临床投资杂志。2002年10月15日；110(8): 1083–1091.
小鼠caspase-1和IL-18介导的缺血性急性肾小管坏死的中性粒细胞依赖性机制
,1 ,1 ,1 ,2 ,2和1
维亚切斯拉夫·梅尔尼科夫
1医学部，以及2美国科罗拉多州丹佛市科罗拉多大学医学院病理学系
莎拉·福贝尔
1医学部，以及2美国科罗拉多州丹佛市科罗拉多大学医学院病理学系
布丽塔·西格蒙德
1医学部，以及2美国科罗拉多州丹佛市科罗拉多大学医学院病理学系
斯科特·卢西亚（M.Scott Lucia）
1医学部，以及2美国科罗拉多州丹佛市科罗拉多大学医学院病理学系
达尼卡·柳巴诺维奇
1医学部，以及2美国科罗拉多州丹佛市科罗拉多大学医学院病理学系
查尔斯·埃德尔斯坦
1医学部，以及2美国科罗拉多州丹佛市科罗拉多大学医学院病理学系
1医学部，以及2美国科罗拉多州丹佛市科罗拉多大学医学院病理学系
通信地址：Charles L.Edelstein，科罗拉多大学医学院肾脏疾病和高血压科，邮箱C281，4200 East 9th Avenue，Denver，Colorado 80262，USA电话：（303）315-8764；传真：（303）315-4852；电子邮件：ude.cshcu@nietslede.selrahC. 2002年4月5日收到；2002年8月20日接受。
摘要
最近描述了caspase-1介导的促炎细胞因子IL-18在缺血性急性肾衰竭（ARF）中的损伤作用，我们在此报道了新开发的caspase抑制剂喹啉-Val-Asp（Ome）-CH的作用2-OPH（OPH-001）对缺血性ARF中caspase-1、IL-18、中性粒细胞浸润和肾功能的影响。与经口服OPH-001治疗的缺血性ARF C57BL/6小鼠相比，其血尿素氮（BUN）和血清肌酐显著降低（100%），形态学急性肾小管坏死（ATN）评分显著降低。OPH-001显著降低缺血ARF期间caspase-1活性和IL-18的增加，并防止中性粒细胞浸润肾脏。为了评估中性粒细胞浸润的缺乏是否有助于预防缺血性ARF，建立了中性粒细胞耗竭模型。在缺血性ARF期间，中性粒细胞耗竭的小鼠血清肌酐略有降低（18%），但尽管肾脏中缺乏中性粒细胞浸润，但ATN评分没有降低。值得注意的是，患有ARF的中性粒细胞缺失小鼠肾脏中的caspase-1活性和IL-18显著增加。此外，IL-18抗血清治疗的患有缺血性ARF的中性粒细胞缺失小鼠的血清肌酐显著降低（75%），ATN评分显著降低（与车辆治疗的中性粒分子缺失小鼠相比）。这些结果提示了IL-18介导的缺血性ARF的一种新的中性粒细胞依赖机制。
引言
半胱天冬酶是一类细胞内半胱氨酸蛋白酶。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶参与两种不同的信号通路：（a）通过半胱氨酸蛋白酶-1（以前称为IL-1β-转化酶，或ICE）激活促炎细胞因子，（b）通过半胱天冬酶-3促进凋亡细胞死亡。目前有大量证据表明，半胱天冬酶也参与了体外坏死细胞死亡。胱天蛋白酶的抑制可防止培养中肾小管缺氧诱导的坏死细胞死亡(1)和新分离的大鼠近端小管(2). 在急性肾小管坏死（ATN）大鼠肾脏中，caspase-1和caspase-3 mRNA和蛋白表达(三)以及caspase-3活性(4)增加了。半胱氨酸蛋白酶抑制减轻小鼠缺血性急性肾功能衰竭（ARF）远端小管凋亡和炎症(5). 然而，caspase抑制剂对ATN的影响尚不清楚，ATN是缺血性ARF动物模型和人类移植后ARF的主要病理过程。因此，在近端小管体外caspase抑制剂研究和肾脏体内研究的背景下，我们确定了新开发的caspase抑制物喹啉-Val-Asp（Ome）-CH的作用2-OPH（OPH-001）对小鼠缺血性ARF功能和形态的影响。虽然caspase缺陷小鼠的使用提供了关于单个caspase在疾病过程中的作用的广泛信息，但体内对caspase抑制剂的研究是朝着caspase抑制可能的治疗效果迈出的重要一步。
促炎性caspase-1在IL-1β前体和IL-18前体的裂解中起主要作用。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1对IL-1β和IL-18（IFN-γ-诱导因子）的前体具有显著的特异性，通过在每个促细胞因子中进行单个初始切割，导致活性成熟细胞因子分泌到细胞外空间(6). 我们已经证明caspase-1缺陷小鼠在功能和组织学上对缺血性ARF具有保护作用，并且这种保护作用与肾脏中IL-18前体转化为成熟形式的减少有关(7). 在这项研究中，IL-18中和抗血清对缺血性ARF具有保护作用，证实了IL-18在缺血性ARF发病机制中的有害作用。caspase-1缺陷小鼠和使用IL-18中和抗血清治疗的小鼠在缺血性ARF期间均减少了肾脏中性粒细胞浸润。
中性粒细胞在ARF发病机制中的作用仍存在争议。最近开发了一种使用特定中性粒细胞耗竭单克隆抗体RB6-8C5的小鼠中性粒细胞消耗模型(8). 我们在小鼠中复制了缺血性ARF中性粒细胞耗竭的模型。在本研究中，我们使用半胱氨酸蛋白酶抑制剂、IL-18中和抗血清和中性粒细胞缺失小鼠来测试以下假设：半胱氨酸酶抑制可防止缺血性ARF，并且在没有中性粒细胞的情况下，半胱氨酸天冬酶-1介导的IL-18生成可诱导缺血性ARF。
方法
缺血方案。
所有小鼠研究均使用C57BL/6小鼠（美国缅因州巴尔港杰克逊实验室）。通过腹腔注射Avertin（2,2,2-三溴乙醇；美国威斯康星州密尔沃基Sigma-Aldrich）麻醉体重为20–25 g的小鼠。做一个中线切口，用微动脉瘤夹将肾蒂双侧夹住22分钟。选择缺血时间以获得可逆的缺血ARF模型并避免动物死亡。血清肌酐在再灌注24-48小时达到峰值，然后在3-7天内逐渐恢复正常。22分钟后，取下夹钳。观察肾脏的血流恢复情况，结果显示肾脏恢复了原来的颜色。腹部分两层闭合。假手术包括相同的手术程序，只是没有使用夹钳。在再灌注期的前24小时内，动物被保存在29°C的培养箱中。在单独的实验中，在肾再灌注24、48和72小时时通过心脏穿刺获得血液样本。使用BUN和肌酸酐自动分析仪（Beckman Instruments Inc.，Fullerton，California，USA）测量血尿素氮（BUN）和血清肌酸酐。
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制。
喹啉-Val-Asp（Ome）-CH2-OPH[Q-VD-（Ome）-OPH]来自酶系统产品公司（美国加利福尼亚州利弗莫尔）。抑制剂（120 mg/kg）或载体（高纯度二甲基亚砜；Sigma-Aldrich，St.Louis，Missouri，USA）在肾蒂夹持前60分钟腹腔注射。
OPH-001是新一代广谱半胱天冬酶抑制剂。与基准caspase抑制剂Z-Val-Ala-Asp（Ome）-CH相比2F（Z-VAD-FMK），在结构设计上有显著差异。这些变化包括用喹啉衍生物（Q）取代羧苯氧基阻断基（Z），将VAD三肽序列改性为VD，以及用无毒的2,6-二氟苯氧基（OPH）取代假定有毒的氟甲基酮（FMK）。作用机制包括抑制剂中的天冬氨酸衍生物与半胱氨酸天冬氨酸酶活性位点半胱氨酸之间形成不可逆的硫醚键，从而取代2,6-二氟苯酚基团。
组织学检查。
用4%多聚甲醛固定、石蜡包埋的肾脏在4μm处切片，并用标准方法用苏木精、曙红和周期性酸雪花染色。肾脏病理学家以盲法进行组织学检查。通过计算显示细胞坏死、刷状缘丢失、铸型形成和肾小管扩张的肾小管百分比来量化肾小管坏死引起的组织学变化，如下所示：0，无；1, ≤10%; 2, 11–25%; 3, 26–45%; 4, 46–75%; 5个，>76%。每张幻灯片至少审查了十个字段（×200）。
肾脏病理学家通过计算每毫米中性粒细胞的数量，以盲法定量评估中性粒细胞浸润2使用校准的眼网，在×400处。在苏木精和伊红染色的玻片上，外髓质中至少有10个视野被计数。
苏木精和伊红染色采用形态学标准计数凋亡细胞。这些特征包括细胞圆形和收缩、核染色质致密和凋亡小体的形成(9). 肾脏病理学家以盲法每10个高倍视野（×400）定量评估凋亡小管细胞。
半胱氨酸天冬氨酸酶活性测定。
如前所述，肾脏中的半胱氨酸天冬氨酸酶活性是通过使用荧光底物测定的(7).
纯化半胱天冬酶的分析如下。纯化的重组caspase-3（Upstate Biotechnology Inc.，Lake Placid，New York，USA）和纯化至同质的重组caspase-1大肠杆菌（来自美国新泽西州拉威市默克研究实验室的Nancy Thornberry）用于计算OPH-001浓度，该浓度将纯化caspase-1或-3浓度抑制50%（IC50). 将重组caspase-1或caspase-3在以下缓冲液中稀释，以将其转化为活性形式：100 mM Na HEPES、10 mM DTT、1 mM EDTA、0.1%3-[（3-胆酰胺丙基）二甲基氨]-1-原-苯磺酸钠（CHAPS）和10%蔗糖。将10毫微克活化的caspase添加到caspase-1或caspase-3分析缓冲液中。caspase-1分析缓冲液含有25 mM K+HEPES、1mM DTT、1mM EDTA、0.1%CHAPS、1mM DTT和10%蔗糖，pH值7.5。caspase-3分析缓冲液含有25 mM K+HEPES、KCl 50 mM、1 mM DTT、0.1%CHAPS和1 mM DTT，pH值7.5。增加浓度的OPH-001添加如下：0μM（仅用于载体）、0.1μM、1μM、10μM、100μM和500μM。预培养10分钟后，加入10μl底物（最终浓度为50μM），使总体积达到200μl。在10%DMSO中的乙酰-Tyr-Val-Ala-Asp-7-氨基-4-甲基香豆素（Ac-YVAD-AMC）被用作胱天蛋白酶-1样蛋白酶的底物。将10%二甲基亚砜中的乙酰基-Asp-Glu-Val-Asp-7-amido-4-methyl香豆素（Ac-DEVD-AMC）用作半胱氨酸蛋白酶-3的底物。
钙蛋白酶和组织蛋白酶B测定。
如前所述，通过使用荧光底物测定钙蛋白酶和组织蛋白酶B的活性(4). 使用来自猪红细胞（Calbiochem-Novabiochem Corp.，加利福尼亚州圣地亚哥，美国）的纯化μ-钙蛋白酶（2.5–5μg）或来自人类肝组织（BIOMOL Research Laboratories Inc.，美国宾夕法尼亚州普利茅斯会议）的纯化组织蛋白酶B（0.3–0.6μg）计算IC50用于OPH-001。N个-二甲基亚砜中的琥珀酰-Leu-Tyr-7-氨基-4-甲基香豆素（Sigma-Aldrich）用作钙蛋白酶的底物。使用DMSO中的Z-Phe-Arg-AMC（肽研究所，日本大阪）作为组织蛋白酶B的底物。
肾组织中组织蛋白酶B的检测方法如下。简单地说，将肾组织与裂解缓冲液混合，并在玻璃-聚四氟乙烯均质器中进行十次均质。然后在4°C和100000℃下离心裂解液克在Beckman Instruments Inc.Ti70转子中放置1小时。如上所述，对所得上清液（100μg蛋白质）进行组织蛋白酶B检测。
IL-18的电化学发光分析。
如前所述，对全肾匀浆中的IL-18进行电化学发光（ECL）分析(10). ECL分析检测前IL-18和成熟IL-18。
兔抗鼠IL-18中和抗血清。
兔抗鼠IL-18中和抗血清是从一只新西兰兔身上获得的，该新西兰兔通过在亨特效价佐剂存在下皮内注射鼠重组IL-18免疫(6). IL-18抗血清已在小鼠体内用于阻断内源性IL-18(10). 兔抗鼠IL-18中和抗血清或载体（正常兔血清）按如下方式给药：肾蒂夹持前40分钟腹腔注射300μl，夹持释放前腹腔注射100μl。
中性粒细胞耗竭模型。
在肾蒂夹持前24小时，向小鼠腹腔注射0.1 mg大鼠IgG2b mAb RB6-8C5（BD Pharmingen，San Jose，California，USA）(8). 这会导致缺血性ARF期间外周血和肾脏中性粒细胞的耗竭（见结果）。
髓过氧化物酶测定。
如前所述测量髓过氧化物酶（MPO）活性（动力学分析），并进行修改(11).
近端小管的制备。
使用胶原酶消化和Percoll离心法从雄性C57BL/6小鼠肾皮质分离近端小管(2). 将6毫升等分小管悬浮液（约1-2 mg/ml）置于硅化的25 ml锥形烧瓶中。为了产生缺氧，在95%N的摇晃水浴中对小管悬浮液进行充气2–5%一氧化碳2以3 l/min的速率，在缺氧期结束时，取1 ml小管悬浮液进行乳酸脱氢酶（LDH）测定，2 ml进行免疫印迹。LDH释放到小管培养基中被用作细胞膜损伤的指标。
蛋白质印迹分析。
肾皮质或近端小管在放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液中均质化，并使用前面描述的标准方案进行蛋白质印迹(4). 使用山羊抗IL-18多克隆抗体（美国加利福尼亚州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司；1:100）。
统计分析。
非正态分布数据通过非参数非配对Mann-Whitney检验进行分析。Newman-Keuls表示，使用方差分析和后验进行多组比较。A类P（P）小于0.05的值被认为具有统计学意义。数值以平均值±SE表示。
结果
用OPH-001治疗的小鼠不会出现功能性缺血性ARF。
在诱导缺血性ARF之前，用载体（DMSO）或OPH-001（120 mg/kg）治疗小鼠。在诱导ARF之前接受OPH-001治疗的小鼠在再灌注24小时时，与缺血ARF的车辆治疗小鼠相比，血清肌酐降低了100%，并且血清肌酐水平与假手术对照组相似（图). 在再灌注48小时时，OPH-001处理的小鼠仍能完全抵抗缺血ARF（图). 再灌注72小时后，车用治疗小鼠的肾功能恢复正常，证实了这种缺血性ARF模型的可逆性（图). 在再灌注24小时时，BUN表现出类似的模式。错误操作对照组小鼠的BUN（mg/dl）为24±0.7，车辆治疗缺血性ARF组小鼠为102.4±13(P（P）与假手术相比<0.001，n个=6–8），在OPH-001治疗的缺血性ARF小鼠中为36±4(P（P）<0.01 vs.车用治疗缺血性ARF，[NS]vs.假手术组无显著性差异，n个= 6–8). 选择120 mg/kg OPH-001剂量，因为与40 mg/kg和80 mg/kg相比，它提供了最佳的功能保护。
OPH-001治疗的小鼠在功能上对缺血性ARF具有保护作用。在患有缺血性ARF的车辆治疗小鼠中，与非手术对照组相比，再灌注24小时和48小时时血清肌酐显著升高。在诱导缺血性ARF前用OPH-001治疗的小鼠中，与假手术对照组相比，血清肌酐在再灌注24小时和48小时时恢复正常*P（P）<0.01 vs.假手术**P（P）<0.01 vs.车用ARF，NS vs.假手术；n个24小时=8。+P（P）<0.05 vs.假手术；++P（P）<0.05 vs.车用ARF，NS vs.假手术；n个48小时和72小时时为6。车辆，车辆。
假手术小鼠的ATN评分为0，表示没有肾小管坏死（图). 患有ARF的车辆治疗小鼠的平均ATN评分为4.7，表示46-75%的小管坏死（图). 在诱导ARF之前用OPH-001治疗的小鼠的平均ATN评分为1.8，表示11%-25%的小管发生肾小管坏死（图). 肾脏组织病理学如图所示、a和b。
经OPH-001治疗的小鼠在组织学上可抵抗缺血性ARF。在诱导缺血前接受OPH-001治疗的小鼠与接受车辆治疗的小鼠相比，ATN评分显著降低*P（P）<0.001 vs.假手术**P（P）<0.001 vs.车用ARF；n个=6。
肾脏组织病理学（至少三个实验的可比切片和代表性图片）。(一)在患有缺血性ARF的车辆治疗小鼠中，外髓质外条纹中的近端小管显示出广泛损伤，上皮细胞坏死，局部剥落。偶尔有凋亡细胞（箭头所示）。坏死小管（箭头）周围的间质中有大量中性粒细胞团块。(b条)在患有缺血性ARF的OPH-001治疗小鼠中，肾小管基本上完好无损，只有肾小管细胞质局部脱落，刷状缘损失最小。中性粒细胞不明显。(c（c）)在患有缺血性ARF的中性粒细胞缺失小鼠中，外髓质外条纹中的近端小管显示出广泛损伤，上皮细胞坏死和脱落。中性粒细胞不明显，但仍有广泛的肾小管坏死。(d日)在用IL-18中和抗血清治疗的中性粒细胞缺失小鼠中，肾小管坏死较少。小管大部分完好无损，只有管状细胞质局部脱落。中性粒细胞不明显。
OPH-001抑制缺血ARF期间caspase-1活性、IL-18蛋白表达和中性粒细胞浸润。
OPH-001抑制了缺血ARF期间全肾匀浆中caspase-1活性的增加（图a） ●●●●。通过ECL测定肾匀浆中的IL-18蛋白。与假手术对照组小鼠相比，车用治疗的缺血性ARF小鼠的IL-18蛋白增加（图b） ●●●●。OPH-001治疗的缺血性ARF小鼠的IL-18蛋白与使用车辆治疗的缺血ARF小鼠相比显著降低（图b） ●●●●。
OPH-001治疗的小鼠caspase-1活性降低(一)，IL-18蛋白(b条)中性粒细胞浸润(c（c）)在患有缺血性ARF的小鼠肾脏中。(一)与车用处理小鼠相比，OPH-001导致caspase-1活性正常化*P（P）<0.05 vs.假手术**P（P）<0.05 vs.车用ARF，NS vs.假手术；n个= 4. (b条)IL-18蛋白（ECL测定）在缺血性ARF中升高。与车辆处理小鼠相比，OPH-001导致IL-18正常化*P（P）<0.01 vs.假手术**P（P）<0.01 vs.车用ARF，NS vs.假手术；n个= 4. (c（c）)中性粒细胞浸润（中性粒细胞/mm2)在车用治疗的缺血性ARF小鼠中增加，而在OPH-001治疗的缺血性AR小鼠中预防*P（P）<0.01 vs.假手术**P（P）<0.01 vs.车用ARF，NS vs.假手术；n个=5。
由于OPH-001同时抑制胱天蛋白酶-1和IL-18，这两种物质都是促炎的，因此确定了其对缺血性ARF炎症的影响。OPH-001治疗的小鼠缺血ARF中MPO活性降低。假手术对照组小鼠的MPO活性（OD/min/mg）为0.003±0.2，缺血性ARF车辆治疗组为0.056±0.012(P（P）<0.5 vs.假手术，n个=4）和0.018±0.005（OPH-001治疗的缺血性ARF小鼠(P（P）与车用治疗的缺血性ARF相比，<0.05，n个= 4).
由于MPO活性可识别单核细胞、巨噬细胞以及中性粒细胞的活性，因此对中性粒细胞在肾脏中的浸润进行了定量(12). 中性粒细胞浸润（中性粒细胞/mm2)假手术动物的外髓质为4.3±0.9，车辆治疗的缺血性ARF小鼠为594±199(P（P）<0.01 vs.sham）和10.8±4（OPH-001治疗的缺血性ARF小鼠(P（P）<0.01 vs.车用治疗缺血性ARF，NS vs.假手术（图c） ●●●●。因此，在患有缺血性ARF的小鼠中，中性粒细胞浸润增加了100倍以上，OPH-001完全阻止了缺血性ARF期间肾脏中性粒细胞的浸润增加。
中性粒细胞耗竭小鼠模型。
在肾蒂夹持前24小时，向小鼠腹腔注射0.1 mg大鼠IgG2b mAb RB6-8C5（BD Pharmingen）或载体（无菌水）(8). 单克隆抗体会在24小时内耗尽外周血中的中性粒细胞。车辆治疗的小鼠外周血中性粒细胞的差异计数为77%±1.9%，使用单克隆抗体RB6-8C5治疗的小鼠的外周血嗜中性粒细胞差异计数为0.8%±0.3%(P（P）<0.0001 vs.未经治疗，n个= 12).
中性粒细胞缺失小鼠的缺血性ARF。
在中性粒细胞缺失小鼠中诱导缺血性ARF。假手术对照组小鼠的血清肌酐（mg/dl）为0.27±0.03，缺血性ARF车用治疗组小鼠的肌酐为2.2±0.07(P（P）<0.001 vs.sham）和1.8±0.12（在患有缺血性ARF的中性粒细胞缺失小鼠中(P（P）<0.05 vs.野生型缺血性ARF，P（P）<0.001 vs.sham）（图a） ●●●●。
中性粒细胞缺失小鼠对缺血性ARF有轻微的功能保护(一)并且在组织学上对缺血性ARF没有保护作用(b条). (一)车辆治疗的缺血性ARF（中性粒细胞）小鼠的血清肌酐增加+). 患有缺血性ARF的中性粒细胞缺失小鼠（中性粒细胞–)与中子相比，血清肌酐略有下降+老鼠*P（P）<0.001 vs.假手术**P（P）<0.05 vs.中子+ARF、，P（P）<0.001 vs.假手术；n个=8。(b条)髓质外侧ATN的组织学评分与中性粒细胞相同+如中子–老鼠*P（P）<0.001 vs.假手术**P（P）<0.001 vs.sham，NS vs.neutro+;n个= 7. 尽管在患有缺血性ARF的小鼠肾脏中防止了中性粒细胞浸润，但仍然缺乏保护，如图所示c。
车用治疗的缺血性ARF小鼠和中性粒细胞缺失的缺血ARF小鼠的ATN评分均较高（图b） ●●●●。肾组织病理学显示，在缺乏中性粒细胞的情况下，外髓质出现广泛的肾小管坏死，如图所示c。
中性粒细胞缺失小鼠缺血ARF期间Caspase-1活性、IL-18蛋白表达和中性粒细胞浸润。
在缺血性ARF期间，全肾匀浆中Caspase-1活性增加（图a） ●●●●。中性粒细胞缺失小鼠缺血ARF中的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1活性与车用小鼠相同（图a） ●●●●。IL-18蛋白通过ECL测定。与假手术对照组小鼠相比，车用治疗的缺血性ARF小鼠的IL-18蛋白增加（图b） ●●●●。患有ARF的中性粒细胞缺失小鼠的IL-18显著高于假手术小鼠，而IL-18则低于携带ARF的车辆治疗小鼠（图b） ●●●●。
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1活性(一)，IL-18蛋白(b条)中性粒细胞浸润(c（c）)和IL-18的活性形式(d日)在患有缺血性ARF的中性粒细胞缺失小鼠的肾脏中。(一)两种载体处理（中子）的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1活性均增加+)中性粒细胞缺失（中性粒细胞–)ARF小鼠*P（P）<0.001 vs.假手术**P（P）<0.001 vs.sham，NS vs.neutro+;n个= 5. (b条)通过检测前IL-18和活性IL-18的ECL分析测定IL-18蛋白。中性粒细胞缺血ARF中IL-18增加+以及中子–患有缺血性ARF的小鼠与病态对照组的比较。IL-18在中子中较高+小鼠比中微子–老鼠*P（P）<0.001 vs.假手术**P（P）与假手术相比<0.01，P（P）与中性粒细胞相比<0.01+;n个= 11. (c（c）)中性粒细胞浸润（中性粒细胞/mm2)缺血ARF中微子增加+并在中子中被阻止–患有缺血性ARF的小鼠*P（P）<0.01 vs.假手术**P（P）与赋形剂治疗的ARF、NS与假手术相比<0.01；n个= 7. (d日)中性粒细胞中全肾匀浆中活性IL-18蛋白（18kDa）的免疫印迹分析无差异+与中子–患有缺血性ARF的小鼠。重组小鼠IL-18（PeproTech Inc.，Rocky Hill，New Jersey，USA）用作阳性对照（Pos）。图中显示了三个独立实验的代表性图片。
ECL分析检测前IL-18和活性IL-18。因此，在全肾匀浆中进行IL-18活性形式（18kDa）的免疫印迹。患有缺血性ARF的中性粒细胞缺失的肾脏与正常肾脏中活性IL-18蛋白的数量没有差异，证实了中性粒细胞依赖性的活性IL-8来源（图d） ●●●●。
中性粒细胞浸润（中性粒细胞/mm2)假手术小鼠的外髓质为5±0.2，车用ARF小鼠为273±34(P（P）<0.01 vs.sham），以及6±1.9（在患有缺血性ARF的中性粒细胞缺失小鼠中(P（P）<0.01 vs.缺血性ARF，NS vs.假手术）（图c） ●●●●。因此，中性粒细胞耗竭，如OPH-001，阻止了缺血性ARF期间肾脏中性粒细胞浸润的增加。
IL-18–中和抗血清保护中性粒细胞缺失小鼠对抗缺血性ARF。
为了研究IL-18介导损伤的中性粒细胞依赖性机制，用IL-18中和抗血清治疗中性粒细胞缺失小鼠。用IL-18中和抗血清治疗的患有缺血性ARF的中性粒细胞缺失小鼠在再灌注24小时时，与患有ARF的载体治疗中性粒细胞缺乏小鼠相比，血清肌酐降低了75%（图a） ●●●●。白细胞介素18中和抗血清治疗的患有缺血性ARF的中性粒细胞缺失小鼠外髓质中ATN的组织学评分显著低于患有缺血性ARF的车用中性粒细胞缺乏小鼠（图b） ●●●●。典型的肾脏组织病理学如图所示d。
用IL-18中和抗血清治疗的中性粒细胞缺失小鼠均具有功能性(一)和组织学上(b条)防止缺血性ARF。在肾蒂夹持前24小时向小鼠注射中性粒细胞清除抗体RB6-8C5（中性粒细胞–)然后在肾蒂夹持前40分钟和夹持释放前40分钟注射抗IL-18抗血清或载体。(一)车内中子–患有缺血性ARF的小鼠，与假手术对照组相比，血清肌酐显著增加。中性粒细胞–与ARF小鼠相比，AS小鼠的血清肌酐显著降低*P（P）<0.01 vs.假手术**P（P）<0.01 vs.车用ARF，NS vs.假手术；n个= 8. (b条)车内中子–患有缺血性ARF的小鼠，与病态对照组相比，ATN评分显著增加。中性粒细胞–在诱导缺血性ARF之前用AS治疗的小鼠，与车用中子治疗的小鼠相比，ATN评分显著降低–ARF小鼠*P（P）<0.001 vs.假手术**P（P）与车用ARF相比<0.01；n个= 4.
在其他实验中，在再灌注48小时时测定血清肌酐。与缺血ARF小鼠相比，在肾蒂夹释放前用IL-18中和抗血清治疗的小鼠以及在再灌注24小时时额外腹腔注射300μl的小鼠在再灌注48小时时对缺血ARF没有功能性保护。
IL-18和近端小管。
我们之前已经证明，患有缺血性ARF的小鼠尿液中IL-18增加(7). 因此，我们研究了近端小管作为IL-18的可能来源和靶点。对C57BL/6小鼠新鲜分离的近端小管进行了研究。OPH-001可保护这些小管免受25分钟的缺氧损伤。正常氧小管中LDH释放为11%±1%，与载体（DMSO）预孵育的缺氧小管中为38%±6%(P（P）<0.001与正常氧，n个=6），在用OPH-001（100μM）预孵育的缺氧小管中为22%±1%(P（P）<0.01 vs.缺氧，n个=6）。免疫印迹法(n个=6）的正常毒性近端小管显示存在前IL-18（24kDa）。外源性重组IL-18（每6 ml小管悬浮液1μg）加重了亚致死（12分钟）缺氧性近端小管损伤。正常氧小管中LDH的释放为10%±1%，缺氧小管中与溶媒（生理盐水）预孵育的LDH释放为13%±1%（生理盐水vs.正常氧，n个=6），在缺氧诱导前用重组IL-18预孵育的缺氧小管中为18%±1%(P（P）<0.01 vs.缺氧，n个=6）。进一步研究IL-18在近曲小管缺氧损伤中的作用将很有意义。
OPH-001同时抑制caspase-1和caspase-3。
IC50重组caspase-1的OPH-001测定为6.5μM。IC50OPH-001中重组caspase-3的含量测定为1.0μM。因此，OPH-001是一种体外抑制caspase-1和caspase-3的caspase抑制剂。
为了证实OPH-001在体内也抑制促凋亡的胱天蛋白酶-3，测定了胱天蛋白酶-3的活性和细胞凋亡。在缺血性ARF期间，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3活性增加。OPH-001抑制caspase-3活性的增加。假手术对照组小鼠的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3活性（nmol/min/mg）为9.6±1.7，缺血性ARF车辆治疗组小鼠为31.2±4.6(P（P）<0.01 vs.假手术，n个=4），在OPH-001治疗的缺血性ARF小鼠中为16.5±4.2(P（P）<0.01 vs.车用治疗缺血性ARF，NS vs.假手术，n个= 4). 在假手术对照小鼠中，每10个高倍视野中髓质外侧条纹中凋亡的管状上皮细胞数量为0，在缺血ARF的载体治疗小鼠中为10.6±3.6(P（P）<0.05 vs.假手术，n个=4）和2.7±2.1（OPH-001治疗的缺血性ARF小鼠(P（P）与车用治疗的缺血性ARF相比，<0.05，n个= 6).
OPH-001的特异性。
我们已经确定了OPH-001对半胱氨酸蛋白酶与另外两种主要半胱氨酸蛋白酶（钙蛋白酶和组织蛋白酶B）的特异性，这两种蛋白酶都是细胞死亡的介质。IC50纯化钙蛋白酶的OPH-001为727μM。IC50纯化组织蛋白酶B为218μM。这些值远高于IC50针对上文报道的caspase-1和caspase-3。我们还测量了缺血ARF期间肾脏中组织蛋白酶B的活性。与假手术小鼠相比，患有缺血性ARF的小鼠肾脏中组织蛋白酶B活性没有增加，OPH-001对组织蛋白酶B活性没有影响。假手术对照组小鼠的组织蛋白酶B活性（μmol/min/mg）为51.2±6，车用缺血ARF治疗组小鼠的活性为52±2（NS组与假手术组、，n个=4），OPH-001治疗的缺血性ARF小鼠中53.6±3，n个= 4).
讨论
半胱天冬酶是一类细胞内半胱氨酸蛋白酶，在其活性部位有半胱氨酸残基。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1在激活促炎细胞因子IL-1β和IL-18中起主要作用(6). Caspase-3是“执行者Caspase”，在体内凋亡细胞死亡中起着核心作用。在缺氧缺血性脑损伤动物模型中，体内给予caspase抑制剂可保护细胞免受凋亡损伤(13)冠状动脉闭塞后心肌再灌注损伤(14). 一种新型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂IDN-1965在体内原位肝移植后减少内皮细胞凋亡并延长动物存活时间(15). 因此，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶在脑、心脏和肝脏细胞凋亡导致的器官损伤中的作用已得到充分证实。然而，缺血性ARF动物模型和人类移植后ARF近端小管的主要形态学变化是坏死；因此，术语“急性肾小管坏死”（ATN）(16). 基于caspase是体外缺氧性近端肾小管坏死的介质的研究结果(1,2)并且caspase抑制对其他器官的缺血性损伤具有保护作用，我们研究了caspase抑制剂在缺血性ARF中的作用。在本研究中，我们证明新开发的半胱氨酸蛋白酶抑制剂OPH-001对小鼠缺血性ARF的功能和ATN具有显著的保护作用。因此，与脑、心脏和肝脏缺血器官损伤中caspase介导的凋亡相反，我们描述了caspase在体内肾脏坏死细胞损伤中的作用。
我们之前已经证明，受损的IL-18处理可以保护胱天蛋白酶-1缺陷小鼠免受缺血性ARF的影响(7). 在这项研究中，IL-18中和抗血清对缺血性ARF具有一定程度的保护作用，类似于胱天蛋白酶-1缺陷小鼠。由于caspase-1缺陷小鼠在缺血性ARF中表现出中性粒细胞浸润减少，我们假设IL-18的有害作用可能是由于中性粒细胞的浸润增加。因此，在本研究中，我们测定了caspase抑制对缺血性ARF肾脏caspase-1活性、IL-18蛋白和中性粒细胞浸润的影响。OPH-001显著降低缺血ARF期间caspase-1活性和IL-18的增加，并防止中性粒细胞浸润肾脏。
有证据表明，白细胞，尤其是中性粒细胞，介导ARF中的肾小管损伤，并在急性肾功能衰竭的发展中发挥关键作用(17). 这一证据来源于显示中性粒细胞在缺血性ARF中积聚的研究，以及证明抗ICAM-1治疗在ARF中的有益作用的研究(18). 此外，抗中性粒细胞血清耗尽外周中性粒细胞的小鼠可抵抗缺血性ARF(18). 然而，在另一项研究中，被抗中性粒细胞血清耗尽的外周中性粒细胞的大鼠对缺血性ARF没有保护作用(19). 在这两项研究中，均未报告缺血性ARF期间肾脏中性粒细胞的定量。在本研究中，中性粒细胞缺失小鼠对缺血性ARF的轻微功能保护和缺乏组织学保护，与中性粒细胞在C57BL/6小鼠缺血性ARF模型中的重要作用相矛盾。
其他白细胞，例如淋巴细胞和单核细胞，最近在缺血性ARF中进行了研究。淋巴细胞在缺血性ARF中的作用存在争议。在一项研究中，CD4 T淋巴细胞缺陷小鼠受到保护，免受缺血性ARF的影响(20). 然而，在另一项研究中，缺乏重组激活基因-1的小鼠(RAG-1号机组)没有成熟的T或B淋巴细胞，不能抵抗缺血性ARF(21). 缺血性ARF引发炎症反应，可能也涉及巨噬细胞，如缺血后肾脏中的巨噬细胞浸润所示(20). 用单克隆抗B7-1抗体阻断共刺激通路与保护血管免受缺血性ARF和减少单核细胞粘附有关(22). 由于T淋巴细胞和单核细胞是已知的IL-18来源，因此这些细胞可能是缺血性ARF中IL-18的来源。缺血性ARF中IL-18的另一个可能来源和靶点是近端小管本身。在本文中，我们提供了关于近端小管作为IL-18的可能来源和靶点的新数据。
IL-18是许多器官炎症和组织损伤的介质。caspase-1缺陷小鼠对实验性结肠炎的保护作用与结肠释放IL-18的减少有关(23). 在致死性内毒素血症期间中和IL-18可减少中性粒细胞组织蓄积并保护小鼠免受LPS的致命影响(24). 描述了IL-18在体内激活中性粒细胞(25). IL-18中和抗血清的使用证明了IL-18在关节炎模型中介导炎症的重要作用(26)，肺损伤(27)和炎症性肠病(28). 因此，我们研究了IL-18介导的肾脏中性粒细胞浸润在缺血性ARF中的作用。
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂OPH-001和中性粒细胞完成抗体RB6-8C5均能防止缺血性ARF肾脏中性粒细胞浸润。尽管caspase-1活性和IL-18蛋白增加，但中性粒细胞缺乏对缺血ARF的保护，这表明了IL-18介导的肾损伤的中性粒细胞依赖性机制。白细胞介素18介导的近端肾小管损伤的中性粒细胞依赖性机制表明，白细胞介导的中和抗血清对中性粒细胞缺失小鼠的缺血性ARF具有保护作用。肾功能的保护程度与我们之前在野生型小鼠中报道的相似(7). 这些数据挑战了IL-18介导的器官损伤是由中性粒细胞依赖性炎症介导的概念，正如致命内毒素血症所证明的那样(24)，小鼠实验性结肠炎(23)、类风湿性关节炎(26,29)，急性肺损伤(27,30)和炎症性中枢神经系统疾病(31).
我们证明，在缺血性ARF期间，OPH-001也抑制胱天蛋白酶-3活性和细胞凋亡。在本研究中，OPH-001的有益作用归因于坏死减少，而不是凋亡减少，原因如下。（a） 凋亡仅见于少数肾小管细胞（不到肾小管的1%；图a） ●●●●。46-75%的肾小管细胞出现坏死（图a） ●●●●。（b） 在动物模型的缺血性ARF和人类移植肾功能延迟中，近端小管坏死是主要发现(32). 多种药物对这种坏死的抑制导致对ARF的功能保护(33). （c） 在其他关于缺血性ARF的研究中，尽管存在广泛的肾小管坏死和肾功能衰竭，但在再灌注24和48小时时凋亡细胞的数量没有增加(9,34). 少量凋亡对缺血性ARF的相对贡献尚不清楚(35). 因此，OPH-001诱导的肾小管坏死的广泛功能和组织学保护不太可能是由于轻微的凋亡抑制作用。
最近的一项研究表明，小鼠缺血ARF中caspase的抑制与细胞凋亡和炎症减少有关(5). 然而，在本研究中，用于评估凋亡的方法缺乏特异性，急性肾小管坏死没有量化，促炎性caspase-1也没有考虑在内。肾脏缺血性ARF中凋亡和坏死的上游途径可能类似，研究表明，被认为是凋亡特征的核酸内切酶激活也发生在无凋亡形态学特征的坏死近端小管细胞中(36). 虽然OPH-001确实减少了细胞凋亡，但其主要作用是抑制近端肾小管坏死。
总之，据我们所知，本研究首次证明了caspase抑制剂对ATN和相关功能性ARF的保护作用。caspase抑制的这种保护作用与caspase-1活性降低、IL-18蛋白降低以及防止肾脏中性粒细胞浸润有关。值得注意的是，使用中性粒细胞缺失小鼠未能证明中性粒细胞在我们的C57BL/6缺血性ARF模型中的重要作用。相反，在IL-18中和抗血清对中性粒细胞缺失小鼠具有显著保护作用的研究中，证实了促炎性IL-18的中性粒细胞依赖性作用。半胱天冬酶抑制的潜在治疗效果可能对人类ARF具有未来的临床意义，人类ARF的死亡率仍超过50%。
致谢
这项工作得到了NIH拨款1RO1 DK56851（给C.L.Edelstein）的支持。D.Ljubanovic是国际肾脏学会肾脏病理学研究员。我们感谢Charles A.Dinarello的有益评论和提供IL-18中和抗血清。
脚注
利益冲突：没有宣布利益冲突。
使用的非标准缩写：急性肾小管坏死；急性肾功能衰竭；喹啉-Val-Asp（Ome）-CH2-OPH（OPH-001）；血尿素氮（BUN）；电化学发光；髓过氧化物酶（MPO）；乳酸脱氢酶（LDH）；不显著（NS）。
参考文献
1Kaushal GP，Ueda N，Shah SV.半胱氨酸蛋白酶（ICE/CED 3蛋白酶）在线粒体抑制剂抗霉素a作用下DNA损伤和细胞死亡中的作用。肾脏Int。1997;52：438–445。[公共医学][谷歌学者] 2Edelstein CL，Shi Y，Schrier RW。半胱氨酸蛋白酶在低氧诱导的大鼠肾近端小管坏死中的作用。《美国肾脏病杂志》。1999;10:1940–1949.[公共医学][谷歌学者] 三。Kaushal GP，Singh AB，Shah SV。大鼠肾脏caspases基因家族的鉴定和缺血再灌注损伤中表达的改变。美国生理学杂志。1998;274：F587–F595。[公共医学][谷歌学者] 4Shi Y，Melnikov VY，Schrier RW，Edelstein CL.肾缺血期间半胱氨酸蛋白酶对钙蛋白酶抑制剂蛋白钙蛋白酶的下调。美国生理学杂志。2000;279：F509–F517。[公共医学][谷歌学者] 5Daemen MARC等。抑制缺血再灌注诱导的细胞凋亡可预防炎症。临床投资杂志。1999;104:541–549. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 6Fantuzzi G、Puren AJ、Harding MW、Livingston DJ、Dinarello CA。白介素-18对干扰素-γ产生和细胞增殖的调节，如白介素-1β转化酶（caspase-1）缺陷小鼠所示。鲜血。1998;91:2118–2125.[公共医学][谷歌学者] 7Melnikov VY等。IL-18处理受损可保护胱天蛋白酶1缺陷小鼠免受缺血性急性肾功能衰竭的影响。临床投资杂志。2001;107:1145–1152. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 8Wipke BT，Allen PM。中性粒细胞在类风湿关节炎小鼠模型的启动和进展中的重要作用。免疫学杂志。2001;167:1601–1608.[公共医学][谷歌学者] 9Gobe G等。大鼠缺血性急性肾衰竭中Bcl-2基因表达与生长因子的关系。《美国肾脏病杂志》。2000;11:454–467.[公共医学][谷歌学者] 10Fantuzzi G，Reed DA，Dinarello CA。IL-12诱导的IFN-γ依赖于IL-18前体的caspase-1处理。临床投资杂志。1999;104:761–767. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 11Hillegass LM，Griswold DE，Brickson B，Albrightson-Winslow C.大鼠肾脏髓过氧化物酶活性的评估。药理学方法杂志。1990年；24:285–295.[公共医学][谷歌学者] 12Ysebaert DK等。严重缺血/再灌注肾损伤后白细胞的鉴定和动力学。肾拨号移植。2000;15:1562–1574.[公共医学][谷歌学者] 13Cheng Y等。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂通过延迟给药在新生鼠缺氧缺血性脑损伤模型中提供神经保护。临床投资杂志。1998;101:1992–1999. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 14Yaoita H，Ogawa K，Maehara K，Maruyama Y。半胱天冬酶抑制剂对大鼠缺血/再灌注损伤的减轻作用。循环。1998;97:276–281.[公共医学][谷歌学者] 15Natori S等。肝保存损伤期间，肝窦内皮细胞通过半胱氨酸蛋白酶依赖机制发生凋亡。移植。1999;68:89–96.[公共医学][谷歌学者] 16Lieberthal W，Nigam SK。急性肾衰竭。二、。急性肾功能衰竭的实验模型：不完善但不可或缺。美国生理学杂志。2000;278：F1–F12。[公共医学][谷歌学者] 17Heinzelmann M、Mercer-Jones MA、Passmore JC。中性粒细胞与肾衰竭。美国肾脏病杂志。1999;34:384–399.[公共医学][谷歌学者] 18Kelly KJ、Williams WW，Jr、Colvin RB、Bonvente JV。细胞内黏附分子-1缺陷小鼠可防止缺血性肾损伤。临床投资杂志。1996;97:1056–1063. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 19Paller MS。中性粒细胞耗竭对大鼠缺血性肾损伤的影响。实验室临床医学杂志。1989;113:379–386.[公共医学][谷歌学者] 20Burne MJ等人CD4的鉴定+T细胞是缺血性急性肾功能衰竭的主要致病因素。临床投资杂志。2001;108:1283–1290. doi:10.1172/JCI200112080。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 21Park P等。肾缺血再灌注损伤独立于免疫球蛋白和T淋巴细胞。美国生理学杂志肾生理学。2002;282：F352–F357。[公共医学][谷歌学者] 22De Greef KE等。抗B7-1阻断缺血后直肠血管中的单核细胞粘附。肾脏Int。2001;60：1415–1427。[公共医学][谷歌学者] 23Siegmund B、Lehr HA、Fantuzzi G、Dinarello CA、IL-1β转化酶（caspase-1）在肠道炎症中的作用。美国国家科学院程序。2001;98:13249–13254. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 24Netea MG等。IL-18的中和作用可减少中性粒细胞组织积聚，并保护小鼠免受致命的大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌内毒素血症的侵害。免疫学杂志。2000;164:2644–2649.[公共医学][谷歌学者] 25Leung BP等。IL-18在中性粒细胞激活中的作用。免疫学杂志。2001;167:2879–2886.[公共医学][谷歌学者] 26Plater-Zyberk C等。在胶原蛋白诱导的关节炎模型中中和内源性IL-18活性的治疗作用。临床投资杂志。2001;108:1825–1832. doi:10.1172/JCI200112097。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 27Jordan JA等。IL-18在急性肺部炎症中的作用。免疫学杂志。2001;167:7060–7068.[公共医学][谷歌学者] 28Siegmund B等人。白细胞介素-18的中和作用可降低小鼠结肠炎的严重程度以及肠道IFN-γ和TNF-α的产生。美国生理学杂志Regul Integr Comp Physiol。2001;281：R1264–R1273。[公共医学][谷歌学者] 29Gracie JA等。IL-18在类风湿关节炎中的促炎作用。临床投资杂志。1999;104:1393–1401. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 30Arndt PG，Fantuzzi G，Abraham E.内毒素血症或出血诱导的急性肺损伤后肺中白细胞介素18的表达。美国呼吸细胞分子生物学杂志。2000;22:708–713.[公共医学][谷歌学者] 31Fassbender K等。炎症性中枢神经系统疾病中的干扰素-γ诱导因子（IL-18）和干扰素-γ。神经病学。1999;53:1104–1106.[公共医学][谷歌学者] 32Lieberthal W，Nigam SK。急性肾衰竭。近端与远端肾小管损伤的相对重要性。美国生理学杂志。1998;275：F623–F632。[公共医学][谷歌学者] 33Edelstein，C.L.和Schrier，R.W.，2001年。缺血性急性肾功能衰竭的病理生理学。在肾脏和尿道疾病。R.W.Schrier，编辑。Lippincott Williams&Wilkins公司。美国宾夕法尼亚州费城1041–1069。
34Lieberthal W等。雷帕霉素损害急性肾衰竭的恢复：细胞周期阻滞和肾小管细胞凋亡的作用。美国生理学杂志肾生理学。2001;281：F693–F706。[公共医学][谷歌学者] 35Bonegio R，Lieberthal W.凋亡在急性肾衰竭发病机制中的作用。肾性高血压。2002;11:301–308.[公共医学][谷歌学者] 36Ueda N，Walker PD，Hsu S，Shah SV.缺氧/复氧损伤中15-kDa内切酶的激活，无凋亡形态学特征。美国国家科学院程序。1995;92：7202–7206。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 
