MEK激酶2和衔接蛋白Lad通过Src调控表皮生长因子对细胞外信号调节激酶5的激活

细胞、细胞培养和转染。

水貂肺上皮细胞系CCL64购自美国类型培养库。从第14.5天胚胎中分离小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）如其他地方所述（Lobel-Rice等人，已提交），细胞在Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM）中生长，其中含有10%胎牛血清、100 U青霉素/ml和100μg链霉素/ml。人胚肾（HEK）293和CCL64细胞保存在含有10%胎牛血清和抗生素的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）中。稳定CCL64和293细胞的筛选分别使用0.3 mg潮霉素B/ml和0.7 mg G418/ml。通过使用Lipofectamine（Invitrogen）或在280V和960μF下电穿孔完成转染。

酵母双杂交相互作用图谱。

MEKK2的Lad/RIBP结合位点的定位是基于先前的研究，即MEKK2的N-末端片段与Lad相关。在酵母载体pBTM116的LexA DNA-结合蛋白框架中克隆了该MEKK2区域的序列截断(4). 然后将pBTM116衍生质粒与表达Lad的Gal4激活域融合的质粒（pACT2-Lad；参见参考文献49)进入酵母报告菌株L40(17). 通过转化子的能力评估相互作用的强度酿酒酵母细胞在缺乏组氨酸但补充有3 mM 3-氨基三唑（3-AT）（Sigma）的最小平板上生长。如前所述，对双杂交相互作用进行定量(50).

酵母三杂交分析。

三杂交载体pBridge购自Clontech(53). 全长MEKK2由ADH1（ADH1）pBridge中作为Gal4 DNA结合域融合蛋白的启动子和Lad-binding MEKK2片段（氨基酸[aa]228至282或aa 241至282）在蛋氨酸可抑制启动子P下有条件地表达_MET25型将C末端融合到Gal4激活域的Lad克隆到第二个质粒（pACT2）中。共转化后，酵母细胞在组氨酸平板上生长。采集大小大致相等的菌落，并将其悬浮在500μl H中₂O.在三种类型的最小平板上分别发现两微升悬浮液及其十倍系列稀释液：含有组氨酸或不含组氨酸，但补充有20 mM 3-AT加上2 mM或不含蛋氨酸（见图。​图5A）。5A级). 酵母细胞在30°C下培养2天并拍照。

在单独的窗口中打开

图5：。

特定MAPK信号的Lad-MEKK2关联要求。（A） EGF、H激活ERK5需要Lad-MEK2相互作用₂哦₂山梨醇浓度低（0.2 M）但不高（0.4 M）。所示为稳定表达iMEKK2或iMEK03的HEK293细胞中ERK5活化的分析结果。（B） 激活ERK1/2不需要Lad-MEKK2复合物。带有抗ERK1/2的印迹细胞裂解物表明，内源性ERK1/2在每个细胞系中的表达类似（数据未显示）。（C） Lad-MEK2相互作用在EGF中起作用，但在H中不起作用₂哦₂-引发JNK激活。（D） HEK293细胞中iMEKK2和iMEK03 RNA表达的半定量RT-PCR分析。

免疫共沉淀和体外结合分析。

293或CCL64细胞用冰镇磷酸盐缓冲盐水缓冲液清洗，并在由50 mM Tris-Cl（pH 7.5）、100 mM NaCl、50 mM NaF、5 mM Na组成的裂解缓冲液中进行裂解₄P（P）₂哦₇，1 mM钠_三VO（旁白）₄、0.5%Triton X-100、1 mM EDTA、1 mM-EGTA、50μM亮氨酸肽、10μg胃蛋白酶抑制素A/ml、1 mM/苯甲基磺酰基氟化物和2μg抑肽酶/ml。通过高速离心进行短暂清除后，将细胞裂解物在4°C下免疫沉淀2至3 h，然后用预洗蛋白g珠培养2 h。用裂解缓冲液洗涤珠子三次，并用Western blotting检测相关的珠子结合蛋白。

对于体外结合研究，MEKK2片段跨越残基228到282和MEKK3的相应区域（aa 239到293）作为谷胱甘肽在细菌中产生S公司-转移酶（GST）融合。融合蛋白预先结合到谷胱甘肽-Sepharose 4B珠（Amersham Pharmacia Biotech），与Lad转染的CCL64细胞裂解物孵育3小时。在广泛清洗后，用M5对样品进行Western blot以检测Lad的存在。

逆转录聚合酶链式反应。

对使用Trizol（Life Technologies，Inc.）从培养细胞制备的mRNA进行逆转录酶PCR（RT-PCR）。按照制造商的说明，使用rTth DNA聚合酶进行反转录和PCR（Perkin-Elmer生命科学）。扩增引物与多克隆位点5′-TATACGACTCACTATAGGG-3′和5′-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3′侧翼的载体（pcDNA3.1）序列互补。甘油醛-3-磷酸脱氢酶mRNA的RT-PCR作为内标。

MEKK2和MAPK活动分析。

治疗前，CCL64或HEK293和表达不同结构的衍生细胞系在DMEM中用0.5%胎牛血清饥饿3至24小时（或在IMDM中用0.5%的胎牛血清隔夜）。用EGF、H刺激₂哦₂（西格玛）和山梨醇（西格马）在37°C下保持20分钟，浓度分别为2.5 ng/ml、250 nM和0.2或0.4 M。刺激前，用Src激酶抑制剂PP1在10μM下处理30分钟。根据已建立的观察结果，磷酸化和活化的ERK5在十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶上的流动性显著降低，根据凝胶移位方案对ERK5活化进行分析(19,20,49). 这是通过在4°C下将细胞裂解物放在7%的凝胶上，并用抗ERK5抗血清进行Western印迹来完成的。ERK1/2活化通过用磷酸化ERK1/2特异性抗体E10进行印迹测定。使用GST-cJun进行JNK的体外激酶测定_1-79如前所述(50). 为了检测MEKK2激酶的活性，内源性MEKK_2从细胞裂解液中免疫沉淀，并在高浓度裂解缓冲液中进行大量洗涤(50)用纯化的重组MKK4作为特异性底物进行免疫复合物激酶反应。

MEKK2被EGF和应激刺激激活。

MEKK2是ERK5和JNK途径的MEK激酶(6,49)，已知对多种兴奋剂有反应，包括生长因子和应激因子，如H₂哦₂山梨醇。我们研究了MEKK2是否被激活以响应这些刺激。EGF、H处理的CCL64水貂肺上皮细胞内源性MEKK2免疫沉淀活性₂哦₂或在体外免疫复合物激酶分析中分析山梨醇（图。​（图2A）。2安培). 由于细菌表达的MEK5不可溶，我们使用重组MKK4作为MEKK2底物。MEKK2的活性受到每种刺激物的显著刺激。MKK4的磷酸化对于来自H的MEKK2免疫复合物来说是最小的₂哦₂-处理后的细胞与对照抗体（第5道）孵育，但不存在MKK4底物（第6道），这表明MEKK2对MKK_4进行了特异性磷酸化。

在单独的窗口中打开

图2。

MEKK2被激活，Lad酪氨酸被磷酸化以响应EGF和应激刺激。（A） MEKK2被EGF（2.5 ng/ml）激活，H₂哦₂（250 nM）和山梨醇（0.2 M）。用单克隆抗MEKK2抗体对刺激的CCL64细胞进行裂解和免疫沉淀。使用纯化的重组MKK4作为底物，在体外激酶试验中分析MEKK2活性。Western blot分析证实MEKK2的免疫沉淀相等（下面板）。（B） Lad是暴露于EGF、H的细胞中的酪氨酸磷酸化₂哦₂和山梨醇。EGF刺激后，H₂哦₂或山梨醇，稳定表达Flag-Lad的细胞被裂解，并使用抗Flag抗体进行Lad免疫沉淀。使用抗磷酸酪氨酸抗体4G10（上面板）通过Western blotting检测Lad的磷酸化。从不同细胞刺激的细胞裂解液中以类似方式免疫沉淀Lad（下表）。在单独转染载体的细胞中未观察到条带（第2条通道）。

接下来我们通过EGF、H检测了Lad的酪氨酸磷酸化₂哦₂和山梨醇。稳定表达Flag-Lad的CCL64细胞经EGF、H₂哦₂或山梨醇，然后用抗磷脂酰肌醇抗体免疫沉淀Flag-Lad，然后用Western印迹（图。​（图2B）。第2页). 在接受每种刺激的细胞中（3到5道），Lad被酪氨酸磷酸化，但在没有刺激的对照细胞（1道）或模拟转染细胞（2道）中，Lad没有被酪氨酸磷酸化。这些结果表明，Lad被酪氨酸磷酸化，以响应EGF和氧化应激和高渗应激，这些应激也刺激MEKK2激酶活性。我们的结果与Choi等人的结果一致(11)他表示，在T细胞激活期间，Lck在酪氨酸上磷酸化了Lad。

激活ERK5需要Lad和MEKK2。

我们的研究结果表明，Lad可能负责将细胞外刺激与MEKK2激活耦合，导致ERK5和JNK激活。使用反义（AS）RNA干扰方法研究了这种可能性。用AS-Lad构建物稳定转染显著降低内源性Lad的蛋白水平，而内源性MEKK2的表达不受影响（图。​（图3A），3A级)，证明了AS-Lad抑制的特异性。根据既定方案分析内源性ERK5活性，即激活ERK5在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳期间迁移，相对于非磷酸化、非活性ERK5，迁移率降低(2,19,49). 如图所示。​图3B，3B公司，AS-Lad显著降低了ERK5对EGF或H刺激的反应₂哦₂为了证明AS-Lad干扰是Lad敲除的直接结果，通过转染Lad可以重建ERK5反应。因此，AS-Lad效应是Lad蛋白表达下调的直接结果，并通过转染Lad cDNA和增加Lad蛋白的表达来逆转。在最高水平的add-back Lad表达下，ERK5激活被抑制，可能是由于相对于MEKK2的Lad过量。与观察到的AS-Lad对ERK5激活的抑制相关，我们发现EGF-依赖的MEKK2激活也被AS-Lad抑制（见图。​图6B）。6亿). 在其他实验中，MEKK3的敲除对EGF或应激刺激对ERK5的激活没有影响（数据未显示），进一步证明了Lad和MEKK2在ERK5反应中的特异性。如图所示。​图3C，3厘米在表达AS-Lad的细胞中未检测到ERK1/2活性的抑制，这表明了在ERK5信号中对Lad的特殊需求。与氧化应激条件下相比，EGF刺激的成纤维细胞中ERK5活性对MEKK2的依赖性更为显著（图。​（图3E）。第三方). Lad在JNK信号传导中具有一定的刺激特异性作用；AS-Lad显著抑制EGF-刺激的JNK活性，但不抑制氧化应激激活的JNK（图。​（图3D）。三维). 这与氧化应激激活导致JNK激活的几种不同途径一致。例如，MEKK1已被证明有助于JNK激活以应对氧化应激(32). 还需要MEKK2通过EGF和氧化应激激活ERK5（图。​（图3E）。第三方). 靶向性破坏MEKK2表达(15)导致EGF失去ERK5活化，并对氧化应激反应中ERK5的活化产生显著但部分的抑制。MEKK2基因敲除和AS-Lad对ERK5激活具有类似的抑制作用，这与MEKB2和Lad处于EGF和H所需的信号复合物中一致₂哦₂激活MEKK2和ERK5。

在单独的窗口中打开

图3。

特定MAPK信号中对Lad和MEKK2的要求。（A） AS-Lad特异性抑制内源性Lad表达。用编码AS-Lad的DNA构建物（相对于ATG起始位点从−51到+345）或对照模拟载体稳定转染CCL64细胞。左图：细胞裂解物与免疫前或Lad抗血清孵育，免疫沉淀物与抗Lad蛋白印迹。右侧面板：用抗MEKK2印迹细胞裂解物。（B） EGF和H激活ERK5需要Lad₂哦₂ERK5活化在凝胶位移分析中进行了分析，该分析基于先前的发现，活化的ERK5在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上具有降低迁移率的特征（上图）。AS-Lad对EGF-刺激的ERK5激活的抑制可通过Lad的瞬时表达（下面板）逆转。增加量的Lad在AS Lad细胞中瞬时表达6小时，随后在血清饥饿3小时后用EGF处理。用Western blotting检测ERK5活性。（C） Lad对于ERK1/2信号传导是可有可无的。EGF-或H₂哦₂-使用磷酸化ERK1/2特异性抗体，通过Western blotting分析经处理的AS-Lad或模拟转染细胞的ERK1/2反应（上图）。具有抗ERK1/2的免疫印迹细胞裂解物显示内源性ERK1/2表达没有差异（下图）。（D） Lad对EGF有贡献，但对H没有贡献₂哦₂-诱导JNK激活。内源性JNK被GST-cJun拉下_1-79并用于体外激酶检测（上面板）。用抗JNK抗体进行印迹显示，AS-Lad不影响JNK的表达（下表）。（E） EGF和H需要MEKK2₂哦₂激活ERK5。如图所示，刺激MEKK2-敲除型MEF或野生型MEF。ERK5活动的分析如面板B图例所述。

在单独的窗口中打开

图6。

MEKK2和ERK5激活需要Lad表达，并受Src调控。（A） MEKK2是由Src激酶磷酸化的酪氨酸。用Src激酶抑制剂PP1（10μM；30分钟）或载体（二甲基亚砜[DMSO]）预处理的CCL64细胞用EGF或H刺激₂哦₂.用珠状GST-PRK2aa616-670将内源性MEKK2拉下，并用4G10（上面板）吸住。用抗MEKK2蛋白吸干一小份珠子表明，在每种情况下，MEKK2.都被均匀地拉下（下面板）。（B） MEKK2活化受Src激酶和Lad调节。用EGF或H刺激PP1预处理（或DMSO预处理）的野生型细胞或稳定表达AS-Lad、iMEKK2或iMEK03的细胞₂哦₂MEKK2从细胞裂解物中免疫沉淀，并在体外免疫复合物激酶试验中测定对MKK4的激酶活性。如A组图例所述，经Western blotting证实，获得了相等的MEKK2免疫沉淀。RT-PCR分析表明，iMEK02和iMEKK3 RNA在CCL64细胞中的表达类似于HEK293细胞的结果。（C） Src激酶调节ERK5信号转导，以响应EGF和应激刺激。如图图例所示，对PP1抑制ERK5进行Western blot分析。​图3B。3B公司（D）PP1在10μM时不会干扰EGFR磷酸化或显著降低体外MEKK2活性。用PP1（或DMSO）处理细胞，然后用或不用EGF处理，如面板A图例所述（左面板）。细胞裂解物与单克隆抗EGFR抗体孵育。免疫沉淀用4G10或抗EGFR进行印迹。来自H的免疫沉淀MEKK2₂哦₂-处理后的细胞用于在PP1存在或不存在的情况下进行体外激酶检测（右侧面板）。（E） EGF刺激的MEKK2酪氨酸磷酸化需要与Lad相互作用。所示稳定细胞系的裂解液用抗MEKK2免疫沉淀并用4G10印迹。（F） Lad和Src在MEKK2酪氨酸磷酸化和活化中发挥协同作用。用所指示的表达构建体转染细胞。分析免疫沉淀MEKK2的酪氨酸磷酸化（上部面板）或MKK4上的激酶活性（下部面板）。（G） 显性阴性Src干扰EGF向MEKK2→ERK5通路的信号传导。如上所述，对MEKK2酪氨酸磷酸化和MEKK1和ERK5的活化进行了检测。

绘制MEKK2和Lad之间的相互作用。

MEKK2从aa 228到360的区域（MEKK2aa228-360）最初在酵母双杂交筛选中用作诱饵，该筛选将Lad鉴定为MEKK2结合蛋白(49). 从MEKK2的这一区域开始，我们检查了一系列截短的MEK02片段，根据它们支持酵母报告菌株L40在缺乏组氨酸的最小平板上生长的能力来判断它们与Lad的相互作用（图。​（图4A，4A级，上部面板）。从C末端逐渐删除MEKK2aa228-360表明，残基282后的氨基酸对于结合Lad是不必要的。然而，进一步去除MEKK2aa228-282的C末端15残基导致几乎完全失去相互作用。从N末端截短MEKK2aa228-282片段表明，MEKK2A241-282仍能与Lad相互作用，亲和力显著降低。为了支持这些结果lacZ公司报告基因显示，MEKK2aa228-282-Lad相互作用驱动的β-半乳糖苷酶活性是MEKK2A241-282和Lad转化的酵母L40细胞的四倍。在酵母双杂交分析中，与MEKK2aa228-282同源的MEKK3区域（从残基239到293）没有显示出与Lad有任何明显的相互作用，尽管MEKK2和MEK03在这些区域之间保守82%（58%相同）。这个lacZ公司报告者分析还显示，MEKK2的Lad-binding位点未能与MEK5相互作用。证实了双杂交数据，细菌表达和纯化的MEKK2aa228-282 GST融合物可以很容易地从CCL64细胞裂解物中拉下Lad，而GST-MEKK3aa239-293显然没有这样做（图。​（图4B，4B类，上部面板）。重要的是，GST-Lad融合蛋白能够从细胞裂解物中拉下MEKK2（图。​（图4B）。4B类). 然而，无论是N端片段还是C端片段，还是Lad结合的MEKK2的SH2结构域（数据未显示），都表明只有全长Lad蛋白的适当折叠才能赋予MEKK2.结合活性。该发现定义了MEKK2的aa 228至282内的一个特定Lad-binding基序。

在单独的窗口中打开

图4。

Lad的MEKK2-结合基序映射。（A） 双杂交相互作用的定量。将MEKK2aa228-360片段的连续截短片段与载体pBTM116中的细菌DNA-结合蛋白LexA融合，并在酵母双杂交原营养分析中测试其与Lad的相互作用。通过转化酵母细胞在添加3 mM 3-AT的合成完整（SC）-His平板上的生长来确定相互作用的强度。对酵母转化细胞的液体培养物进行β-半乳糖苷酶活性检测，结果表示为平均值±标准差。图中显示了Lad相互作用的MEKK2序列与MEKK3的相应区域的比对。非保守氨基酸以黑色突出显示，保守但不相同的氨基酸以灰色阴影显示。（B） 通过体外结合分析确认酵母双杂交结果。珠状结合和纯化的GST融合蛋白与CCL64细胞裂解物孵育，CCL64裂解物表达或不表达如图所示的Flag-Lad（上图）。用M5抗体免疫印迹法检测与Lad的结合。细胞裂解物也作为对照平行加载。将全长Lad的GST融合物与CCL64细胞裂解物孵育，并通过Western blotting（下表）分析内源性MEKK2的下拉。（C） HEK293细胞中MEKK2aa228-282的表达阻断了MEKK2与Lad的结合。用MEKK2aa228-282、MEKK3a239-293或空载体稳定转染的HEK293细胞用Flag Lad或不用Flag Lad瞬时转染。在有限表达（6 h）后，细胞裂解物用抗Flag M5抗体进行免疫沉淀。然后使用蛋白质印迹来检测与Lad相关的内源性MEKK2的量（上图）。细胞裂解物的Western blotting显示内源性MEKK2或瞬时表达的Lad水平相似（分别为中间和底部面板）。MEKK2aa228-282和MEKK3aa239-293的半定量RT-PCR分析表明，稳定表达293细胞的RNA表达相似。所使用的引物与多克隆位点侧翼的载体（pcDNA3.1）序列互补。甘油醛-3-磷酸脱氢酶看家基因的扩增(G3PDH公司)显示相同的mRNA回收率和RT-PCR效率。（D） 三杂交分析表明，从aa 228到282的MEKK2，但不是MEKK3中的相关序列，可以特异性破坏Lad-MEK2相互作用。MEKK2aa228-282或-aa241-282是在蛋氨酸再表达下克隆的MET25型酵母三杂交载体pBridge中的启动子和全长MEKK2被表达为Gal4 DNA结合域融合蛋白ADH1（ADH1）启动子位于同一载体中。其中一个pBridge衍生质粒与GAD-Lad共转化为酵母报告菌株CG1945。在SC-His培养板上生长后，随机挑选大小相似的转化株菌落，并在SC-Hs培养板（作为对照）上或在添加或不添加蛋氨酸的SC-His加20 mM 3-AT培养板上以10倍的连续稀释液进行定位。细胞在30°C下孵育2天后拍摄照片。该图显示了六个独立实验的类似结果。

MEKK2aa228-282与Lad结合的发现表明，它可以用于选择性破坏Lad与MEKK2的相互作用。为了验证这一预测，用Flag-Lad瞬时转染稳定表达MEKK2aa228-282或不结合Lad的相应MEKK3序列（aa 239至293）的细胞。在有限表达后（转染后6小时），用抗Flag M5抗体进行免疫沉淀，以评估Lad相关内源性MEKK2的数量。用抗MEKK2或抗Flag抗体对细胞裂解产物进行Western blotting，结果表明，MEK02和Lad在每个细胞系中的表达水平是恒定的（图。​（图4C，4摄氏度中面板和底部面板）。RT-PCR检测还发现，MEKK2aa228-282和MEKK3aa239-293在相似的RNA水平上表达，预测类似的蛋白质表达（图。​（图4C）。4摄氏度). 车道1和2（图。​（图4C，4摄氏度，顶面板）表明Lad结合内源性MEKK2。MEKK2aa228-282（车道3）显著破坏了这种联系，但MEKK3aa239-293（车道4）的表达没有影响。

然后，我们利用酵母三杂交系统证实，在细胞中表达MEKK2aa228-282或MEKK2A241-282可以阻断MEKK2与Lad的关联。在三杂交系统中，MEKK2和Lad是组成性表达的，MEK02片段aa 228至282或aa 241至282受蛋氨酸可表达启动子的转录控制符合25（P_MET25型) (53). 转化后，在三组最小平板上用10倍连续稀释液发现单个酵母菌落，如图所示。​图4D：。4D（四维）在组氨酸存在的情况下，没有对MEKK2-Lad相互作用的选择施加压力（左面板），所有转化酵母细胞生长在大约相同的密度，表明发现了大致相同数量的细胞。在缺乏组氨酸（但含有蛋氨酸）的平板中，P_MET25型被抑制）（中间面板），即使没有稀释，没有Lad表达的细胞也不能生长（图。​（图4D，4D（四维），第3列和第4列），再次证明了Lad-MEKK2相互作用的要求。酵母平板中蛋氨酸的进一步缺失诱导了P中MEKK2片段aa 241至282和aa 228至282的表达_MET25型（右侧面板）。在这些条件下，与不含MEKK2片段的细胞（第3列）相比，表达任一克隆的Lad-binding片段的细胞的生长受到严重损害（第1列和第2列），MEKK片段在蛋氨酸存在或不存在的情况下生长同样好。结果还表明，aa 228至282比aa 241至282更能抑制Lad-MEKK2相互作用，从而抑制细胞生长，这与酵母双杂交结合位点定位研究密切相关。因此，我们将MEKK2aa228-282命名为iMEKK2，作为MEKK2中的抑制片段，为了方便起见，MEKK3aa239-293以下简称为iMEKK3。

在生长因子结扎和细胞外应激的反应中，需要Lad-MEK2相互作用来激活ERK5。

上述实验的结果表明，Lad可能将MEKK2与上游调节器的激活耦合。Lad-MEK2交互的映射为测试这个问题提供了一个很好的工具，因为我们发现iMEKK2特别干扰了这种交互。iMEKK2的表达对ERK5的激活具有强烈的抑制作用（图。​（图5A）5A级)和MEKK2（图。​（图6B）；6亿); 相反，iMEKK3在类似的RNA水平上表达（图。​（图5D）第五天)但不与Lad相互作用，对任一激酶的激活均无影响。因此，结果表明，生长因子和氧化或高渗应激诱导的ERK5活化需要Lad与MEKK2相互作用。有趣的是，在山梨醇的高浓度（0.4与0.2 M）下，iMEKK2对ERK5的影响变得不明显（图。​（图5A，5A级，底部面板），表明高渗透压下的额外信号通路绕过了Lad-MEKK2相互作用的要求。结果还表明，ERK5反应通路对适当的刺激具有功能性。

结果表明，从细胞表面到ERK1/2级联的信号在很大程度上与Lad无关（图。​（图3C），3厘米)用iMEKK2从Lad中解偶联MEKK2/对EGF或H刺激ERK1/2活化无抑制作用₂哦₂（图。​（图5B）。5亿). iMEKK2的表达部分抑制EGF，但不抑制H₂哦₂激活JNK，与使用AS-Lad时的发现一致（图。​（图3D），三维)Lad-MEK2相互作用在EGF中的作用比在H中更为显著₂哦₂激活JNK（图。​（图5C）。5摄氏度). 与MEKK2的合并结果^−/−MEFs、iMEKK2和AS-Lad表明，Lad-MEK2相互作用对ERK5激活至关重要，并参与JNK的EGF受体调节，但对ERK1/2的调节不是必需的。

Lad/MEKK2→ERK5途径由Src激酶调节。

接下来，我们研究了MEKK2是否像Lad一样对EGF或H产生酪氨酸磷酸化反应₂哦₂从CCL64细胞裂解物中分离出内源性MEKK2，纯化的PRK2 MEKK2-结合片段（残基616至670）表达为GST融合(50). 用抗MEKK2单克隆抗体进行Western blotting，GST-PRK2aa616-670证实了相同的下拉作用（图。​（图6A，6A级，下部面板）。用抗磷酸酪氨酸抗体4G10印迹显示，MEKK2通过用EGF或H处理而被酪氨酸磷酸化₂哦₂（图。​（图6A，6A级，上部面板）。4G10反应带是MEKK2，因为它们不是从EGF-或H中沉淀出来的₂哦₂-处理细胞与GST单独孵育。重要的是，用一种Src激酶抑制剂PP1预处理细胞(25)，抑制MEKK2酪氨酸磷酸化（图。​（图6A）。6A级). 在此浓度的PP1（10μM）下，EGF受体（EGFR）的磷酸化不受影响（图。​（图6D，第6天，左面板），表明Src激酶可能参与MEKK2酪氨酸磷酸化。与MEKK2酪氨酸磷酸化对Src激酶的需求相关，经EGF或H处理的细胞中的MEKK2kinase活性₂哦₂用PP1对细胞进行预处理后，细胞受到强烈抑制（图。​（图6B）。6亿). 然而，PP1没有抑制从刺激的CCL64细胞分离的MEKK2的体外激酶活性（图。​（图6D，第6天，右侧面板）。细胞的PP1处理也抑制ERK5激活（图。​（图6C），6摄氏度)与PP1处理细胞中MEKK2活性的丧失一致。支持Src激酶在MEKK2/MEK5/ERK5信号传导中的关键作用，Src（dn-Src）的主要负形式显著降低了EGF对MEKK2酪氨酸磷酸化和活性的刺激以及ERK5的激活（图。​（图6G）。6克). 此外，组成活性Src突变体的瞬时表达导致MEKK2酪氨酸磷酸化和催化活性的显著刺激，这受到iMEKK02（但不是iMEK03）的阻碍，但与Lad的共表达协同作用（图。​（图6F）。第6页). 这些结果确立了在MEKK2酪氨酸磷酸化中对Lad及其与MEKK_2相互作用的需求，以响应EGF。Src激酶Lck对Lad的酪氨酸磷酸化已被证明诱导Lad与Lck SH2结构域结合，将其招募到T细胞受体信号复合物(11).

这项研究得到了NIH拨款DK37871、CA18587和AI42246的部分支持。