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肿瘤。2000年11月；2(6): 531–539.
数字对象标识：10.1038/sj.neo.7900114号
预防性维修识别码：PMC1508088型
PMID：11228546

NF-Y、Sp1和视网膜母细胞瘤蛋白对端粒酶RNA基因启动子活性的激活及Sp3的抑制1

赵江琴,* Rosalind M Glasspool公司,* 斯泰西·F·霍尔,* 阿兰·比尔斯兰德,* 伊斯特万·萨特马里,†和W尼科尔·基思*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

人端粒酶RNA组分基因h的表达TERC公司对端粒酶活性至关重要。hTERC公司该基因在胚胎发生过程中表达，然后在正常发育过程中下调，使大多数成年体细胞缺乏hTERC公司表达式。然而，在肿瘤发生期间，hTERC公司被重新表达，从而促进了许多人类癌症的无限制增殖能力。因此，确定正常细胞中端粒酶RNA组分基因调控及其在癌细胞中解除调控的分子基础具有直接的意义。我们之前克隆了hTERC公司启动子和在这项研究中已经确定了几个调节h表达的转录因子TERC公司我们证明了NF-Y与h的CCAAT区域结合TERC公司启动子对启动子活性至关重要。Sp1和视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）是hTERC公司启动子和Sp3是一种有效的阻遏物。这些因素似乎以特定物种的方式发挥作用。而Sp1和Sp3作用于人、牛和小鼠TERC公司启动子，pRb只激活人和牛的启动子，NF-Y只对人类至关重要TERC公司基因。

关键词：端粒酶、NF-Y、hTERC、视网膜母细胞瘤、hTR

介绍

端粒是线性染色体末端的核蛋白复合体，被认为是维持染色体完整性的关键[1]. 如果在细胞分裂过程中出现关键的端粒序列丢失，则会诱导一种称为复制性衰老的细胞周期阻滞[1,2]. 端粒酶是一种核糖核蛋白逆转录酶，能够合成端粒序列，从而平衡端粒磨损。人类端粒酶活性在体外可以被RNA亚单位h重组TERC公司和h编码的催化蛋白成分TERT（地形）基因，尽管这些核心亚单位可能会被额外的因子增强以实现最佳功能[1,2]. 小时TERC公司基因表达在人类正常发育过程中受到调控，随着组织分化的发生，胚胎发生期间的高表达水平逐渐降低。到出生后第10周，h的成年模式TERC公司只有初级精母细胞保持高表达水平时，表达明显[三]. 尽管hTERC公司大多数成年体细胞中没有表达，低hTERC公司在一些细胞中可以检测到表达，如上皮再生区和活化淋巴细胞[3–5]. 然而，在致癌过程中，hTERC公司在癌细胞中丢失或被解除调控，从而导致癌细胞中几乎普遍的端粒酶重新激活[2,6]. 最近的研究表明，转录调控可能在h的控制中发挥作用TERC公司基因表达[7,8]. 因此，h的分子基础的鉴定TERC公司正常细胞中的基因调控及其在癌细胞中的解除调控是当前的研究热点。转录控制中的一个新主题是，转录因子组之间的功能相互作用产生调节。因此，本研究的目的是确定调节hTERC基因启动子的多个转录因子。

材料和方法

定点突变和构建

人启动子萤光素酶构建体hProm876、hProm176、hProm120和小鼠TERC公司启动子构建mProm628是通过将PCR产物插入pGL-3 Basic（Promega Southampton，U.K.）中制成的。所用引物的详细信息可从作者处获得。测序证实了方向和序列。使用定点突变试剂盒（QuikChange，Stratagene Cambridge，UK）生成（hProm176h10m1）结构体，以引入-58/-55的四bp突变。用于构建该位点重定位突变体的引物如所示图1b条（时10分1秒）。将其亚克隆到pGL3荧光素酶报告载体并测序以确认突变。

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（a） hTERC启动子序列和潜在转录因子识别位点。人类启动子序列的总长度为176 bp，通过计算机分析确定的潜在调控基序在序列上突出显示。转录起始位点标记为“+1”。显示了四个潜在的Sp1位点，命名为Sp1.1到Sp1.4。Sp1.4包含两个重叠的Sp1共识站点。电泳迁移率变化分析（EMSA）中使用的寡核苷酸的名称在其各自的位置下标明。（b） EMSA和hTERC启动子突变研究中使用的寡核苷酸。显示了覆盖潜在转录因子识别位点的野生型寡核苷酸序列。寡核苷酸h9覆盖Sp1.1和相邻的TATA盒，h10覆盖CCAAT盒，h4覆盖Sp1.2，h11覆盖紧密相对的Sp1.3和Sp1.4位点。将突变h10m1和h10m2引入野生型寡核苷酸h10中，用于EMSA和构建突变报告子结构（hProm176h10m1）。

核蛋白提取物的制备

HeLa细胞在TMS（5 mM Tris-HCl pH 7.5，2.5 mM MgCl）中溶解2125 mM蔗糖加0.25%Triton X-100），通过离心法获取细胞核。将细胞核重悬于5ml TMS和0.1体积的4mNaCl中。离心后，添加硫酸铵，沉淀粒化并在E50缓冲液中再溶解（50 mM硫酸铵、20 mM KOH-Hepes、pH 7.9、5 mM MgCl2，0.1 mM EDTA，0.1%（v/v）Brij 35，20%（v/v）甘油，1 mM DTT）。

电泳迁移率变化分析

使用EMSA试剂盒（Promega）进行电泳迁移率变化分析（EMSA）。HeLa核蛋白在15µ含4%甘油、1 mM MgCl的反应l2，0.5 mM二硫苏糖醇（DTT）、0.5 mM EDTA、50 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、pH 7.5和2.0µg聚（dl-dC），含或不含100倍摩尔过量的未标记DNA竞争物，在冰上放置10分钟，然后添加放射性标记探针。对于超位移分析，针对Sp1、Sp3、Ap-2、Ets2、c/EBP的抗体α在添加探针前25分钟，将NF-1、NF-YC（加州圣克鲁斯生物技术公司）、NF-YA和NF-YB添加到反应混合物中。所有DNA-蛋白复合物在5%天然聚丙烯酰胺上通过电泳分离。EMSA中使用的e/EBP、CBF和NF-1序列来自圣克鲁斯生物技术：sc-2525、sc-2591和sc-2553。NF-Y序列来自Geneka Biotechnology Inc.（加拿大蒙特利尔）。

转染试验

如前所述，使用Superfect转染试剂（英国Qiagen West Sussex）进行转染[8]. 使h的数量标准化TERC公司在质粒DNA转染实验中，纯化的质粒DNA首先通过紫外分光光度法进行定量。然后是1.0µg质粒DNA用X消化呵我/后面的III和片段在6%的PAGE凝胶上解析，以检测176-bp启动子片段。通过PhosphorImager和ImageQuant软件分析（Molecular Dynamics Bio-Rad，Hemel Hempstead，UK）分析每个DNA样本的数量。对于共转染，3µhProm176或1的gµg的hProm876报告质粒与0.01-3共转染µg pNF-YAm29、pNF-Y13、pCMV-Sp1、pCMV-Sp3、pSV40-Rb表达载体。在整个研究过程中使用了hProm176结构，但hProm867结构也用于扩展最小人类启动子结构的分析，并测试最大启动子对修饰基因的反应是否与最小启动子相似。两种人类构建物在联合转染实验中的反应方式相同。

在使用突变启动子构建物、pSV40-Rb载体、pNF-Y13和pNF-YAm29表达载体的实验中，使用Great EscAPe SEAP系统（英国Clontech Basingstoke）控制转染效率。与其他人一致，我们发现Sp1和Sp3表达载体调节了pSEAP2对照载体中使用的SV40启动子的活性[9,10]. 对于这些实验，使用荧光素酶特异性引物和相对于输入基因组DNA调整的产物对转染质粒进行半定量PCR。

显示了代表性转染的重复样品的平均值和标准偏差，所有实验至少重复进行三次。实验如所示图4b条Sellers开发的二手视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）变体等。[16].

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（a） pRb激活hTERC启动子活性。用定量hTERC-荧光素酶质粒和增加pRb表达载体浓度转染pRb/p53阴性细胞系5637。此外，还分析了小鼠端粒酶（mTerc）启动子荧光素酶构建物mProm628对pRb的反应[8]. 数据表示为荧光素酶活性相对于启动子的折叠诱导。pSEAP2-控制载体被用作转染效率的内部对照。（b） 野生型pRb和三种变体Δ663、661W和Δ657对hTERC启动子活性的差异激活。用3μg hTERC-荧光素酶质粒（phProm176）和0.5μg每个pRb表达载体转染pRb/p53阴性细胞系5637。数据表示为荧光素酶活性相对于单独表达载体（空载体）的折叠诱导。pSEAP2-控制载体被用作转染效率的内部对照。（c） 物种间TERC基因转录调控的功能差异。对人（hProm867）、小鼠（mProm628）和牛TERC基因的启动子荧光素酶构建物进行了比较，以了解其受Sp1、Sp3、NF-YAm29和pRb的调节。启动子与转录调控因子共同转染后的活性表现为相对于启动子本身的折叠诱导。所有实验中均使用pRb/p53阴性细胞系5637，蛋白质和转染效率的平均荧光素酶活性标准化显示为重复样本的标准偏差。

bTERC的克隆

一种包含b的320 bp的PCR产物TERC公司使用引物bTRf1 GCGCTCGAGCCGTACCTGTTTAAGAG和bTRr1 CGAAGCTTAGATGAGATGGCTGCCAC以及牛基因组DNA作为模板（克隆）扩增启动子。根据bTERC基因序列设计引物[11]. 然后将其克隆到荧光素酶报告子构建物pGL3 Basic（Promega）中。通过测序检查插入物的方向和顺序。b类TERC公司启动子序列已提交给GenBank，登录号AF176663型.

结果

我们之前已经确定了h的近端区域TERC公司引导h必需的启动子TERC公司转录[8]. DNase I足迹确定了其中包含四个保护区的176-bp区域（数据未显示）。计算机分析显示，这些对应于四个推定的Sp1结合位点和一个CCAAT盒(图1：h4、h9、h11、h10）。在本研究中，结合凝胶位移分析、突变分析和转染分析，已用于确定hTERC公司基因表达。

NF-Y转录复合物与hTERC CCAAT盒相互作用，这种相互作用是hTERC转录效率的核心

EMSA用于确定细胞蛋白是否与转录起始位点上游的CCAAT盒相互作用。从HeLa细胞系中提取的蛋白质与对应于野生型h的放射性标记寡核苷酸一起使用TERC公司CCAAT盒序列（h10）。鉴定出一种蛋白-DNA复合物(图2一,车道1)竞争研究证实了结合的特异性。野生型寡核苷酸本身和CCAAT盒外突变的寡核苷酸（h10m2）的竞争消除了复合物(图2一,车道2和4). 相比之下，CCAAT盒（h10m1）内突变的寡核苷酸无法竞争蛋白质结合(图2一,车道3).

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（a） 识别与CCAAT盒结合的核蛋白。HeLa核提取物与放射性标记的寡核苷酸探针混合，用EMSA分析。左侧箭头表示特定的DNA-蛋白质复合物。通过与抗体预孵育而超移位的复合物显示在右侧，箭头标记为“ss”。寡核苷酸h10用作探针，用作竞争物的寡核苷酸显示在泳道2至8的顶部。超移中使用的抗体显示在9至14号车道上方。（b） NF-YA显性负突变体NF-YAm29抑制hTERC启动子活性。用定量hTERC-荧光素酶质粒hProm176转染5637细胞，并增加NF-YAm29显性负载体（黑柱）或野生型NF-YA载体（浅灰色柱）的浓度。对于每次转染，显示了重复样品的平均值和标准偏差。（c） CCAAT箱的功能分析。通过转染膀胱癌细胞系5637，检测突变CCAAT盒结构（hProm176h10m1）和缺失CCAAT框的较短启动子结构（hProm120）的启动子活性，并与野生型启动子活性（hProm 176）进行比较。构建物的启动子活性显示为野生型启动子的荧光素酶活性百分比。pSEAP2-控制载体被用作转染效率的内部对照。

确定h的可能成分TERC公司研究了三种候选CCAAT结合复合物；NF-Y（也称为CBF和CP1）、c/EBP和NF-1。两种公认的NF-Y寡核苷酸（称为NF-Y和CBF）能够竞争hTERC公司CCAAT绑定(图2一,车道5和6)，而c/EBP和NF-1的共有寡核苷酸没有(7号和8号车道). 抗体超位移分析显示TERC公司CCAAT结合复合物包含NF-Y蛋白复合物的两个亚单位，即NF-YA和NF-YB。将核提取物与对NF-Y复合物的三种组分NF-YA、NF-YB和NF-YC特异性的抗体以及对其他CCAAT结合复合物c/EBP和NF-1特异性的抗体预孵育。只有对NF-Y复合物成分NF-YA和NF-YB的抗体才能观察到CCAAT复合物的破坏和超移位(10号和11号车道). NF-Y的NF-YC亚单位的抗体没有破坏复合物(12号车道). 这已被其他人观察到，可能是由于C亚单位在复合物形成上无法获得抗体所致[12]. NF-1和c/EBP抗体对复合物的形成没有影响(13和14车道).

评估NF-Y复合物形成在脑缺血后的功能意义TERC公司启动子，我们在转染实验中使用了NF-YA的显性阴性突变体（NF-YAm29）[13]. 如所示图2b条，共转染NF-YAm29特异性抑制hTERC公司启动子活性是剂量依赖性的5到7倍，而野生型NF-YA亚基的共转染对启动子活性没有影响。这些结果证实，NF-Y是促进h交易的主要因素TERC公司通过CCAAT框启动。CCAAT盒的功能意义及其与NF-Y的相互作用也通过在基础启动子区引入突变而得到证实。将其克隆到荧光素酶报告子结构中（hProm176-h10m1）。类似地，产生了一个5′端缺失56-bp的启动子结构，包括CCAAT盒区（hProm120）。通过转染膀胱癌细胞系5637来检测突变和缺失CCAAT盒构建物的启动子活性，并与野生型启动子活性进行比较。CCAAT盒序列元素的突变或删除完全消除hTERC公司启动子活性(图2c（c）)，表明该元素是h活化剂的作用位点TERC公司启动子活性与h的中心TERC公司转录效率。

Sp1和Sp3转录因子与hTERC启动子内多个位点相互作用并能调节启动子活性

鉴定与h中四个假定的Sp1位点相互作用的细胞蛋白TERC公司启动子EMSA用三个寡核苷酸进行(图1b条：h9、h4和h11）跨越四个站点(图1一和b条). Sp1和Sp3结合的蛋白质复合物特征[14]所有三种寡核苷酸(图3一,车道1、5和10). 为了确认与Sp1位点结合的蛋白质的身份，核提取物与转录调节因子Sp1和Sp3的抗体以及Ets2和Ap2的特异性对照抗体预先孵育。只有当用抗Sp1和Sp3的抗体进行预培养时，才能观察到复合物形成的特异性破坏(图3一,车道2、3、6、7、11、12和13). 这表明转录因子的Sp家族参与了hTERC公司基因表达。为了验证这一假设，将Sp1和Sp3的表达载体共转染到5637个细胞中，其中TERC公司-荧光素酶结构。图3b条证明了Sp1对启动子的剂量依赖性激活和Sp3的剂量依赖抑制。

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（a） 识别与Sp1位点结合的核蛋白。HeLa核提取物与放射性标记的寡核苷酸探针混合，用EMSA分析。通过核提取物与Sp1、Sp3特异性抗体或Ets2和Ap2特异性对照抗体的预孵育，鉴定与探针结合的蛋白质。Sp1和Sp3特有的复合物显示在面板左侧。使用的抗体如图顶部所示。（b）Sp1转录因子上调而Sp3转录因子下调hTERC启动子。将野生型hTERC-荧光素酶质粒与越来越多的Sp1或Sp3表达载体（0.25µg至2.0µg）共同转染到5637细胞系中。蛋白质和转染效率标准化的平均萤光素酶活性用重复样品的标准偏差表示。

视网膜母细胞瘤基因产物激活hTERC启动子

pRb被认为在正常转录调控和正常死亡细胞向永生癌细胞的进展中具有重要作用[2,15]. pRb调节h的能力TERC公司因此，对启动子进行了评估。pRb/p53阴性膀胱细胞系5637与固定量的hTERC公司-荧光素酶质粒和增加数量的pRb表达载体。图4一表明pRb的表达是h的剂量依赖性激活物TERC公司发起人。研究h的转录激活TERC公司更详细地说，由卖方开发的一系列pRb变体等。[16]已使用。变异体Δ663和661W不能结合E2F，因此不会引起细胞周期阻滞，但它们保留了激活基因转录的能力。变异体Δ657是pRb的空突变，它不能结合E2F，也不能激活基因转录[16]. 从中可以看出图4b条，h的转录激活TERC公司pRb的启动子并不依赖E2F结合，因为可以观察到具有转录激活能力但不能结合E2F（Δ663和661W）的变体。pRb（Δ657）的空突变，在Sellers使用的分析中无法结合E2F或激活基因转录等。，同样无法激活hTERC公司发起人。pRb激活h的特异性TERC公司通过比较人类和小鼠端粒酶RNA基因启动子来测试启动子，在序列水平上，它们没有明显的同源性[8]. 从中可以看出图4一，小鼠启动子对pRb没有反应，因此表明小鼠和人类端粒酶RNA基因的调节存在功能差异。此外，通过将含有CCAAT盒（hProm120）突变的hTERC启动子结构与pRb共转染，证实了pRb激活hTERC的特异性。如所示图2C，CCAAT盒突变取消启动子活性。在突变的CCAAT盒存在的情况下，pRb的表达无法激活hTERC启动子活性，从而证实pRb激活对野生型启动子的功能特异性（数据未显示）。

物种间TERC基因转录调控的功能差异

尽管不同物种间端粒酶的功能保持不变，但小鼠和人类之间的端粒酶调节可能存在根本性差异[8,17]. 为了更清楚地了解端粒酶RNA基因的调控，在瞬时转染实验中比较了人类、小鼠和牛端粒酶RNA基因启动子对转录调节物pRb、NF-Y、Sp1和Sp3的反应。牛端粒酶RNA基因启动子包含在本研究中，因为它在序列上与人类基因更密切相关，因此可能在分析启动子功能方面有价值[11]. 人类野生型启动子结构如所示图4是全长867-bp质粒，hProm867[8]以便比较每个物种的全长启动子。小鼠端粒酶（mTerc公司)使用的启动子荧光素酶构建物为mProm628[8]，以及包含牛端粒酶RNA基因启动子序列（bTERC公司)按照材料和方法一节中的详细说明进行构造。

物种间存在显著的功能差异；人和牛的启动子被pRb激活，而小鼠的启动子则没有(图4c（c）). Sp1激活所有三个启动子，Sp3抑制所有三个发起子。有趣的是，NF-Y调控似乎是针对人类启动子的。

讨论

端粒酶的重新激活几乎是致癌过程中的普遍事件。虽然酶的最佳功能涉及其他蛋白质，但RNA亚基和催化蛋白质组分足以重建酶的活性。与此相一致，这两种成分在大多数癌症中都有高水平表达。在本研究中，几个因素能够调节hTERC公司细胞培养中的启动子活性已被鉴定，从而为深入研究h的可能分子机制提供了线索TERC公司正常细胞中的基因调节及其在癌细胞中的失调。然而，调节正常表达和抑制的机制可能不同于肿瘤发生中表达抑制和激活的丧失。

本研究表明，CCAAT盒对基本启动子功能至关重要。我们已经证明，这可以通过NF-Y复合物来识别，抑制NF-Y活性会消除启动子活性。NF-Y是一种由NF-YA、NF-YB和NF-YC三个亚基组成的异聚蛋白[18]. NF-Y活性在衰老过程中以及对诱导剂的反应中发生变化[18,19]. 它结合并控制许多细胞周期调节的启动子，可能直接参与肿瘤发生[18,20,21]. NF-Y可能通过改变启动子结构发挥其作用。染色质结构可以限制转录相关蛋白进入启动子，组蛋白乙酰化是对抗染色质介导的阻遏作用的主要机制。NF-Y能够与核小体结合，并抑制核小体的形成在体外模型[22]. 它还可以与组蛋白乙酰转移酶、p300、GCN5和P/CAF相互作用[12,23,24]并可能提供一种针对特定发起人的方法。NF-Y也被证明可以增加结构无关的激活物（包括Sp1）对其结合位点的亲和力[25–27]. 研究端粒酶基因在发育、死亡和永生细胞中的调控是否与染色质结构有关，如果是，这是否由NF-Y介导，将很有意义。

Sp1和Sp3只是哺乳动物类Kruppel-like转录因子家族中的两个成员，它们结合富含GC的序列元素，参与组织特异性和管家基因的调控。Sp蛋白与细胞周期调控、染色质建模和无甲基化岛的维持有关[14]. 此外，Sp1基因敲除表明，Sp1是小鼠早期发育所必需的[14]. Sp蛋白家族的转录调控是复杂的，但通常Sp1激活基因表达，而Sp3抑制基因表达[14,28]. 我们已经确定了h内的Sp蛋白结合位点TERC公司发起人。我们已经证明，Sp1和Sp3可以与这些位点结合，Sp1激活而Sp3抑制基因表达。因此，Sp1/Sp3比率的波动或其相对结合亲和力的改变可以调节表达体内这一点具有特别重要的意义，因为最近已证明Sp1可激活人类端粒酶蛋白组分启动子（hTERT（地形）) [29]因此，我们确定了一个重叠的、但不一定是协同的控制机制。

我们发现pRb是h的激活剂TERC公司该启动子具有众所周知的抑癌功能，这让人有些惊讶。蛋白质Rb通过与E2F转录家族成员形成复合物，负调控许多在细胞周期进展中起作用的基因的转录。然而，pRb在正常发育中也有重要作用TERC公司高表达，pRb协同激活包括TGF-β在内的许多基因的能力2视网膜母细胞瘤基因本身、细胞周期蛋白D1和沃纳解旋酶基因得到了很好的描述[15,16,30–34]. pRb如何激活转录尚不完全清楚，但与卖方的结果一致等。pRb激活h的能力TERC公司启动子独立于其结合E2F的能力。Rb蛋白尚未被证明能直接与它激活的启动子结合[35]虽然某些序列元件已被确定参与其他启动子的pRb调节[30,36]. pRb可能通过隔离其他转录因子的抑制剂发挥作用[37]. h的标识TERC公司pRb激活的另一个基因可能有助于研究pRb功能的这一方面。

pRb激活h的功能意义TERC公司鉴于pRb信号转导通路的某些部分在癌症中的功能障碍非常常见，肿瘤发生的启动子尚不清楚。然而，pRb本身的完全丢失相对罕见，甚至RB-1中的某些种系突变也可能导致E2F结合蛋白缺陷，但仍保留激活转录的能力[16]. 此外，我们已经证明pRb是启动子活性的调节剂，但它对转录并不重要。有人可能会预测，当癌细胞失去pRb-反式激活功能时，对减少的hTERC公司可能发生启动子活性。的确，hTERC公司基因可以在人类癌症中扩增[38]. 这可能是为了增加h而选择的TERC公司在没有积极调节影响（如pRb）或滴定出消极调节因子（如Sp3）的情况下表达。

端粒酶酶功能在物种间是保守的，但与人类相比，在小鼠中高表达的物种之间的基因表达存在显著差异[39,40]. 我们已经证明人类和小鼠的调节存在显著差异TERC公司基因。这也许并不奇怪，因为这两个启动子没有显示出明显的序列同源性[8]尤其是，位于转录起始位点和模板区域之间的人和牛启动子片段在小鼠启动子中缺失。的系统发育分析TERC公司陈描述的几个物种的序列等。[41]研究表明，其他啮齿类动物也没有这个区域。启动子的这一部分是否对物种变异负责尚待调查。在研究发育和疾病状态的动物模型中的端粒酶时，需要考虑物种间端粒酶RNA基因调控的差异[17].

结论

我们的研究结果表明，包括Sp1、Sp3、pRb和NF-Y在内的多种信号能够对hTERC公司基因表达。因此，细胞中Sp1、Sp3、pRb和NF-Y的相对贡献的改变，或信号转导特异性的方式，可能与hTERC公司基因表达。这些信息为旨在揭示癌细胞如何重新激活或上调hTERC公司基因表达。此外，对h的分子基础的理解TERC公司基因调控在调控端粒酶表达方面可能具有价值，例如在与年龄相关的疾病中，以及在开发合理的治疗方法以通过开发h来治疗癌症方面TERC公司基因转录[6,8].

致谢

我们感谢William Kaelin，Jr.博士和Robert White博士提供的pRb表达载体，Roberto Mantovani博士提供的NF-Y表达载体和抗体，Guntram-Suske博士提供的Sp1和Sp3表达载体，以及L.Bryce博士对手稿的批判性阅读。

缩写

EMSA公司电泳迁移率漂移分析

脚注

1这项工作得到了癌症研究运动（英国）和格拉斯哥大学的支持。

工具书类

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文章来自肿瘤（纽约）由以下人员提供肿瘤出版社