呼吸道合胞病毒和副流感病毒的减毒活病毒疫苗：反向遗传学的应用

呼吸道合胞病毒（RSV）和人副流感病毒（PIV）是副粘病毒家族的非片段负链RNA病毒。RSV是婴儿和儿童严重病毒性呼吸道疾病的主要病因，在美国，RSV每年导致73000至126000名1岁以下婴儿住院(1). RSV的两个抗原亚群，命名为A和B，根据抗原和序列二型性进行了区分，其中G蛋白的外域是两种主要保护性抗原之一。尽管这两个亚组之间存在大量的交叉反应，但它们之间的差异足够大，因此一种有效的RSV疫苗可能需要同时代表这两者。

人类PIV血清型1、2和3也会导致严重的呼吸道疾病，导致婴幼儿住院(2). PIV1、PIV2和PIV3是不同的血清型，不会引起显著的交叉中和或交叉保护。在一项对婴儿和儿童长达20年的长期研究中，PIV1、PIV2和PIV3被确定为病原体，分别占小儿呼吸道疾病住院病例的6.0%、3.2%和11.5%(1). 总的来说，这三种PIV仅略低于呼吸道合胞病毒引起的儿科呼吸道疾病住院人数的23%。因此，需要一种疫苗来预防这三种血清型的PIV和两种抗原亚群的呼吸道合胞病毒。对于新描述但相关的人类呼吸道病原体人类偏肺病毒，可能需要额外的儿童疫苗(三).

RSV和PIV的分子病毒学

相对而言，人们对RSV和PIV的分子病毒学有了很好的了解，并为利用反向遗传学构建疫苗开发计划奠定了坚实的基础。RSV的基因组（图​（图1a）1a） 是一个15.2 kb的单链负义RNA，编码10个亚基因组mRNA。病毒基因的转录是由短而保守的基因片段和基因工程调控的顺式-每个基因侧面的作用信号，由不同长度的基因间区域分开。这些mRNA被翻译成11种已知蛋白质：四种核衣壳蛋白，即核衣壳N蛋白、磷酸蛋白P、大聚合酶亚基L和转录延伸因子M2-1；三种跨膜包膜糖蛋白，即融合F蛋白、附着G蛋白和疏水性小SH蛋白；两种非结构蛋白，NS1和NS2；基质M蛋白；和RNA调节因子M2-2。M2-1和M2-2蛋白在M2 mRNA中分别从开放阅读框（ORF）中表达。G和F糖蛋白是主要的保护性抗原，可诱导RSV中和抗体和抗感染性。

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图1

基因缺失病毒显示的RSV基因组图和衰减谱。(一)RSV基因组图，一个15.2 kb的单一负义RNA。每个病毒基因由一个方框表示，每个基因侧面的基因启动和基因启动转录信号分别由灰色和黑色条表示。基因组的3′端和5′端分别由外源先导区（Le）和拖尾区（Tr）组成。基因被短的基因间区域分开，除了在平方米和L（左）与所有其他基因一样，重叠但仍转录成单独的mRNA的基因(1). 这张图只是近似的比例。(b条)黑猩猩上呼吸道（鼻咽）和下呼吸道（气管灌洗）的平均峰值病毒滴度，这些黑猩猩同时通过鼻内和气管内途径接种了指示的基因缺失病毒，或者作为对照，接种了野生型RSV或rRSV中央处理器248/404病毒。最后一种病毒是血清阴性婴儿具有轻度残留毒力的病毒的参考点(4).

PIV的遗传图谱（图中显示了PIV3和PIV1​图2，2（分别为a和b）与RSV有一定的相似性，编码N、P、M、F和L蛋白，这些蛋白与RSV中的相同蛋白具有远距离相关的功能。另一方面，人类PIV缺乏NS1、NS2、SH和M2蛋白，PIVP（P）基因产生额外的辅助蛋白（命名为C、C′、Y1、Y2、V、D和X），这些蛋白在不同的PIV中的发生率不同(1,2). PIV的两种保护性抗原是HN（血凝素-神经氨酸酶）附着蛋白和F蛋白。

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图2

野生型、减毒型和嵌合型病毒中PIV基因组的结构。(一)rPIV3型-内容提供商45是野生型重组PIV3（rPIV3 wt）的一个版本，包含15个点突变（星号）ts秒和生物衍生PIV3的衰减表型-内容提供商45疫苗候选病毒。(b条)海南和F类PIV1 wt病毒的ORF被PIV3 wt病毒中的ORF替代，产生嵌合rPIV3-1病毒。通过进一步引入PIV3 15个突变中的12个，这种作用减弱了-内容提供商45，导致rPIV3-1内容提供商45，PIV1活疫苗候选。

我们致力于开发经鼻给药的小儿呼吸道合胞病毒和PIV活疫苗。这种模仿自然感染的策略的主要优点是诱导平衡的免疫反应，包括血清和粘膜病毒中和抗体以及细胞免疫和先天免疫的保护和调节成分。此外，经粘膜接种的疫苗部分避免了母体衍生的RSV和PIV特异性血清抗体对婴儿的免疫抑制作用。另一个重要的考虑因素是，基于灭活病毒或纯化蛋白的疫苗在随后的RSV感染后与疾病增强相关，而活性减弱的RSV疫苗或自然感染可诱导保护性免疫而不会增强疾病(4). 减毒病毒是使用反向遗传学开发的，感染病毒完全由cDNA产生，因此核苷酸序列的预定变化可以通过cDNA中间产物引入感染病毒。这里描述的工作采用了基于RSV亚群A菌株A2的反向遗传学系统(5)，PIV3病毒株JS(6)，和牛PIV3（BPIV3）(7). 最近，人类PIV1(8)和PIV2(9)也已从cDNA中回收，现在可用于衰减以产生新的候选疫苗株。

生物衍生的减毒活病毒候选疫苗减毒的遗传基础

了解授予减毒表型的活疫苗中的特定突变以及它们对该表型的相对贡献是非常有利的。通过了解衰减的遗传基础，人们可以在疫苗生产和人类使用的所有阶段监测相关突变的稳定性。了解衰减突变的数量及其性质（例如，它们是点突变还是缺失突变）也有助于解释体外和体内生长后衰减表型稳定性的数据。此外，一旦发现了衰减突变，就可以将其引入cDNA衍生病毒中，以产生改进的候选疫苗病毒。

反向遗传学提供了一种强有力的方法来定义现有生物衍生RSV和PIV候选疫苗衰减的遗传基础，这些候选疫苗已通过常规方法（如冷传或化学诱变）进行衰减(10,11). 作为第一步，必须确定每种病毒的完整一致核苷酸序列，并与其野生型亲本的核苷酸序列进行比较。然后必须通过反向遗传学将识别出的突变或突变集插入野生型重组病毒中，以确定它们是否具有衰减表型(10,11). 例如，一个冷消息(内容提供商)PIV3（PIV3-内容提供商45），这是一种有希望的候选疫苗，已被发现含有15个潜在重要的核苷酸替换（图​（图2）。2). 通过反向遗传学将这15个突变重新引入到野生型重组病毒中，结果显示只有6个突变，包括对温度敏感的突变(ts秒)和非-ts秒类型，对衰减表型有很大贡献。多重的存在ts秒和非-ts秒减弱突变为先前观察到的PIV3的高水平表型稳定性提供了可能的解释-内容提供商体内复制后为45(12)，因为使用减活流感病毒疫苗的经验表明ts秒在非-ts秒衰减突变(13).

就RSV而言，最有希望的活性减弱病毒是基于一种叫做内容提供商RSV是由RSV在次优温度下广泛传播而产生的。内容提供商RSV在黑猩猩和人类中只有中度减弱，并且发现含有五种非-ts秒三种蛋白质（N、F和L）中的氨基酸替换作为一组赋予衰减表型。内容提供商RSV受到化学诱变，其中两种很有希望ts秒突变体（呼吸道合胞病毒中央处理器248和RSV中央处理器530）被鉴定并进行第二轮诱变，产生了几个突变体（包括RSV中央处理器248/404和RSV中央处理器530/1030），关闭温度较低。有趣的是，每个化学诱变步骤都引入了一个单一的衰减ts秒突变(10). 除了一个以外，所有这些都在衰减ts秒突变涉及单核苷酸替换，导致L聚合酶蛋白中的单一氨基酸替换。这个例外是一个强烈的衰减ts秒呼吸道合胞病毒突变中央处理器248/404涉及非编码中的单核苷酸替换，顺式-作用基因启动信号平方米基因。这些生物衍生RSV候选疫苗均未被证明具有足够的减毒作用，可作为儿科疫苗使用，但它们代表了反向遗传学进一步减毒的起点。此外，在许多情况下，赋予衰减表型的氨基酸替代可以设计为涉及相对于野生型分配的两个核苷酸变化，而不是原始生物突变体中发现的单核苷酸替代，这将大大减少逆转的频率，从而提高表型稳定性。

反向遗传学也被用于确定Jennerian PIV3候选疫苗衰减的遗传基础，即与人类PIV3抗原相关的BPIV3野生型病毒，由于自然宿主范围限制，在人类中高度衰减且表型稳定(14,15). Bailly等人(16)构建了一种嵌合重组人-牛PIV3病毒（rPIV3-NB），其中人PIV3的核蛋白（N）ORF被BPIV3的对应物取代。rPIV3-NB在恒河猴体内的复制受到与BPIV3亲本相似的限制，表明BPIV3 N蛋白有助于确定BPIV3在灵长类动物中的宿主范围限制（即衰减表型）(16). 人类PIV3和BPIV3的N蛋白共有515个氨基酸，其中有79个差异，其中许多可能与rPIV3-NB的宿主范围衰减表型有关。因此，即使在体内广泛复制后，该菌株也应保持稳定。rPIV3-NB将PIV3的抗原决定簇与BPIV3的宿主范围限制和衰减表型结合在一起，在猴子中诱导了对PIV3攻击的抵抗水平，这与人类PIV3免疫所产生的抵抗水平没有区别。因此，分析灵长类动物BPIV3减毒的遗传基础的过程导致了有前景的候选疫苗rPIV3 NB的开发，并将人和牛PIV3病毒的嵌合鉴定为产生减毒PIV3疫苗的新方法。总之，反向遗传学使我们能够探索至少十种生物衍生RSV和PIV3候选疫苗衰减的遗传基础，并深入了解了这些疫苗病毒在体内复制后衰减表型稳定性的遗传基础。

制定减少病毒突变的菜单

实际考虑因素表明，活疫苗候选疫苗不仅必须得到令人满意的减毒，而且必须能够在适合大规模生产和人类使用的培养细胞中高效复制。这一点尤其重要，因为减毒病毒对宿主的传染性通常会降低，因此必须注射相对高剂量的疫苗(17). 具有所需特性的衰减突变可以组合成一个大的突变菜单，这些突变可以组合起来得到一个在衰减和免疫原性之间具有所需平衡的疫苗株。

在我们的研究中，使用三种主要的衰减突变源来编译RSV和PIV3的菜单。第一个来源是现有的生物衍生的减毒疫苗候选病毒，包括多重传代病毒（如PIV3-内容提供商45和内容提供商RSV），通过化学诱变获得的突变体（例如中央处理器RSV突变体）和宿主范围受限病毒（如BPIV3）。这些病毒在细胞培养中高效复制，临床前和临床研究已证实其安全性和减毒性；因此，它们代表着宝贵的资源。此外，BPIV3N蛋白中的减弱宿主范围序列表现出高水平的表型稳定性。衰减ts秒突变是可取的，因为它们可以在允许的温度下在体外高效生长，并且不同的突变可以指定不同的衰减水平(18). 对于呼吸道病毒，如RSV和PIVts秒突变也是可取的，因为它们优先在最严重的疾病发生地较温暖的下呼吸道指定限制复制。六个RSV和三个PIV衰减ts秒通过生物衍生候选疫苗的序列分析和反向遗传学已经确定了突变(10,11).

减弱突变的第二个来源是在现有病毒突变体或候选疫苗中未发现的新突变。RSV和PIV编码几种非必需蛋白质，其主要功能是通过拮抗宿主防御因子，促进病毒在体内的复制。删除或沉默这些辅助基因或ORF很有吸引力，因为由此产生的病毒在细胞培养中经常保持复制效率。如果这些病毒辅助因子增强发病机制或下调宿主免疫反应，它们的消融可能会提高疫苗的安全性和有效性(10). 这样的突变可以通过删除编码mRNA和蛋白质的完整转录单位来实现，例如对国家标准1,国家标准2，以及上海RSV的基因，或通过删除或沉默编码一个以上蛋白质的复杂mRNA中包含的单个ORF，如消除RSV的M2-2蛋白和PIV3的C、D和V蛋白的表达(19,20). 一个完整基因的缺失是一种理想的突变，因为它比点突变在遗传和表型上更稳定。

RSV的ΔSH、ΔNS1、ΔNS 2和ΔM2-2缺失突变体对黑猩猩的呼吸道具有衰减谱（图​（图1b）1b）(21,22)和其他实验动物(23–25). 特别是，缺失突变型RSVΔNS1在黑猩猩中比RSV弱一些中央处理器248/404，一种生物衍生候选疫苗，对2个月大的人类婴儿的上呼吸道保留一些轻微的残留毒性(4,22). 尽管RSVΔNS1在黑猩猩中的复制受到高度限制，但它对RSV的攻击产生了高水平的耐药性，是一种非常有希望的疫苗候选。

缺失突变体D类和V（V）PIV3的ORF似乎是减少突变菜单中有用的补充，而PIV3缺失CORF产生了一种似乎过度关注的病毒(19,20). 反向遗传学也可用于开发以前在生物衍生菌株中未观察到的新的点突变。例如，突变可以通过cDNA中间产物随机引入单个蛋白质，也可以通过用丙氨酸残基替换单个或成对带电残基引入单个蛋白质。在这种情况下，每个突变都必须根据生存能力、复制效率和ts秒以及恢复病毒的衰减表型。其他可以使用反向遗传学产生的新型衰减突变包括大量核苷酸插入或基因顺序的改变。然而，这些突变通常会降低病毒体外复制的效率，从而使疫苗病毒的制造复杂化(26,27).

第三个衰减突变源涉及其他副粘病毒的现有衰减突变。利用副粘病毒之间现有的序列相关性作为指导，涉及保守残基或结构域的突变可以从一种副粘病毒“转移”到另一种副黏病毒。例如，RSV L聚合酶的点突变（F521L）中央处理器530（上述生物衍生的减毒活RSV候选疫苗）已使用反向遗传学转移到远相关PIV3的同源位置（残基456）-内容提供商45 (10). PIV3获得F456L突变-内容提供商45导致恒河猴和黑猩猩的衰减水平小幅递增(28). 如果PIV3正在进行临床评估，现在可以对该病毒进行评估-内容提供商45表示需要稍微增加衰减。在第二个例子中，仙台病毒多次传代减毒突变体的C蛋白中的点突变（F170S）(29)（鼠源性PIV1）已被引入人类PIV3 C蛋白的同源位置（残基164）(19). 由此产生的重组PIV3，即rF164S，在体外复制非常有效，但在猴子体内，尤其是在上呼吸道，其复制效果减弱。在此基础上，F164S突变被添加到PIV3突变减弱菜单中。将衰减突变从一种病毒导入另一种病毒的能力大大扩展了可用于生产候选疫苗的衰减突变菜单。

汇编衰减突变列表的一个重要目的是，可以将此列表中的突变添加到衰减不足的病毒中，以增加其衰减水平和在体内的表型稳定性。目前正在进行临床试验的呼吸道合胞病毒候选疫苗说明了这一原理(30). RSV 1030衰减ts秒RSV L蛋白突变（Y1321N）中央处理器530/1030已被引入到衰减不足的RSV中中央处理器248/404候选疫苗(4)生成rRSVA2中央处理器248/404/1030，更多ts秒比RSV衰减更大中央处理器248/404父母，代表了一个有希望的新型RSV候选疫苗（图​（图3）。三). 进一步修改，即删除上海基因，创建rA2中央处理器248/404/1030ΔSH，目前正在婴儿和儿童中进行临床试验，似乎比RSV更弱中央处理器248/404 (31). 因此，rRSVA2中央处理器248/404/1030ΔSH具有使用反向遗传学从五种不同RSV突变体收集的突变：内容提供商RSV、RSV中央处理器248，RSV（RSV）中央处理器248/404，RSV中央处理器530/1030和RSVΔSH。这说明了根据从正在进行的临床试验中收集的信息，将衰减突变菜单中的突变组合成单个突变的威力，并且表明，对突变的个别特性的了解可以指导选择将哪些突变纳入新的候选疫苗。

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图3

利用反向遗传学将新的突变组合引入A亚群rRSV A2，并加速开发针对B亚群RSV的活性减毒疫苗病毒(一)重组野生型RSV（rRSV A2 wt）被用作引入5个点突变的主干内容提供商RSV（cp），RSV的两个衰减突变中央处理器248/404（248-L和404-M2），以及RSV的一个衰减突变中央处理器530/1030（1030）以创建新的候选疫苗rRSVA2中央处理器248/404/1030. (b条)编码B亚群RSV B1 wt病毒F和G抗原决定簇的基因被替换到rRSV A2 wt病毒的主干中，以产生嵌合rRSV AB wt病毒，然后通过引入三个基因突变来减弱该病毒内容提供商RSV，RSV的两个突变中央处理器248/404和RSV的一个突变中央处理器530/1030. 右侧显示了啮齿动物或黑猩猩呼吸道中的病毒复制水平。

在编制呼吸道病毒有用的衰减突变菜单时，需要考虑几个因素。首先，最好包括产生不同程度衰减的突变，因为可能有必要进一步限制不完全衰减候选基因在10到1000倍范围内的复制水平。其次，菜单应包括非-ts秒突变，可以增强ts秒疫苗病毒中存在突变。第三，应包括指定高度遗传和表型稳定性的突变或序列，例如缺失突变或宿主范围决定因素（例如BPIV3N个ORF）。第四，菜单应该相当大，因为不是所有的衰减突变组合都是可行的(30)而且，由于突变组合指定的衰减水平并不总是单个突变指定的衰减之和。例如，当置于某些其他衰减突变的上下文中时，单个突变的衰减效果可以被掩盖。将这种突变包括在单个菌株中是可取的，因为它允许将更多的衰减突变纳入候选疫苗，这将抑制表型变化，如果在一个或多个位点发生逆转。第五，如上文所述，在可能的情况下，最好使用与野生型分配不同的密码子产生氨基酸点突变，以减少逆转的频率。

需要反复试验来确定兼容突变，并确认任何特定组合的衰减水平。候选疫苗的潜在数量似乎太多，难以操作，但实际上，新病毒的设计是通过与之前进行临床前和临床评估的候选疫苗进行比较来指导和简化的。如图所示​图1a，1a、 其中RSV缺失突变体与现有的、特征明确的RSV进行比较中央处理器248/404病毒。利用这些原理，可以组合一系列衰减突变，并将其用于疫苗病毒的设计，从而在衰减和免疫原性之间实现适当的平衡。

设计和使用抗原嵌合病毒创造新疫苗

如上所述，人RSV以两个抗原亚群A和B存在，这两个亚群均应在疫苗中表示。为了加快B亚组疫苗的开发，我们对现有的重组RSV A2（a亚组）进行了修改，因为B亚组缺乏有希望的候选疫苗、反向遗传学系统和减弱突变的菜单因此，其G和F糖蛋白基因被替换为RSV B亚群B1株的对应基因（图​（图3b）三b）(32). 这种保护性抗原的替换最初用于野生型重组RSV A2病毒，以创建RSV AB野生型嵌合病毒（rRSVAB wt），然后用于一系列RSV A2衍生物，这些衍生物包含RSV A2衍生的衰减突变的各种组合，这些突变位于除F类和G公司其中一个如图所示​图3b三b条(32). rRSVAB wt嵌合病毒在细胞培养中复制，其效率与RSV A2和B1野生型亲本相当。同样，rRSVAB中央处理器248/404/1030嵌合重组体ts秒RSV A2背景中的突变在体外表现出与携带相同突变的RSV A2重组体相似的温度敏感性水平。

在黑猩猩中，rRSVAB wt嵌合体的复制介于RSV A2和B1野生型病毒之间（图​（图3b）三b） 并伴有中度鼻漏。rRSVAB公司中央处理器248/404/1030在黑猩猩的上呼吸道和下呼吸道中高度衰减，具有免疫原性，并能抵抗rRSVAB wt病毒的攻击。因此，rRSVAB中央处理器248/404/1030嵌合病毒是RSV B亚群的一种有希望的候选疫苗，应在人类中进行评估。此外，这些结果表明，在携带呼吸道合胞病毒主要保护性抗原的病毒中，可以根据需要将来源于呼吸道合胞病毒A2的额外衰减突变插入rRSVAB的呼吸道合胞病毒A2背景中，以合理可预测的方式改变衰减表型，从而在衰减和免疫原性之间实现最佳平衡B亚组。

我们采用了类似的方法设计了一种PIV1活减疫苗，对于这种疫苗，没有有希望的候选疫苗，而且直到最近才有反向遗传学系统(8). 利用现有的PIV3反向遗传系统，我们替换了海南和F类PIV3的ORF与其PIV1对应物，产生嵌合病毒rPIV3-1 wt，其在体外、啮齿动物和猴子中的复制效率与野生型病毒相同（图​（图2b）。2b） ●●●●。以同样的方式，我们引入了PIV1海南和F类ORF转化为特征良好的PIV3重组版本-内容提供商45个候选疫苗，用于创建减活嵌合PIV1候选疫苗，称为rPIV3-1内容提供商45，其结合了PIV3的衰减骨干-内容提供商45与PIV1中和抗原（图​（图2b）2b）(33). PIV3 15个突变中的3个-内容提供商45位于海南和F类基因，因此在涉及这些基因的交换中丢失了。尽管如此，嵌合rPIV3-1内容提供商45病毒在仓鼠中的复制比rPIV3受到更多限制-内容提供商45，表明在PIV3中引入异源PIV1 HN和F蛋白具有与12个PIV3所赋予的减毒作用相加的减毒效果-内容提供商45个突变。rPIV3-1型内容提供商45是免疫原性的，可以保护仓鼠免受野生型PIV1的攻击。该病毒显示出足够的潜力，应进一步评估其作为一种候选减活疫苗株，以预防婴幼儿严重下呼吸道PIV1疾病。

在这个策略的另一种排列中，我们使用反向遗传学来取代海南和F类BPIV3的糖蛋白基因，即上文所述的人类PIV3的Jennerian候选疫苗，与它们的人PIV3对应物一起，创造了一种称为rB/HPIV3的减毒嵌合病毒。由于这种嵌合病毒携带人类PIV3的HN和F保护性抗原，因此与BPIV3候选疫苗相比，它诱导了更高水平的HPIV3血清抗体(7,34). 与上述rPIV3-NB嵌合体一样，rB/HPIV3将人类PIV3的抗原决定簇与BPIV3的宿主范围限制和衰减表型结合在一起，但在rB/HPIV3的情况下，除恩和F类来源于牛PIV3。很可能不止一个BPIV3基因参与灵长类BPIV3复制的宿主范围限制，在这种情况下，rB/HPIV3比rPIV3-NB更具表型稳定性。

尽管抗原嵌合病毒为快速生成新候选疫苗提供了一种策略，但使用它们可能要付出代价。RSV和PIV1、PIV2和PIV3的流行病学表明，按顺序接种疫苗是最佳的，抗原嵌合病毒作为疫苗的使用必须与该顺序接种计划相一致。RSV和PIV3在出生后4个月内会导致重大疾病，而PIV1和PIV2引起的大多数疾病发生在6个月后。采用减毒活RSV和PIV疫苗的理想免疫顺序是将RSV和PI V3疫苗作为联合疫苗同时接种，接种次数为两次或两次以上，第一次给药时间为1个月龄或之前，然后在4个月龄和6个月龄时接种二价PIV1和PIV2疫苗。如果PIV3疫苗和重组PIV3-1疫苗病毒之间发生交叉保护，这将使这种顺序免疫计划复杂化。我们发现先前感染PIV3会适度降低rPIV3-1候选疫苗对PIV1的复制性、免疫原性和效力(35). 这种干扰可能是由T细胞免疫对两种病毒共享的内部PIV3蛋白产生的耐药性介导的。在仓鼠中，这种影响在4个月内减弱。灵长类动物，特别是年轻人类疫苗对PIV3的细胞介导免疫的程度和持续时间尚不清楚。因此，在PIV3-免疫人群中使用rPIV3-1抗原嵌合疫苗的序贯免疫方案可能会对这些疫苗的传染性和免疫原性带来潜在问题。重要的是，这一限制不适用于RSV亚群A疫苗病毒及其A/B抗原嵌合对应物，因为这两种病毒将同时给予。成功的PIV1和PIV2疫苗可能需要使用最近描述的反向遗传学系统并利用此处概述的一般原理开发减毒的人类PIV1或PIV2病毒疫苗。

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