在缺乏PPAR-γ辅活化因子1α的小鼠中，横行主动脉收缩导致加速心力衰竭

摘要

心力衰竭已成为工业化国家的主要死亡原因(1)。现在人们认识到，心力衰竭的一个主要因素是血流动力学负荷（如心肌梗死或慢性高血压后的负荷）后发生的心脏适应不良重塑（参考文献综述）。2和三)。这种重塑发生的机制尚不完全清楚。最容易理解的是伴随心力衰竭的神经激素变化，尤其是儿茶酚胺能和肾素/血管紧张素系统的变化。目前临床上用于治疗心力衰竭的几乎所有药物都针对这些系统(2)。然而，心力衰竭的5年死亡率仍在50%的范围内，与许多癌症相当(1)这突显了当前治疗方法的不足，并要求深入了解导致心力衰竭的机制。

心力衰竭还伴随着心脏能量学的重大变化(4——9)。心脏对正常功能有极高的能量需求，每克组织使用的ATP比身体任何其他器官都多(10)。维持这种ATP的强劲生成对心脏的健康和疾病都至关重要。与这一概念一致，心脏衰竭导致ATP生成减少（参考文献综述）。4和8)。线粒体中的氧化磷酸化是迄今为止产生ATP的最有效方式；与此相一致，线粒体功能基因异常导致的人类疾病通常会导致心力衰竭(11)。然而，线粒体DNA的原发性缺陷仅占心力衰竭病例的一小部分，以及随之而来的ATP生成缺陷。线粒体氧化活性变化在更常见形式的心力衰竭中发生的机制尚不清楚。

增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）辅活化因子1α（PGC-1α）是许多组织中氧化代谢的主要调节因子（参考文献综述）。12和13)。该转录辅激活子最初是作为棕色脂肪中的冷诱导PPAR-γ结合蛋白分离出来的(14)。随后的工作表明，该蛋白结合并共同激活了核受体家族的大多数成员以及核受体家族以外的许多转录因子。PGC-1α将这些转录因子与染色质修饰酶、基本转录机制和剪接机制联系起来，从而有效诱导转录活性。PGC-1α具有多种生物活性，其中许多与氧化代谢和线粒体功能有关。白脂肪细胞中PGC-1α的表达使其具有棕色脂肪细胞的许多特性，包括线粒体数量的显著增加和UCP-1的表达。PGC-1α是由骨骼肌中的运动诱导的（例如，参考文献。15——18)，当在骨骼肌中转基因表达时，它会诱导纤维向更具氧化性的I型和IIa型转变(19)。PGC-1α在禁食的肝脏中被诱导，在那里它诱导脂肪酸的线粒体β氧化，并刺激糖异生的整个程序(20，21)。在所有这些情况下，PGC-1α都会增加呼吸，并且许多程序会伴随着特定组织中呼吸的增加而进行。

PGC-1α在心脏中大量表达。许多功能增强分析显示两者都有体外和体内PGC-1α激活线粒体生物学的大多数基因，并刺激心脏组织中的脂肪酸氧化和氧化呼吸(22——25)。相反，我们最近发现，PGC-1α基因的消融导致心脏能量储备和功能严重不足(26)。在缺乏PGC-1α的情况下，心脏线粒体基因的表达受到抑制，线粒体酶的活性异常，ATP的生成减弱。这些能量缺陷导致当肾上腺素能药物刺激心脏时，无法适当增加收缩功能。塞拉利昂等。(27)生成了一个类似的小鼠模型，对PGC-1α基因的消融略有不同(27)。他们的工作表明PGC-1α^−/−动物明显缩短了跑步机的运行时间，跑步机运行后的心脏功能减弱。总之，这些研究证明了PGC-1α在维持正常的心脏能量学和收缩功能方面发挥的重要作用，尤其是在对生理刺激的反应中。

越来越多的文献表明，在心脏病实验模型中PGC-1α的表达发生改变(28——36)。例如，在心肌肥大的啮齿动物模型中，受PGC-1α调节的PGC-1基因和线粒体基因受到抑制(30，31，37)。PGC-1α的这种抑制可能对ATP生成不足和衰竭心脏的其他类型功能障碍起重要作用。为了研究PGC-1α在应激心脏中的作用，我们对缺乏PGC-1β的小鼠进行了横贯主动脉收缩（TAC），这会亚急性增加心脏负荷。我们在这里显示PGC-1α^−/−在这种压力下，小鼠极易发生心力衰竭。此外，PGC-1α在细胞中的诱导体外通过肾上腺素能刺激逆转线粒体基因的抑制，提示PGC-1α可能是治疗心力衰竭的潜在靶点。

结果

前列腺素C-1α^−/−小鼠和WT对照组接受TAC。TAC是一种成熟的外科手术，在该手术中，横主动脉周围的缝合线未完全拉紧，从而增加了心脏对血液流出的阻力。这一过程导致心脏的血流动力学负荷增加，心脏必须使用更大的力量来维持正常的心输出量，最终导致心脏肥大。三个月龄PGC-1α^−/−和WT对照小鼠进行TAC，在随后的2个月内，评估心脏功能体内使用二维超声心动图。TAC后的前2周内，WT和PGC-1α的心脏^−/−动物主心室轻度扩张[测量左心室舒张末期直径（LVEDD）；图1A类]伴有轻微收缩减少[以分数缩短（FS）衡量；图1A类]. 1个月内，WT和PGC-1α^−/−动物通过心脏显著肥大[测量左心室前壁（LVAW）厚度]来补偿增加的血流动力学负荷，前2周观察到的轻度心脏扩张得到解决(图1A类)。然而，到2个月时，WT动物能够维持一种代偿状态，即PGC-1α^−/−动物出现了严重的心脏功能障碍。PGC-1α心脏^−/−小鼠明显扩张，图示LVEDD加倍(图1和表1)。同时，这些心脏的收缩能力严重减弱，FS从≈60%大幅下降至≈15%即是明证(图1和表1).

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图1。

PGC-1α对TAC反应的心脏功能障碍^−/−（KO）小鼠。PGC-1αWT和KO小鼠接受TAC，如方法. (A类)TAC后2个月内WT和KO小鼠指示超声心动图参数的平均值(n个=每组5人）。误差条表示SEM(B类)不含TAC的WT和KO小鼠的二维超声心动图样本(上部)或TAC后2个月(下部).

随后杀死动物，并切除心脏。与对照组相比，接受TAC的WT小鼠的心脏增大(图2A类)重量增加≈2倍(图2C类)，与心肌肥大一致。PGC-1α的心脏^−/−相比之下，TAC组小鼠的体重增加了三倍多(图2C类)而且大得很(图2A类)与二维超声心动图所见的深度扩张一致(图1)。苏木精/伊红染色的低倍放大证实PGC-1α显著扩张^−/−TAC心脏(图2B类)与WT TAC心脏和PGC-1α比较^−/−无TAC的心脏。三色染色显示TAC后WT和−/−心脏的肌原纤维紊乱和纤维化增加(图2D类)心脏肥大和衰竭的特征。根据就地TUNEL测定（数据未显示）。

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图2。

前列腺素C-1α^−/−（KO）小鼠对TAC产生扩张性心肌病反应。中描述的动物的心图1TAC术后2个月切除。(A类)含TAC和不含TAC的WT和KO心脏样本照片。(B类)同一心脏横切面苏木精/伊红染色的低倍视野A类. (C类)中描述的所有小鼠心脏的平均重量图1. (D类)样本来自同一心脏的三色染色的更高认知视图B类蓝色表示细胞外基质的积聚或纤维化。（放大倍率：×20.）

与人类一样，小鼠的心脏功能障碍会导致全身症状。其中最突出的是肺部和肝脏充血。如所示图3A类PGC-1α中的肺^−/−TAC后2个月，小鼠体重几乎增加了两倍，这可能是由于极度充血所致，而WT-TAC小鼠的体重只有适度增加。心衰标志物β-肌球蛋白重链和心钠素基因的mRNA表达比WT对照小鼠增加了100倍(图3B类)。恶病质是心力衰竭的另一常见终末期后果。TAC后2个月，PGC-1α^−/−小鼠明显消瘦（数据未显示），体重显著下降(图3C类)不同于WT对手。尽管肺部的“湿”重量增加了，但体重还是减轻了(图3B类)和肝脏（数据未显示）。总之，这些数据表明PGC-1α^−/−小鼠对TAC产生严重的心脏功能障碍和临床心力衰竭体内.

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图3。

PGC-1α^−/−（KO）小鼠对TAC产生临床心力衰竭反应。(A类)未经TAC或TAC后2个月WT和PGC-1αKO小鼠肺的平均重量(n个=每组5人）。(B类)β-肌球蛋白重链（β-MHC）和心钠素（ANF）在同一小鼠中的mRNA表达A类. (C类)WT和PGC-1αKO小鼠TAC前后2个月的小鼠体重(n个= 3). 误差条表示SEM。

如上所述，在各种心衰啮齿动物模型中，PGC-1α及其许多靶基因的表达受到抑制(28——36)。与这些发现一致，与WT对照组相比，TAC组WT小鼠的PGC-1α被抑制约30–40%(图4A类 底部)。PGC-1α的靶基因，如电子传递基因(三磷酸腺苷5o，舵手5b、和cycs公司)和脂肪酸代谢基因(mcad公司，cpt1型、和cpt2型)，同样受到压抑(图4A类 顶部和中部)。重要的是，当PGC-1α^−/−心脏接受TAC治疗后，这些基因的表达下降幅度更大，与WT对照组相比下降了60-70%，与WT-TAC动物相比下降了30-40%，这与PGC-1α在这些基因的调节中发挥的主导作用一致(图4A类)。有趣的是，与PGC-1α相比，这些基因的表达也降低了^−/−未接受TAC的动物，表明除了抑制PGC-1α外，其他机制也可能起作用。为了确定所观察到的基因表达减少的后果，对琥珀酸脱氢酶（SDH，电子传递复合物II）和细胞色素氧化酶（COX，电子传递络合物IV）的活性进行了评估就地心脏横切面。如所示图4B类在WT TAC和PGC-1α中，这两种酶复合物的活性受到轻度抑制^−/−心脏，与非限制性WT对照(图4B类 右上和左下角)。在PGC-1α中^−/−然而，TAC心脏COX和SDH的活性均显著降低(图4B类 右下角)，反映了对基因表达的影响(图4A类).

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图4。

WT和PGC-1α中的PGC-1β、PGC-1γ调节的基因以及电子传递链的活性^−/−TAC后的心脏。(A类)线粒体电子传递链代表基因的mRNA表达(cycs公司，nduf5型，舵手5b、和三磷酸腺苷5o，顶部)，脂肪酸代谢(cd36，mcad公司，cpt1型、和cpt2型，中部)和转录调控（PGC-1α、PGC-1β、PRC和ERRα，底部)在中描述的小鼠子集中图1(n个= 3). ∗,P（P）与WT.**相比<0.05，P（P）与KO相比<0.05。(B类)样品冷冻切片的视图，从与图2并对SDH和COX活性进行染色。（放大倍率：×10.）

为了更好地理解这种抑制的机制，我们在培养细胞中研究了这一过程。儿茶酚胺被认为是心衰神经激素模型的关键部分(2)。在这个模型中，心脏应激导致神经内分泌张力升高，进而在有害的前馈回路中导致进一步的心脏胁迫。新生大鼠心室肌细胞的治疗体外儿茶酚胺苯肾上腺素（PE）可抑制PPAR-α的表达和PPAR-β的靶点，在整个动物中重复类似的发现(38)。PE处理细胞也会抑制脂肪酸氧化(38)和细胞肥大的发展(39，40)如图所示体内响应TAC。为了研究PGC-1α在类似条件下的表达，采集NRVM并用100和300μM PE处理48小时，如图所示图5A类，该治疗导致PGC-1α信息显著减少50%。此外，PGC-1α靶向的基因，包括氧化磷酸化基因（例如，电子传递基因，环氧化酶5b，三磷酸腺苷5o，努德夫5，环氧化酶8h)和脂肪酸氧化（例如，脂肪酸分解，mcad公司; 运输到线粒体，cpt2型; 和转录调控，ppara公司)同样受到压抑(图5A类)。因此，PE对原代心脏细胞的处理密切概括了观察到的一些遗传变化体内针对TAC(图4A类).

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图5。

PE抑制心肌细胞中的PGC-1α和PGC-1β靶基因，而PGC-1γ的异位表达可缓解靶基因的抑制。(A类)线粒体电子传递链代表基因的mRNA表达(环氧化酶8h，nduf5型，环氧化酶5b，三磷酸腺苷5o、和蚂蚁)和脂肪酸代谢(mcad公司，中央处理器1，cpt2型、和ppara公司)用PE（+，100μM；++，300μM）治疗48小时后，原发性NRVM中。*，P（P）与未经治疗的对照组相比，<0.05。(B类)NRVM感染了编码GFP（作为对照）或PGC-1α和GFP的复制缺陷型腺病毒（感染倍数≈5–10）。48小时后，细胞要么未经处理，要么用100μM PE（+PE）再处理48小时。然后收集mRNA。线粒体电子传递链代表基因的表达(cycs公司，nduf5型，环氧化酶5b，三磷酸腺苷5o、和蚂蚁)线粒体对活性氧物种的保护(草皮2)以及参与调节这些基因的核受体(ppara公司和埃拉)显示。误差条表示SEM。

这些数据表明PE对线粒体生物学基因的抑制可能部分由PGC-1α自身的抑制介导。为了验证这一观点，通过腺病毒载体引入外源性PGC-1α来研究PGC-1β逆转PE效应的能力。在这些实验中，使用了低滴度的病毒，选择这些病毒是为了在不添加PE的情况下几乎不诱导PGC-1α靶向的基因。虽然较高数量的病毒可以强烈诱导mcad公司这些细胞中的基因（数据未显示），此处使用的病毒水平不会显著诱导mcad公司或电子传递基因，并诱导某些基因，如天然气资源，蚂蚁、和草皮2只是适度(图5B类)。然而，这种数量的PGC-1α足以几乎消除PE对大多数靶基因的抑制(图5B类)。这些发现与PE通过抑制PGC-1α至少部分抑制线粒体功能基因的观点一致。这表明，旨在适度增加PGC-1α功能的治疗干预可能会逆转慢性心力衰竭中发生的能量学的某些有害重塑。

讨论

早期的研究表明，缺乏PGC-1α的小鼠心脏减少了许多线粒体基因的表达，ATP平衡严重缺陷，对肌力刺激的反应能力减弱，增加工作输出(26)。然而，PGC-1α突变小鼠心脏承受压力超负荷挑战的能力尚不清楚，例如高血压或主动脉狭窄患者的心脏。我们在这里显示，缺乏PGC-1α转录辅激活物的小鼠在心脏胁迫下会发生严重的心脏功能障碍，这是由横主动脉收缩引起的。这是啮齿动物和其他动物中常用的压力过载模型，其中主动脉的收缩导致对心脏流出的阻力增大。我们观察到的心脏功能障碍非常严重，并伴有广泛的肺部充血和恶病质的发展，这表明临床上存在明显的心力衰竭。重要的是，PGC-1α^−/−心脏不会立即衰竭，并且能够在TAC反应中首先发生肥大，这表明PGC-1α对血液动力学负荷的急性反应不是至关重要的。然而，PGC-1α继发严重心脏功能障碍和衰竭^−/−小鼠提示PGC-1α在重塑过程中起重要作用。总之，本文所述的研究结果表明，内源性PGC-1α水平对心脏有效防御这种心脏胁迫至关重要。

PGC-1α和许多已知受PGC-1β调控的基因，如编码电子传递链亚单位或参与脂肪酸输入和氧化的蛋白质的基因，在主动脉条带反应中受到抑制(图4和参考文献。30，31、和37)。重要的是，PGC-1α对心脏的抑制更为明显^−/−主动脉结扎后的小鼠，与未结扎的−/−小鼠或结扎的WT对照组进行比较(图4)。这一发现表明，应对慢性血流动力学负荷可能需要线粒体活性阈值，而PGC-1α阻遏和主动脉束带的结合会加速低于该阈值。在其他心力衰竭模型中也观察到PGC-1α和受PGC-1β调节的基因的抑制，即使线粒体缺陷或压力过载不是心脏功能障碍的主要病因(28——36)。因此，数据表明，即使在这些情况下，PGC-1α的抑制也可能导致心力衰竭的发生。

许多研究小组已经表明，肥厚和衰竭的心脏改变了对葡萄糖的底物偏好，而牺牲了脂肪酸（参考文献综述）。41——43)。有证据表明，这是一种保护心脏免受进一步损害的适应性反应（例如，参考文献。44)尽管机制尚不清楚。因此，评估从PGC-1α移植的心脏的能量分布是很有趣的^−/−小鼠主动脉结扎后。尽管基质用于PGC-1α^−/−心脏尚未评估，脂肪酸使用可能减少，因为脂肪酸输入和使用的许多基因是PGC-1α的已知靶点，并且在有或无主动脉结扎的−/-心脏中受到抑制。同样重要的是要认识到，心脏以外组织中PGC-1α的缺失可能会对心脏功能产生神经激素或体液影响。因此，在心肌细胞中PGC-1α基因座特异性缺失的小鼠中评估心脏功能也很有意义。

如果PGC-1α的缺乏加速了心力衰竭的发展，并且如果在心力衰竭模型中PGC-1β经常被抑制，那么增加PGC-1的α可能对某些心脏损伤具有保护作用。然而，值得注意的是，心脏中PGC-1α的大量诱导体内线粒体含量增加，以致肌原纤维装置移位，继而出现心肌病(23，25)。因此，有必要以更温和的方式增加PGC-1α的活性。用儿茶酚胺药物PE处理组织培养的心肌细胞，可抑制PGC-1α及其调节的许多基因的表达，类似于这种反应体内慢性心脏压迫。我们在这里表明，通过低滴度腺病毒递送引入相对较低量的异位PGC-1α可以挽救许多能量控制基因的抑制。这表明PGC-1α的抑制至少部分解释了这些基因的抑制，以及由此产生的能量不足。重要的是，这也表明PGC-1α活性适度增加体内可能对治疗有益。因此，开发具有药用潜力的小分子以提高PGC-1α活性将是非常有意义的体内.

方法

致谢

缩写

脚注

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