毫升细胞数。在4°C下通过离心去除细胞,并过滤上清液(0.22-μm过滤器,Gelman)。
合成肽。
本研究中使用的合成AIP已被描述(38,39)。Mfα和Mf一都是从Sigma购买的。
硕士。
MALDI-四极离子阱由Thermo Finnigan LCQ Deca XP(加州圣何塞)制成,如早期LCQ版本所述(9)。单级ms实验使用了较短的离子注入时间(通常为0.3–5.0 ms),以防止过量注入效应。MS和MS三通过使用经验优化的仪器特定参数(隔离宽度:2.0Da,归一化碰撞能量:酵母Mfs为30%,AIP为35%,活化Q:0.240,活化时间:300ms),在更长的注射周期(200~400ms)下进行实验。频谱采集时间从30秒到1分钟不等,以达到可接受的信噪比。
MS样品制备。
将针尖量的酵母菌落(1-3 mg上述菌株)转移到5μl 2,5-二羟基苯甲酸在60%甲醇/0.1%三氟乙酸中的半饱和溶液中。将样品旋涡化后,用台式离心机旋转细胞。将高达2.5μl的上清液转移到MALDI光盘(CD)-样本板上(9)并干燥。注:当仅筛选产生Mfα的细胞时,当细胞悬浮在缺乏有机溶剂的0.1%三氟乙酸中时,可获得更强的离子强度。在这种情况下,将样品沉积在CD上后,添加饱和的2,5-二羟基苯甲酸基质溶液。
将约0.5 ml葡萄球菌培养上清液冻干并重新悬浮在100μl的1%三氟乙酸中,向其中添加5μl疏水性Poros 20 R2珠悬浮液(PerSeptive Biosystems,Framingham,MA),其悬浮液的床体积为2%甲酸的10倍。使用1毫升一次性注射器和自制适配器片(从P200吸管尖端切下),将部分或全部样品喷入ZipTip微柱(Millipore),该微柱也用作多孔材料的熔块。用20μl 0.1%三氟乙酸清洗柱状材料,然后用2.5μl半饱和2,5-二羟基苯甲酸溶液(见上文)直接洗脱到MALDI光盘上。在MALDI光盘上简单地将合成肽点在1μl体积的1 nM溶液(或稀释系列)中,随后添加1μl基质溶液。
结果
酵母交配因子(Mfs)的假设驱动MS/MS分析。
图中左侧的光谱。显示了通过在MALDI基质溶液中放置少量三种细胞类型中的每一种而获得的提取物的部分MALDI质谱。质谱包含该区域米/z(z)1550–1750,我们希望在那里观察Mf肽。在任何情况下,我们都无法在这些单级质谱中观察到Mf肽,因此无法判断它们是否存在。事实上,光谱非常拥挤,背景上只有几个明显的肽离子峰。这些更强烈的肽离子虽然没有被识别,但并不是不同交配类型的特征,因为它们出现在所有三种光谱中。
假设驱动的多阶段MS筛选酵母交配因子。从三种不同的样品中获得的MALDI离子阱质谱酿酒酵母细胞类型:单倍体MATα,单倍体材料一和二倍体材料一/α(无交配型)。单级MS(左谱)未检测到MF。假设离子选择的MS/MS实验米/z(z)值(红色箭头)表示存在Mfs(红色复选标记)。噪音上方只有最强烈的碎片清晰可见(与图。其他碎片离子)。Mfα仅检测自材料α单元格(顶部,右频谱)。Mfa和变型Mf的特征片段a′只能通过以下方式获得材料一单元格(中部,双中心光谱),二倍体细胞未检测到Mfs(底部,蓝色十字)。除了广泛分布的噪声(与谱的较低质量范围相比,靠近母质量的噪声更强烈)外,一些离散峰被指定为伪影,即母质量-18和-136.6处的峰(用*标记)。这些信号归因于MALDI矩阵的离解簇(4)。纵坐标表示相对强度。
在假设驱动的MS/MS实验中,离子阱被设置为排出所有离子,除了那些与理论相符的离子米/z(z)Mfs的值。这样,假设存在的特定离子被分离出来,并进行MS/MS分析(图。)。图。显示了合成Mf的MS/MS分析一和Mfα,如预期的那样,片段化是每个肽的高度特征。具体来说,最强烈的离子对应于离子阱质谱仪中描述的单电荷离子的首选裂解,即Asp的C端侧和Pro残基的N端侧(40,41)。这些强烈的碎片离子信号定义了MS/MS特征,这些特征明确地识别了配对因子,并将其离子与相同质量的背景离子区分开来(图。)。因此MATα当母体离子在米/z(z)1683.9,计算米/z(z)Mfα(图。 顶部,右光谱),但当母体离子在米/z(z)1629.9或1643.9,计算米/z(z)Mf的s一(42)及其变体(43)百万英尺a′(图。 顶部,中心两个光谱)。同样,MS/MS样品材料一当母体离子在米/z(z)1629.9和1643.9,分别对应于Mf的计算质量一和Mfa′(参考。44; 图。 中部,双中心光谱)。与我们对单倍体细胞的观察相比,二倍体细胞没有获得交配因子的MS/MS片段特征(材料一/α、 图。 底部)。因此,通过简单地对三个假设存在的Mf进行MS/MS分析,我们可以快速确定感兴趣的群体中存在哪一个Mf。Mf的信号强度一和a′在可比水平上观察到,这可能反映了两个编码基因的同等表达水平,MFA1公司和MFA2型如报告所示(45)。类似地,也存在MFα1命名的基因MFα2,编码Mfα的两个拷贝,其中一个Mfα′随两个氨基酸残基(Q5N和K7R)变化(46)[注意:MFα1对Mfα的四个相同副本进行编码(47)]. 与类似的表达水平相比MFA1公司和MFA2型,的MFα2基因对信息素的产生没有显著影响(48)。因此,本方法未检测到Mfα′。
合成酵母Mf的MALDI-离子阱MS/MS谱一和Mfα。序列特异性MS/MS特征的分配由下面的碎片图指示[红色条表示离子(53)y离子的强度和蓝条(53)]. 合成变体Mfα′和Mfa′,不适用于本研究(见图。对于天然Mfa′).
假设驱动的n阶段MS(MSn个)葡萄球菌AIP分析。
尽管浓缩和淡化了金黄色葡萄球菌,通常不可能根据单级质谱确定是否存在AIP(图。 左上第I、II、III和IV段)。事实证明,有必要同时进行两阶段(MS/MS)和三阶段(MS)三)对合成AIP进行实验,以评估分析上清液中自然产生的AIP时应预期的最强烈碎片离子。例如,合成的I族AIP离子碎裂产生强烈的y6离子峰值米/z(z)711.5和强度较小的y5和y7离子峰值米/z(z)分别为610.6和798.5(图。我)。然而,只有强烈的y6在天然I类AIP上清液的MS/MS谱中,可以将离子与背景噪声区分开来。事实上,由于MS/MS光谱中存在残留背景,因此有必要进行三阶段MS实验(MS三)测试峰值是否在米/z(z)711.5从MS/MS实验中可以很有把握地归因于AIP-I。MS三对I组-AIP上清液样品的实验显示,与相应合成肽的裂解模式基本相同。一般来说,I、III和IV组AIP的MS/MS裂解导致片段离子保留完整肽的环状成分。因为从环中获得可观察到的碎片需要两次裂解,所以这些碎片离子首先在质谱中检测到三实验(图。).
假设驱动的MSn个第I组至第IV组AIP分析金黄色葡萄球菌培养上清液(天然)及与MS的比较n个合成AIP的光谱。仅指出了这些类落叶松肽最丰富的裂解途径。注意MS/MS和MS三第二组AIP的实验是在更丰富的钠离子(M+Na)上进行的+);所有其他光谱都是质子化离子及其片段的光谱。MS/MS光谱下面的米色背景尖端指向母离子。微软三亲本y离子的光谱标记为蓝色,而亲本b离子的光谱则标记为紫色。
对于II类AIP,观察到与该方案的偏差。该肽主要作为单钠化离子(M+Na)解吸+)而不是更常见的质子化形式(M+H+)(图。二,合成),即使样品是在低pH下制备的。在MS/MS实验中苯丙氨酸的损失表明环的分离(图。二,离子峰位于米/z(z)754.5),在分割质子化合成肽时未观察到(数据未显示)。在这种情况下,环中的极性丝氨酸残基似乎会螯合钠离子,从而改变碎片行为。当我们假设II族AIP的假设母离子质量被钠化时,我们观察到相同的MS/MS和MS三假定存在于培养上清液中的肽片段离子来自合成基团II AIP(图。二).
在所有这些例子中,只有最强烈的MS/MS峰才能被可靠地用于验证上清液中是否存在AIP肽;因此,只有他们米/z(z)为MS选择了个三实验。MS三实验对于明确验证天然组别III AIP的存在尤其必要,因为它具有诊断性5碎片强度相对较低(图。三,天然)。此外,在AIP结构的最初描述中,成熟基团III AIP被假定为八肽(34)。然而,当我们使用公布的序列和计算的质量测试肽的存在时,我们没有发现它。因此,我们测试了许多其他可能性,直到我们确定了正确的结构。在这种情况下,考虑到不同的可能加工位点、可能存在的线性或环化结构,以及偏好钠离子电离的可能性(就像II组自诱导肽一样),有必要测试来自前体序列的28个不同假设对抗质子化。整个实验在一个MALDI样本上完成,时间不到15分钟,如果证明有必要测试更多假设,则剩余大量样本。我们的分析表明,III类AIP是一种七肽,而不是先前假设的八肽(34)。这一观察结果与最近的发现很吻合,表明只有合成的七肽而不是八肽或九肽激活农业土地储备第III组细胞(39).
循环AIP葡萄球菌 中间的是内酯。
五倍浓缩、脱盐的培养上清液中间链球菌在米/z(z)1007.8在单级MS模式下(图。)。可以将此信号分配给中间链球菌如果假设AIP是一个九肽,并且环化是通过内酯键而不是前面讨论的硫代内酯完成的(因为中间乳杆菌AIP在所有其他检查的AIP中的相应位置包含丝氨酸而不是保守的半胱氨酸残基)。为了验证这些假设,在米/z(z)1007.8及其碎片(图。)。三个碎片(y8,年7、和b4)在MS/MS实验中获得。这些片段均未出现在假定的肽环部分内,这一特征与研究质子化的MS/MS片段时的观察结果相符金黄色葡萄球菌AIP。b类4离子在米/z(z)468.3是肽键C末端断裂为苏氨酸的结果,苏氨酸是环外的第一个残基4离子通过MS验证三产生b的实验2离子(图。)。y轴7离子在米/z(z)738.5,在MS/MS实验中观察到,是脯氨酸N末端侧的肽键优先断裂的结果,该肽键也负责生成b2MS中的离子三b的实验4离子。y轴7离子包含肽的环状部分,使其比理论上的线性对应物轻18Da。y的后续碎片7MS中的离子三实验导致y5和y6离子(米/z(z)s 540.3和641.2)。这些光谱提供了强有力的证据,证明中间链球菌AIP确实是一种由内酯组成的环化部分的九肽。
MALDI-离子阱MSn个描述中间乳杆菌来自培养上清液的AIP。微软三亲本y离子的光谱标记为蓝色,而亲本b离子的光谱则标记为紫色。AIP是一种九肽,其环状部分包含内酯。
敏感。
将合成因子α稀释到MALDI矩阵的纯溶液中进行的测试产生了信息丰富的MS/MS光谱(与图。)在1fmol水平下,即在1nM浓度下。当将相同的肽引入二倍体酵母细胞的悬浮液中时,灵敏度降低了≈30倍。AIP的生物活性分析表明,晚期对数培养上清液中的浓度约为30 nM(109每毫升细胞数)(36,39)。来自表皮葡萄球菌据报道,菌株也在相同范围内(49).
讨论
本方法基于MALDI-离子阱MS从复杂且有噪声的混合物中分离特定肽离子的能力,并将这些选择的肽离子转换为低噪声背景的少量信息片段物种。离子阱内的共振激发提供了一种在优选位置裂解肽键的有效方法,从而产生具有高信噪比的相对简单的裂解特征。该方法成功的关键是获得每个多级质谱所消耗的总样品中的很小一部分。因此,在样本耗尽之前,我们能够在给定样本上测试大量不同的假设(>100)。有趣的是将目前用于测试假设的方法与使用LC-MS/MS的替代方法进行比较(参考。50以及其中引用的参考文献),其中可以测试的假设数量受到色谱峰宽和获取MS/MS光谱所需时间的限制。例如,同位素编码亲和标签(ICAT)方法和在线HPLC-MS/MS的组合最近被用于测试复杂蛋白质混合物中是否存在感兴趣的蛋白质。在这种情况下,可以在给定的LC运行中测试多达四种肽的存在(与使用本方法进行的>100次测试相比)。MALDI样本的低利用率和稳定性允许我们测试假设,直到我们用尽了许多替代方案,甚至允许我们在经过数周的思考后再回到问题上来。具有上述特性的任何仪器都应能够进行所述类型的假设驱动实验。可能包括四极-四极飞行时间(Qq-TOF)、TOF-TOF和回旋共振(FT-ICR)分析仪上的傅里叶变换。
事实证明,该方法对于酵母随机孢子分析以及需要检测二倍体污染物的四分体分析非常方便。通过应用这种现场质谱分析程序,可以很容易地解决由紧密间隔菌落周围模糊光晕导致的技术问题。虽然目前用于分析酵母菌落交配信息素的假设驱动的多级质谱方法不需要任何纯化、浓缩或脱盐步骤,但我们发现这些步骤对于分析液体培养上清液中的葡萄球菌AIP很有用。用小培养量(0.01–1 ml)进行快速(≈1 min)和简单的ZipTip程序证明是足够的。作为任何假设驱动的多阶段质谱实验基础的假设质量必须仔细评估,正如钠化基团-II-AIP离子的示例所示。这个中间链球菌AIP是我们研究中唯一含有高碱性侧链残基(精氨酸)的AIP。这种精氨酸残基的存在可能解释了为什么用粗培养上清液制备的样品可以在单级MS模式下容易地观察到这种AIP。由于这些修饰的非加密肽离子的片段离子强度很难预测,因此使用合成肽而不是数据库搜索来提高我们结果的可信度。虽然没有合成形式的中间链球菌AIP可用于分析,MS2和MS三天然AIP的实验(图。)明确地将其表征为九肽内酯,这是第一个在农业土地储备发送信号。这一发现对理解AIP与其受体的详细相互作用具有重要意义。以前已经证明AIP与受体AgrC的相互作用是可逆的和竞争的(51)但尚未确定这种相互作用是否涉及瞬时共价键步骤。原则上,这样的步骤是可以想象的,因为金黄色葡萄球菌AIP含有反应性硫酯键。事实上,我们现在已经描述了中间链球菌AIP内酯的反应性比硫代酯低得多,为这种共价相互作用模型提供了证据。最近在革兰氏阳性菌中也发现了内酯肽用于群体感应,粪肠球菌(52).