有针对性地中断印章基因延迟内质网应激介导的糖尿病

双突变小鼠的基因分型。

的基因型检查2如前所述，由RFLP确定(14). 的基因型印章PCR检测。使用以下引物：阳性引物为5′-GAGAAAAAAGAGTACAAAATGGCCTGG-3′，反义引物为5'-AATTTTCATCTGAGGAGAGG-ACCTG-3′（来源于新霉素抗性基因）和5'-ATCGCCTATCGCCCTATCTCTCGGAG-3’（来源于Chop基因）。热循环反应的执行如下：94°C持续2分钟，然后在94°C下进行35次循环，持续15秒，55°C持续30秒，68°C持续两分钟，72°C持续7分钟。野生型和重组等位基因各自产生1.3 kb的转录本。

Northern印迹分析。

总RNA（每道2.0μg）在甲醛-淀粉凝胶中电泳，并印在尼龙膜上。Northern blot分析如下所述(15). 地高辛标记的鼠胰岛素2反义RNA探针（核苷酸2344–3026；GenBank登录号{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_008387”，“term_id”：“915410360”，“term_text”：“NM_008386”}}NM_008387)，鼠标剪切(11)，和小鼠Bip（核苷酸1629–1859；GenBank登录号{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“AJ002387”，“term_id”：“2598561”，“term_text”：“aJ002386”}}AJ002387型)使用DIG RNA标记试剂盒（美国印第安纳州印第安纳波利斯罗氏分子生物化学公司）合成。使用化学发光图像分析仪（LAS-1000plus；日本东京富士光电胶片公司）量化化学发光信号。

血糖和血浆胰岛素浓度。

使用葡萄糖分析仪（HemoCue AB，瑞典阿尔根霍尔姆）通过变位酶/葡萄糖脱氢酶法测量血糖浓度。使用胰岛素ELISA试剂盒（Shibayagi Co.，Shibukawa，Japan）通过sandwich型酶免疫测定法测定血浆胰岛素浓度。

胰腺中的胰岛素含量。

从小鼠体内取出胰腺，立即在液氮中冷冻。使用酸/乙醇方法制备蛋白质提取物(16). 简言之，将组织在酸/乙醇（0.18M HCl在70%乙醇中）中匀浆，并将匀浆超声处理15秒，并在4°C下保持24小时。然后将匀浆以500离心克在4°C下保存10分钟，上清液在-20°C下储存。中和后，使用上述胰岛素ELISA测定提取物中的胰岛素。用Bradford法测定组织提取物中的蛋白质。

免疫染色和TUNEL分析。

胰腺标本用4%多聚甲醛缓冲溶液固定，并包埋在石蜡中。将试块切割成5μm厚的截面。切片用兔抗胰岛素多克隆抗体（美国加利福尼亚州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）或鼠抗Chop单克隆抗体（圣克鲁斯生技公司）作为主要抗体进行染色；使用Cy3标记的抗兔IgG（美国新泽西州皮斯卡塔韦Amersham Pharmacia Biotech）或Alexa Fluor 488标记的抗鼠Ig G（美国俄勒冈州尤金Molecular Probes Inc.）作为二级抗体。对于凋亡检测，使用原位凋亡检测试剂盒（日本大津市Takara Shuzo公司）进行TUNEL分析。在配备氪氩激光的奥林巴斯荧光显微镜下观察组织，并使用C5810彩色冷冻3CCD摄像机系统（日本滨松光电KK）获取图像。

细胞培养、转染和凋亡分析。

如前所述，将小鼠胰岛素瘤MIN6细胞培养在60 mm胶原蛋白涂层皿中，培养皿中加入25 mm葡萄糖和10%FCS的DMEM(11).

使用LipofectAMINE 2000（Invitrogen Corp.，Carlsbad，California，USA）将质粒DNA（总计5μg）转染至MIN6细胞。增强型绿色荧光蛋白表达载体（pEGFP）和表达增强型黄色荧光蛋白的ER定位载体（pEYFP-ER）购自Clontech Laboratories Inc.（美国加利福尼亚州埃默里维尔）。利用MIN6细胞的mRNA，通过RT-PCR分离小鼠胰岛素2 cDNA克隆。为了引入Cys96Tyr取代，使用突变引物5′-AGCGTGGCATTGTAGATCAGTGCTACACA-3′和5′-TGGTAGTACCTATATCACATGCCACGCT-3′进行重叠延伸PCR诱变。DNA测序证实了突变。pcDNA的构建-检查2^重量和pcDNA-检查2^C96Y型通过将小鼠野生型或Cys96Tyr（突变胰岛素2）的全长cDNA片段分别插入哺乳动物表达载体pcDNA3.1（–）（Invitrogen Corp.）连接剂后进行。生成p检查2^重量-EGFP和p检查2^C96Y型-EGFP构建物，其中EGFP位于胰岛素的C末端，将全长cDNA片段（除其终止密码子外的全长）插入哺乳动物表达载体pEGFP-N1（Clontech Laboratories Inc.）。

在细胞凋亡检测中，转染48小时后，小心取出培养基以收集分离的细胞。通过胰蛋白酶消化回收粘附细胞，并与分离的培养基混合。细胞被造粒并重新悬浮。为了分析细胞核的凋亡变化，细胞被固定在4%甲醛中的PBS中30分钟，用Hoechst 33258染色，并在荧光显微镜下观察。为了检测DNA梯状结构的形成，从细胞中提取DNA，在2%琼脂糖凝胶中电泳，用SYBR Green I（Molecular Probes Inc.）染色，并通过紫外线透照进行可视化。根据制造商的说明，使用Annexin V–Cy3凋亡检测试剂盒（日本名古屋医学和生物实验室公司）进行Annexin-V染色。

秋田小鼠胰腺内质网应激相关基因的诱导。

这个检查2秋田小鼠的突变破坏了胰岛素a链和B链之间的二硫键，并可能导致分子的剧烈构象变化。我们推测，这种错误折叠的胰岛素可能会导致内质网应激。为了检查秋田小鼠的内质网应激，对胰腺中胰岛素和内质网胁迫相关蛋白进行了Northern blot分析（图​（图2）。2). 在检查2^{重量/重量}小鼠，胰岛素mRNA随着年龄的增长逐渐增加（数据未显示）。在3周龄时，胰岛素mRNA在检查2^重量/C96Y老鼠比在检查2^{重量/重量}小鼠，在检查2^C96Y/C96Y老鼠。6周龄时，胰岛素mRNA在检查2^重量/C96Y小鼠与对照组相比，但在检查2^{重量/立方厘米96年}小鼠和检查2^{c96年/c96年}老鼠。相反，在9周龄时，mRNA在检查2^重量/C96Y小鼠比对照组低检查2^C96Y/C96Y小鼠比对照组大。胰岛素mRNA的减少检查2^C96Y/C96Y小鼠似乎是由于β细胞丢失所致（见下文）。值得注意的是，糖尿病的发病与胰岛素mRNA的增加有关。这表明胰岛素mRNA被诱导以补偿活性胰岛素分泌的不足。内质网应激可诱导Chop/GADD153（一种在生长停滞和细胞死亡中起作用的转录因子）和Bip/GRP78（一种内质网伴侣）。Chop mRNA在检查2^C96Y/C96Y小鼠在3周龄时比对照组大。在这两种情况下，其值也远高于对照组检查2^重量/C96Y小鼠和检查2^C96Y/C96Y6周龄小鼠检查2^重量/C96Y9周龄小鼠。Chop mRNA的波动情况与胰岛素mRNA相似。这些结果表明，杂合和纯合突变小鼠的β细胞都受到ER应激，ER应激与胰岛素mRNA的诱导密切相关。

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图2

雄性秋田小鼠胰腺中胰岛素、Chop和Bip mRNA的Northern blot分析。(一)显示了胰岛素、Chop和Bip mRNA在指定年龄段的化学发光图像。对来自每个基因型的胰腺的总RNA（2.0mg）进行Northern印迹分析。在3周龄、6周龄和9周龄时，在基本相同的条件下获得结果。(b条)量化在中获得的结果一，显示为平均值±SD(n个= 3).

胰岛素2过度表达^C96Y型导致MIN6细胞凋亡。

Chop的诱导与新生儿高血糖检查2^C96Y型小鼠表明，突变胰岛素引起内质网应激，并通过Chop诱导导致β细胞凋亡。为了验证这个假设，我们在MIN6细胞中过度表达野生型和Cys96Tyr突变胰岛素2（图​（图3）。三). 我们将小鼠胰岛素和EGFP融合，用于实时监测细胞凋亡（图​（图3a）。三a） ●●●●。当细胞转染p检查2^重量-EGFP质粒，转染后24小时在转染细胞中观察到荧光，并随着时间的推移明显增加，直至60小时（图​（图3a）。三a） ●●●●。当细胞转染p检查2^C96Y型-EGFP质粒、荧光细胞的形态与表达检查2^重量–24小时EGFP。然而，表达检查2^C96Y型–EGFP在36小时及之后变圆并脱离菜肴。这些结果表明，细胞表达检查2^C96Y型–EGFP经历细胞死亡。

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图3

过表达Ins2的MIN6细胞的凋亡^C96Y型–EGFP和Ins2^C96Y型. (一)细胞转染p检查2^重量-EGFP或p检查2^C96Y型-EGFP。在转染后的指定时间，在荧光显微镜下观察细胞。原始放大倍数：×100。(b条)用pEYFP-ER和任一pcDNA共同转染细胞-检查2^重量或pcDNA-检查2^C96Y型.转染48小时后，在荧光显微镜下观察细胞。原始放大倍数：×200。(c（c）)用pEGFP和任一pcDNA共同转染细胞-检查2^重量或pcDNA-检查2^C96Y型转染细胞和凋亡细胞分别通过GFP荧光和Hoechst 33258染色显示。pcDNA-检查2^重量–转染细胞没有凋亡（箭头），而pcDNA-检查2^C96Y型–转染的细胞凋亡（箭头）。原始放大倍数：×400。(d日)用pcDNA转染细胞-检查2^重量或pcDNA-检查2^C96Y型提取DNA，在2%琼脂糖凝胶中电泳，用SYBR Green I染色，并通过紫外线透照进行可视化。(e（电子）)用pEGFP和任一pcDNA共同转染细胞-检查2^重量或pcDNA-检查2^C96Y型转染细胞和凋亡细胞分别通过GFP荧光和膜联蛋白V染色显示。原始放大倍数：×200。

为了排除融合蛋白的人为影响，细胞被EYFP-ER表达质粒和pcDNA共同转染-检查2^重量质粒或pcDNA-检查2^C96Y型质粒。表达检查2^重量显示ER样荧光，而表达检查2^C96Y型变得圆滚滚的，与碗碟分离（图​（图3b）。三b） ●●●●。Hoechst 33258染色显示，细胞表达检查2^C96Y型发生凋亡（图​（图3c）。三c） ●●●●。pcDNA转染-检查2^C96Y型质粒导致DNA梯状结构的形成，这是凋亡细胞的特征（图​（图3d）。三d） 。Annexin V染色显示细胞表达检查2^C96Y型发生凋亡（图​（图3e）。三e） ●●●●。综合考虑这些结果，我们得出结论：检查2^C96Y型导致内质网应激并导致Chop介导的细胞凋亡。

具有Ins2突变和Chop破坏的双突变小鼠的特征。

为了进一步研究Chop在内质网应激介导的糖尿病中的作用，我们制备了Ins2基因发生突变、细胞凋亡被破坏的双突变小鼠印章基因。通过杂交获得后代印章^–/–带有检查2^重量/C96Y老鼠。图​图4a4a显示了典型的基因分型示例。产生了九种小鼠基因型：检查2^{重量/重量}印章^+/+,检查2^{重量/重量}印章^+/–,检查2^{重量/重量}印章^–/–,检查2^重量/C96Y印章^+/+,检查2^{重量/立方厘米96年}印章^+/–,检查2^重量/C96Y印章^–/–,检查2^C96Y/C96Y印章^+/+,检查2^C96Y/C96Y印章^+/–、和检查2^C96Y/C96Y印章^–/–所有这些都具有相同的遗传背景（C57BL/6）。如图所示​图1，1,检查2^重量/C96Y和检查2^C96Y/C96Y小鼠在8周龄时出现高血糖。因此，我们在8周龄时测量了每个基因型的体重、血糖水平和胰腺胰岛素含量（图​（图4b）。4b） 。检查2^{c96年/c96年}所有Chop基因型的小鼠体重减轻，严重高血糖，胰腺胰岛素含量降低。两组之间无统计学显著差异印章^+/+,印章^+/–、和印章^–/–老鼠。检查2^C96Y/C96Y由于葡萄糖引起的胰岛素分泌缺陷（数据未显示），小鼠通常会导致围产期死亡。相反，在检查2^重量/C96Y老鼠印章^–/–小鼠没有出现高血糖，体重和胰腺胰岛素含量明显高于正常小鼠印章^+/–和印章^+/+老鼠。这些参数在印章^+/–和印章^+/+老鼠。这些结果与我们之前的发现一致，即胰岛印章^–/–小鼠对一氧化氮的抵抗力比来自印章^+/+和印章^+/–动物(11). 这些结果表明，Chop基因的破坏推迟了糖尿病的发病检查2^重量/C96Y老鼠，但不在检查2^C96Y/C96Y老鼠。

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图4

具有以下特征的双突变小鼠检查2突变和印章中断。(一)双突变小鼠的基因分型。代表性基因分型检查2RFLP基因；PCR显示了9个突变株系的Chop基因。检查2用基因组DNA PCR扩增外显子3。这个检查2^C96Y型秋田小鼠的突变破坏了Fnu4H型第3外显子的I位点检查2.消化Fnu4H型我没有改变突变等位基因（280 bp）PCR产物的大小，但将野生型等位基因的大小降低到140 bp。方法中描述了野生型和突变型Chop小鼠的引物。左侧通道显示100-bp DNA梯形标记（顶部面板）和λDNA/后面的Ⅲ+φ×174DNA/海III碎片标记（中间和底部面板）。(b条–d日)8周龄双突变小鼠的表型特征。(b条)体重。(c（c）)早上血糖。(d日)胰腺胰岛素含量。数据显示为平均值±SDCHOP公司基因由学生评估t吨测试：*P（P）<0.001与印章^+/+.^‡检查2^C96Y/C96Y印章^+/+老鼠出生几天内就死了。因此，^†数据仅显示为一个鼠标和^‡数据显示为平均值±范围(n个= 2).

在体重方面印章^+/+,印章^+/–、和印章^–/–雄性小鼠。女性印章^–/–小鼠的体重比雌性大印章^+/+动物有。此外，肥胖和脂肪沉积的发展印章^–/–16周龄后的小鼠出现加速（数据未显示）。有人认为，Chop通过干扰脂肪生成C/EBP亚型的积累来抑制脂肪分化(17,18). 因此，我们推测Chop基因的靶向性破坏通过增加脂肪细胞分化导致肥胖。在本研究中印章^–/–由C57BL/6菌株产生的小鼠仅从最初的129/Sv×C57BL-6小鼠回交两代。因此，129/Sv背景也可能影响体重。

Chop基因的破坏保护Ins2的胰岛细胞^重量/C96Y小鼠免于凋亡。

Chop基因敲除对小鼠β细胞凋亡的影响检查2^重量/C96Y对小鼠进行组织学检查（图​（图5）。5). 4周龄时，在检查2^重量/C96Y印章^+/+小岛。Chop阳性细胞的分布与胰岛素阳性细胞相似，表明Chop阳性的细胞是β细胞。在检查2^重量/C96Y小鼠胰岛体积明显缩小，胰岛素阳性细胞数量减少。胰岛中可见凋亡（TUNEL阳性）细胞。相比之下检查2^{重量/立方厘米96年}印章^–/–小鼠的胰岛大小保留得相当好，TUNEL阳性细胞的数量要少得多。每个胰岛中TUNEL阳性细胞的数量检查2^重量/C96Y印章^+/+小鼠为10.50±10.73(n个=20），而检查2^重量/C96Y印章^–/–小鼠为1.10±1.74(n个= 20). 在检查2^C96Y/C96Y小鼠，破坏印章该基因未能保护胰岛免受凋亡（数据未显示）。这些数据表明检查2^C96Y型突变小鼠的主要原因是通过内质网应激介导的凋亡导致β细胞的特异性减少，而Chop基因的破坏可以拯救β细胞检查2^重量/C96Y小鼠凋亡。

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图5

男性胰岛Chop和细胞凋亡的免疫组织化学检测检查2^{重量/重量}印章^+/+,检查2^重量/C96Y印章^+/+、和检查2^重量/C96Y印章^–/–老鼠。(一)胰岛素和Chop的免疫染色。胰腺来自检查2^重量/C96Y印章^+/+和检查2^重量/C96Y印章^–/–固定4周龄的雄性小鼠，然后对其进行胰岛素（红色）和Chop（绿色）的联合训练。显示了相同场的相控图像和荧光图像。原始放大倍数：×100。(b条)TUNEL法检测细胞凋亡。胰腺来自检查2^{重量/重量}印章^+/+,检查2^重量/C96Y印章^+/+、和检查2^重量/C96Y印章^–/–获得雄性小鼠，并对胰岛素（红色）和TUNEL阳性细胞（绿色）进行共染色。显示了相同场的相控图像和荧光图像。原始放大倍数：×200。

我们感谢J.Miyazaki（大阪大学）提供MIN6细胞，R.Shindo（本实验室）提供技术援助，N.J.Hoogenraad（拉筹伯大学）和M.Ohara（日本福冈）对手稿的评论。这项工作得到了日本教育、科学、体育和文化部赠款的部分支持。