美国国家科学院院刊。2006年7月11日；103(28): 10636–10641.
胰腺β细胞缺乏低血糖和O2-促进细胞存活的可诱导线粒体蛋白
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云曹
†霍华德·休斯医学院，伊利诺伊州芝加哥南马里兰州大道5841号，邮编60637
保罗·加德纳
†霍华德·休斯医学院，伊利诺伊州芝加哥南马里兰州大道5841号，邮编60637
唐纳德·施泰纳
生物化学和分子生物学系，
†霍华德·休斯医学院，伊利诺伊州芝加哥南马里兰州大道5841号，邮编60637
生物化学和分子生物学系，
‡神经生物学、药理学和生理学，以及
§芝加哥大学分子遗传学和细胞生物学，以及
†霍华德·休斯医学院，伊利诺伊州芝加哥南马里兰州大道5841号，邮编60637
作者贡献：J.W.设计的研究；J.W.、Y.Cao、Ying Chen、Yimei Chen和P.G.进行了研究；J.W.和D.F.S.撰写了这篇论文。
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摘要
β细胞衰竭是糖尿病的共同特征。应激诱导凋亡的敏感性可能是β细胞衰竭和/或阻碍胰岛移植治疗的基础。因果基础还不清楚。为了确定α与β细胞中基因表达的重要差异，一个名为HIMP1型（低血糖/缺氧诱导线粒体蛋白，或高强度气体1)已从α细胞cDNA文库中克隆。它是一个非常保守的真核蛋白家族的成员。在小鼠中，它的两个交替拼接产物各自形成一个跨膜环，具有N外部–C外部在包括心脏和胰腺α细胞在内的多个组织中，定向和在线粒体内膜中高度表达，但在β细胞中不表达。HIMP1在MIN6β细胞中的异位表达可保护细胞免受多种刺激诱导的凋亡，并延长其生存期。这些结果表明HIMP1在线粒体的应激保护程序中具有重要作用。
关键词：胰岛、凋亡、内膜蛋白、应激
糖尿病，包括两种主要类型，是当今世界最重要的健康问题之一。在1型糖尿病中，β细胞长期以来被认为对各种有害刺激特别敏感，并且选择性地易于自身免疫性破坏。在2型糖尿病中，累积的研究结果表明，β细胞质量减少(1——5). 然而，普遍认为胰岛素的绝对或相对缺乏是该病的典型表现，这是由于β细胞质量的选择性丧失，通常伴随着α细胞比例的增加，胰高血糖素的产生和分泌增加。因此，胰腺β和/或α细胞的功能紊乱是导致无法维持生理血糖水平和该疾病相关代谢伴随物的主要原因。
在这两种类型的糖尿病中，β细胞凋亡的增加被认为是β细胞质量减少的主要原因(6——7). 与其他细胞类型相比，β细胞凋亡敏感性的主要原因尚不清楚。它是由于一些有益基因的衰减和/或有害基因的启动而在分化过程中固有获得的细胞类型特异性属性吗？还是由于在高血糖或肥胖等应激条件下β细胞超载，以及伴随而来的有毒副产物（如过氧化氢）？虽然支持这两种观点的数据都存在，但越来越多的证据倾向于支持前一种观点，因为已经观察到β细胞对各种凋亡刺激更敏感，例如低血糖应激(8,9)或缺氧(10)，和β细胞凋亡在慢性高血糖条件下增加(三,11——14). β细胞的成熟也被证明与它们对毒素和细胞因子的凋亡刺激的敏感性增加有关(15). 此外，已提出β细胞中各种抗氧化应激保护基因（如过氧化氢酶）的低表达水平与β细胞的凋亡倾向有关(16,17). 另一方面，β细胞特异性基因的表达缺陷或减少，例如部分PDX1缺陷(18)也与β细胞丢失增加有关。
虽然线粒体被认为是整合细胞代谢和凋亡的细胞器(19)在β细胞功能中起关键作用(20)到目前为止，还没有发现与促凋亡或抗凋亡相关的线粒体、寄居蛋白或相关蛋白在β细胞和其他葡萄糖氧化率高的细胞类型（如心肌细胞）之间存在显著差异。为了评估α和β细胞之间基因表达的差异，我们使用mRNA差异显示和微阵列分析了基因表达谱。在这些研究过程中，一种低血糖和低氧双重诱导基因，称为HIMP1型，或高强度气体1，已从α细胞cDNA文库中克隆。它是真核生物中保守的一个独特基因家族的成员。各种分析表明，两种HIMP1交替剪接基因产物是线粒体内膜蛋白，广泛表达于心脏和胰腺α细胞而非β细胞，与细胞生存有关。将HIMP1转染到MIN6细胞可增强其对几种凋亡刺激的抵抗力。
结果
真核生物中保存的一个独特蛋白质家族的两个异构体。
使用在αTC1.6中检测到的cDNA片段探针，从αTC1.6细胞cDNA文库中克隆了两个相似的预测全长cDNA，但通过mRNA差异显示在MIN6细胞中未检测到。对其序列的分析显示，ORF编码两种类似的蛋白质产物，我们将其命名为HIMP-a和-b（图6A类，作为支持信息发布在PNAS网站上）。一份1930 bp的成绩单(HIMP1-b型)编码99个氨基酸的蛋白质；而较短的(HIMP1-a型)缺少499个内部核苷酸HIMP1-b型，导致残基79处的帧移位，在残基96处产生终止密码子，从而产生95aa的蛋白质（图6B类). A类爆炸搜索结果显示HIMP1-a型与低氧诱导基因1（HIG1）相同，HIG1是存放在GenBank中的cDNA，来自小鼠9号染色体上的一个位点。的cDNA序列比较HIMP1-a型和-b条小鼠基因组DNA表明，这两个转录物是一个拷贝的选择性剪接形式HIMP1型/高强度气体1基因。中缺少的区域HIMP1-a型是由于切除了HIMP1型基因。相应的两种蛋白质产物具有84.2%的氨基酸序列同源性。HIMP1-a的预测分子质量和等电点分别为10.6 kDa和9.8，HIMP1-b的预测分子量和等电点将分别为11.0 kDa及11.2。
对HIMP1同源物的搜索产生了>70个点击，主要来自从真菌到人类的12种真核生物。如图6所示B类这是一个对11个HIMP1相关成员的聚类分析，该家族在氨基酸水平上进化上很保守，与HIMP1-a的同源性>40%。这些发现暗示了真核生物基本细胞途径中的保守功能。使用预测程序(21)据预测，HIMP1及其同源物有两个由小环连接的跨膜螺旋（TMH）。预测的TMH和环区代表了这些蛋白质中最保守的区域。小鼠2310056K19Rik基因编码一个同源物，与HIMP1-a的同源性为44.8%（图6B类)可以追溯到11号染色体上的位点。
HIMP1主要在胰腺内的α细胞而非β细胞中表达，在其他被检组织中心脏的表达水平最高。
与mRNA差异显示的结果一致，Northern blotting在αTC1.6中检测到高水平的HIMP1转录物，但在MIN6细胞中没有检测到(A类). 检测到的两条带（≈1.5和≈2.0 kb）分别对应于HIMP1-a和-b转录物的预测大小。HIMP1-a mRNA是在αTC1.6细胞、E10-12胚胎、成人器官（包括心脏、睾丸和肾脏）中检测到的主要转录物，在长期暴露于Northern印迹后，也在其他各种组织中检测到。在大脑中，HIMP1-b信号略强于HIMP1-a。有趣的是，这两种形式在心脏的主要器官中检测到类似的高水平信号。
对比组织分布和低血糖或O诱导表达2两种HIMP1基因产物。(A类)Northern印迹。E10–12天、10–12天胚胎。(B类)逆转录聚合酶链反应。引物集（5′-GGGTTGTACAAGCTGAAGG-3′，5′-TGACACCTCCAAAGCATG-3′）来源于该基因499个内部核苷酸以外的上游和下游区域HIMP1-b型cDNA。显示HIMP1-a（500 bp）和HIMP1-b（999 bp）。(C类和D类)低血糖诱导HIMP1水平的免疫印迹分析(C类)或5%O2缺氧(D类)24小时；每条车道50μg蛋白质。(E类)HIMP1的双重免疫荧光检测(b条和e（电子）)含胰高血糖素(一)或C肽(d日)小鼠胰岛。(c（c）和（f）)的合并图像一和b条和d日和e（电子）分别是。（比例尺，50μm）(F类和G公司)不同组织中HIMP1水平的免疫印迹分析；每道50μg蛋白质。E17，17天胚胎。指长伸肌。
通过RT-PCR进一步分析两种HIMP1转录物在胰岛中的表达(B类). 从αTC1.6细胞和胰岛中扩增出两个与两个cDNA片段的预期大小相对应的PCR产物，但MIN6细胞中没有类似于Northern印迹获得的模式的PCR产物。使用针对两种亚型共享N末端区域产生的多克隆抗HIMP1血清，通过免疫印迹法进一步检测α和β细胞之间的对比表达模式(C类). A≈12-kDa带与HIMP1蛋白的计算分子量相对应，仅在αTC1.6中发现，但在MIN6细胞中未发现。使用免疫前血清未检测到信号（数据未显示）。由于HIMP1-a和-b的大小差异仅为4aa，因此它们在SDS/PAGE免疫印迹上明显结合(D类). 为了进一步验证HIMP1在胰腺中的分布，使用HIMP1抗体和胰高血糖素或C肽对胰腺切片进行双重免疫染色。结果表明，HIMP1免疫反应在α细胞中占优势，而在β细胞中不占优势(E类). 分析表明，HIMP1通常主要表达于胰岛内的α细胞，而非β细胞。HIMP1相关2310056K19Rik基因的表达（参见)用RT-PCR检测胰岛中的。在胰岛、αTC1.6或MIN6细胞系中未发现可检测到表达，但在心脏中检测到高水平表达（数据未显示）。免疫印迹法进一步检测HIMP1蛋白的组织分布( F类和G公司). HIMP1在心脏中的表达水平最高，在各种器官和一些内分泌组织中普遍检测到，这与Northern blot结果一致。
低血糖和低氧诱导HIMP1表达。
当我们通过Northern印迹和免疫印迹检测葡萄糖对αTCI.6细胞HIMP1水平的影响时，我们发现低（2.5 mM）葡萄糖显著增加水平，而高（25 mM）糖降低水平( A类和C类). 鉴于登科的观察，这一发现很有意义等. (26)人类肿瘤细胞中的HIMP1同源物可被缺氧诱导。当我们检测HIMP1在1、2、6和24小时对αTCI.6细胞缺氧的反应时，我们发现有显著的反应(D类). 相反，在MIN6细胞中未观察到可检测的诱导。同样，1 mM葡萄糖在24小时内诱导αTC1.6细胞产生HIMP1水平，但在MIN6细胞中没有。
HIMP1蛋白定位于线粒体内膜和嵴。
用αTC1.6细胞分析HIMP1的亚细胞定位。初步分析表明，HIMP1蛋白仅在免疫印迹法检测到的细胞膜部分(A类). 这一发现以及预测的结构表明HIMP1蛋白是完整的膜蛋白。为了确定哪个细胞器包含HIMP1蛋白，在蔗糖梯度上分离αTC1.6细胞的部分(22)并对几种标记物进行免疫印迹和RIA。如所示B类HIMP1免疫反应峰值出现在第9组分中，该组分也含有线粒体热休克蛋白MtHsp70，而高尔基基质蛋白GM130和含胰高血糖素分泌颗粒鉴定的高尔基成分峰值分别富集在第8组分和第10组分。与这些分析一致，观察到HIMP1免疫反应与线粒体和细胞色素共定位c（c）αTC1.6细胞共聚焦免疫荧光染色的氧化酶（Cox）亚单位I(D类). 为了详细研究HIMP1蛋白的定位，在洋地黄素处理后通过离心分离线粒体外膜和内膜的两个部分(23)免疫印迹法检测。结果表明，HIMP1蛋白与Cox亚单位I等内膜（含基质的有丝分裂体）标记物共定位，而与电压依赖性阴离子通道蛋白（VDAC）这一外膜标记物不共定位(C类). 这些数据强烈表明HIMP1蛋白位于αTC1.6细胞的线粒体内膜。
HIMP1亚细胞定位分析。(A类)免疫印迹。M、 膜；细胞，胞浆；每条车道50μg蛋白质。(B类)通过蔗糖梯度离心分离的13个αTC1.6细胞组分中胰高血糖素RIA和蛋白质（GM130、MtHsp70和HIMP1）的免疫印迹分析。(C类)免疫印迹。PNS，核后上清液；线粒体粗分数；O、 外膜分数；有丝分裂体、内膜和基质(D类)共焦免疫荧光染色。(一)HIMP1。(b条)Cox亚单位I(c（c）)的合并图像一和b条。
为了验证这些发现，进行了免疫电镜研究，比较了αTC1.6细胞、心脏或睾丸样本中线粒体的免疫金标记(A类). 在αTC1.6细胞、心脏和与线粒体融合并缠绕在睾丸精子尾部鞭毛周围的螺旋形线粒体中，沿着线粒体内膜及其包被嵴可以清楚地识别出HIMP1的特异性免疫反应(A类). 未发现MIN6细胞线粒体的类似标记（数据未显示）。这些发现清楚地表明HIMP1蛋白定位于睾丸中的α细胞、心肌细胞和成熟精子细胞的线粒体内膜。
HIMP1的亚细胞定位和膜拓扑结构。(A类)免疫电镜检查αTC1.6细胞、心肌细胞和成熟精子中的HIMP1。(B类)体外合成的[35S] 用Tc消化HIMP1-a蛋白，并用SDS/PAGE凝胶进行分离，以进行放射自显影。(C类)含抗HIMP1血清的免疫沉淀剂，取自用/不用翻译产物Tc处理的等分样品B类进行SDS/PAGE放射自显影。(D类)HIMP1-a的膜拓扑草图，如在体外系统。(E类)经与不经Tc处理的线粒体外膜和内膜部分HIMP1的免疫印迹分析；有丝分裂体、内膜和基质(F类)αTC1.6细胞线粒体中HIMP1的膜取向示意图。N、 N端；C、 C端子；M、 膜。
因为有几个潜力t吨胰蛋白酶和c（c）胸腺蛋白酶（Tc）裂解位点存在于HIMP1的预测TMH区域之外，我们选择了参考文献中描述的方法。24使用在体外翻译HIMP1-a蛋白( B类和C类)并从αTC1.6细胞中分离出线粒体的外膜和内膜部分(E类). 我们最初测试了在体外合成的HIMP1-a可以插入犬胰腺微粒体膜，尽管缺乏正常定位于内质网的证据体内。如所示B类[35S] 与不含微粒体的对照组相比，用微粒体合成的HIMP1-a蛋白在Tc治疗期间受到部分保护（第4道vs.第3道）。根据分子标记的迁移，在16.5%三嗪SDS/PAGE凝胶上观察到的三个裂解产物的估计大小分别为9.4、7.8和6.7 kDa。这些分别对应于通过移除位于HIMP1-a的预测TMH和环区之外的C端、N端或N端和C端区域而生成的三个预测解理产物（图6B类). 此外，在环区没有发现解理的证据，支持其管腔定位。这些结果表明在体外翻译后的HIMP1-a可以插入微粒体膜，并且具有N的膜拓扑结构外部–C外部和循环里面方向(D类). 微粒体膜被线粒体污染的可能性被排除，因为αTC1.6细胞粗线粒体部分中的HIMP1不能被Tc处理消化，如免疫印迹所示，使用与B类（未显示数据）；这可能是由于完整线粒体外膜的保护作用。插入微粒体膜的原因在体外合成的HIMP1-a目前尚不清楚。合成全长HIMP1-a在里面有或无微粒体的体外培养(B类通道1和2），无论是否插入微粒体膜，都不会被内源性蛋白酶裂解，而控制蛋白的信号肽，大肠杆菌β-内酰胺酶在该系统中与微粒体合成时被去除（数据未显示）。确认N的发现外部方向，相同翻译混合物的等分B类经Tc处理或不经Tc治疗消化，用抗HIMP1血清免疫沉淀，用SDS/PAGE分离，并用放射自显影检查(C类). 结果表明，在存在或不存在微粒体的情况下，未经Tc处理的产物可免疫沉淀出完整的HIMP1-a（通道1和通道2）；但在Tc治疗后没有出现（第3和第4车道）。这一结果清楚地表明HIMP1-a插入微粒体膜在体外单位：N外部方向。
使用类似的程序，对αTC1.6细胞线粒体的外膜和内膜部分进行有或无Tc的消化，然后用N末端定向抗HIMP1血清进行免疫印迹检测。如所示E类HIMP1蛋白仅在未经Tc消化的内膜部分检测到，但在Tc消化后未检测到。VDAC蛋白是一种外膜标记物，可被一种针对其细胞溶质环的抗体识别，经Tc处理后也消失了(E类). HIMP1的大小与核后或粗线粒体组分中检测到的大小相同（数据未显示），并且没有与反向方向对应的HIMP1裂解产物，N里面–C里面和环路外部观察到。所有这些数据表明HIMP1蛋白通常以N为导向外部–C外部和循环里面线粒体内膜内(F类). 此外，没有证据表明HIMP1蛋白在运输过程中发生断裂，也没有在线粒体内膜中定位。
HIMP1-a在β细胞中的异位表达可保护细胞免受凋亡，延长细胞在低氧或低血糖条件下的存活时间。
线粒体的作用之一是与细胞凋亡的联系。因为HIMP1是一种线粒体蛋白，它被低葡萄糖或低O上调2，我们对其在β细胞中的可能作用感兴趣。为了研究这个问题，我们分析了在这些条件下，HIMP1-a在两种广泛使用的β细胞模型MIN6和βTC3细胞中异位表达的影响。来自几个稳定的MIN6HIMP1-a型克隆，克隆10细胞被选择用于实验，因为它们具有相似的表达水平( A类)和线粒体定位(B类)HIMP1-a蛋白与αTC1.6细胞的比较。如所示C类在缺氧（5%）条件下24小时，克隆10细胞与载体控制的MIN6细胞相比，凋亡细胞百分比显著降低（0.95±0.14%vs.2.13±0.13%，P（P）= 0.02). 在瞬时转染载体或HIMP1-a cDNA的βTC3细胞中，对TUNEL、HIMP1-a和DAPI进行三重染色(D类). 结果总结于E类，表明HIMP1-a转染的βTC3细胞的凋亡百分率（2.53±0.13%，P（P）=0.028），或仅HIMP1阳性βTC3细胞（0.17±0.12%，P（P）=0.0003），显著低于未转染对照细胞（4.06±0.36%）。
HIMP1-a在MIN6和βTC3β细胞中的异位表达可保护细胞免受凋亡，并延长细胞在缺氧（5%2)持续24小时(A-C公司)稳定MIN6中的分析HIMP1-a型克隆细胞。(A类)免疫印迹，每车道50μg蛋白质。(B类)MIN6共聚焦免疫荧光染色HIMP1-a型克隆10个细胞。（比例尺，50μm）(C类)HIMP1-a对缺氧24小时MIN6细胞存活的保护作用(D类和E类)βTC3细胞瞬时转染试验。(D类)转染任一载体的βTC3细胞中TUNEL（红色）、HIMP1-a（绿色）和DAPI（蓝色）的三重染色图像(一和b条)或HIMP1-a(c（c）和d日)在缺氧条件下持续24小时（比例尺，50μm）(E类)HIMP1-a对缺氧24小时βTC3细胞存活的保护作用。
为了揭示HIMP1-a的这种作用是否在另一种应激下持续，我们使用类似的方案检查了高（25 mM）或低（2.5 mM）葡萄糖水平的影响。如所示 A类在正常条件下，接种等量的细胞进行48h的预培养后，对克隆10和对照细胞进行TUNEL/DAPI双重染色，并在不同时间点使用差异界面对比（DIC）显微镜进行形态学观察。在3天时间点观察到的存活率和凋亡率如所示 B类和C类分别是。在低血糖状态下，克隆10细胞的存活率显著高于载体对照组（44±3.8%vs.15±2.1%，P（P）=0.001），相应的凋亡百分比显著降低。在高糖状态下，凋亡克隆10细胞的数量也显著低于对照培养物（2.3±1.2%vs.5.5±1.9%，P（P）=0.0002），但在生存率方面没有观察到显著差异。为了进一步验证这些发现，在用载体或HIMP1-a cDNA瞬时转染的βTC3细胞中进行了类似的实验( D类——G公司). 免疫印迹证实异位HIMP1-a在βTC3细胞中的表达(D类). 转染HIMP1-a的βTC3细胞中DAPI、TUNEL和HIMP1的三重染色(E类)或使用与D类.染色细胞分析(F类)结果表明，在低血糖状态下，转染HIMP1-a的βTC3细胞的存活率显著高于对照组（37.2±1.6%vs.29.3±1.2%，P（P）=0.02），而相应的凋亡细胞百分比则相反。高糖时(G公司)HIMP1-a转染的所有βTC3细胞的凋亡率（5.9±0.6%）均低于对照组（8.8±0.5%，P（P）=0.064），而HIMP1阳性染色的βTC3细胞显著低于对照组（8.8±0.5%，P（P）= 0.0078). 然而，在这种葡萄糖水平下，存活率没有明显差异。这些数据表明，HIMP1蛋白可以提高β细胞在缺氧或低血糖条件下的存活率。
HIMP1-a在MIN6和βTC3β细胞中的异位表达可保护细胞免受凋亡，并延长β细胞在高（25 mM）或低（2.5 mM）葡萄糖水平下暴露3天后的存活时间。(A类——C类)稳定MIN6中的分析HIMP1-a型克隆细胞。(A类)MIN6的DIC图像和TUNEL（红色）和DAPI（蓝色）双重染色HIMP1-a型克隆10和对照细胞在低血糖和高糖下。（比例尺，50μm）(B类)HIMP1-a对低血糖时MIN6细胞存活的保护作用。(C类)HIMP1-a对高糖下MIN6细胞存活的保护作用。(D类——G公司)βTC3细胞瞬时转染试验。(D类)βTC3细胞HIMP1-a表达的免疫印迹分析。(E类)TUNEL三重染色图像样本（红色图像B类)，HIMP1-a（绿色图像B类)和DAPI（蓝色图像A类)在用HIMP1-a转染的βTC3细胞中，在高葡萄糖下培养3天。（比例尺，50μm）(F类)HIMP1-a对低血糖时βTC3细胞存活的保护作用。(G公司)HIMP1-a对高糖下MIN6细胞存活的保护作用。
因为线粒体是细胞能量的主要来源，与胰岛素分泌有关(20)因此，评估β细胞中HIMP1-a的异位表达是否影响ATP生成和胰岛素分泌是很有意义的。在MIN6中未观察到这些参数的显著变化HIMP1-a型在正常生长条件下克隆10个细胞（数据未显示）。因此，HIMP1对β细胞存活的保护作用似乎不太可能由对ATP产生的直接影响介导。
讨论
在鉴定α与β细胞中差异表达蛋白的研究过程中(25)我们已经鉴定出一种小蛋白，它存在于α细胞、心脏和其他组织中，但在β细胞中缺失或含量很低。同时，该蛋白已被发现在其他细胞类型中表达，其同源物已被几个群体证明存在于其他物种中(26——31). 它在真核生物，包括低等脊椎动物和果蝇属，暗示了一个重要的功能。在小鼠中，一个基因编码这种蛋白质，我们称之为HIMP1，通过选择性剪接产生两种仅在C末端不同的亚型。该蛋白的预测结构表明，它是一种由两个疏水螺旋组成的完整膜蛋白，长度为21–23个残基，可能会在双层上形成一个发夹状环。事实上，当在无细胞系统中表达时，发现该蛋白被插入微粒体中，微粒体的N端和C端都位于外部，腔侧有一个中心小环( B类——D类). 然而，αTC1.6细胞匀浆在蔗糖梯度上的分离不支持ER/Glgi定位，而是指向线粒体作为主要亚细胞位置。HIMP1的线粒体内膜定位得到了很好的证实。由于在胰高血糖素颗粒组分中观察到一些HMIP1免疫反应性，因此研究了其可能位于分泌颗粒或ER以及线粒体中(B类). 免疫电子显微镜和抗HIMP1抗体和ER或颗粒标记物双重染色在αTC1.6细胞中的观察结果不支持这些可能的定位（数据未显示）。HIMP1与P4501A1蛋白N端信号序列的比较，P4501A1蛋白质对内质网和线粒体具有双重靶向性(32)，除了一些共享的带正电残基对线粒体靶向至关重要之外，没有显示出太多的一级序列相似性(33). 原因是在体外HIMP1-a插入微粒体膜是一个有待研究的问题。进一步的免疫细胞化学分析证实了线粒体的定位，并表明主要定位于嵴。随后的分馏实验证实，内线粒体膜是α细胞、心脏和精子尾部线粒体中该蛋白的主要部位(). 此处的拓扑结构再次显示为N和C端子在外，中心回路在内(). 此外，物种高度保护尤其包括跨膜结构域，这可能表明这些结构域或与自身相互作用，形成低聚物结构，如通道，或与线粒体内膜的某些其他成分相互作用。因此，HIMP1蛋白具有类似于某些钾通道蛋白的膜拓扑结构，并且还具有K的关键结构要求（Tyr–Gly）+通道孔(34)，但不是保守的签名序列（Gly–Tyr–Gly）(35). 由于心脏和精子线粒体在新陈代谢中高度活跃，这种蛋白质可能具有调节作用。
进一步研究( A类和C类)发现在低葡萄糖水平下培养时，HIMP1在αTC1.6细胞中上调。此外，与报道的同源物一样(26,27)缺氧暴露于αTC1.6细胞后，HIMP1水平也升高，这与其他几种细胞类型的缺氧诱导HIMP1的情况一致(28,29). 这些发现表明了其在代谢或氧化应激中的作用。为了寻求这种可能性，我们尝试在MIN6细胞中稳定表达HIMP1。获得了几个阳性克隆，其中一个克隆的表达水平与αTC1.6细胞中的表达水平相似，将其暴露在高或低葡萄糖条件下数天。我们惊讶地发现，HIMP1的存在显著提高了细胞在低血糖时的存活率，但在高糖时没有显著提高。这种对存活率的影响伴随着两种葡萄糖浓度下凋亡细胞死亡率的显著降低。受这些发现的启发，我们比较了已知与α和β细胞凋亡和/或氧化应激相关的细胞蛋白的表达。令人惊讶的是，所有实例中只有微小的差异（数据未显示）。
线粒体作为一种重要的细胞器，以不同的数量存在于大多数真核细胞中(36). 大量证据表明线粒体是细胞凋亡的重要调节器。因此，除了它们作为具有各种氧化和生物合成途径的细胞成分和作为细胞ATP供应的动力植物的作用外，它们还是细胞代谢和凋亡整合的场所(19). 尽管β细胞中线粒体对胰岛素分泌的重要性早已被认识到(20,37)它们与β细胞凋亡倾向的联系尚不清楚。
尽管可能存在其他具有潜在互补功能的分子，但这里的数据支持这样的结论，即β细胞中的线粒体同时缺乏HIMP1和已知同源物。因此，通过研究HIMP1在线粒体中的作用，可以深入了解β细胞线粒体凋亡敏感性的相关机制。心肌细胞中HIMP1的高水平表达表明了其重要作用，可能是使这些细胞适应其强有力的工作角色和/或高效利用代谢燃料。许多真核生物（包括脊椎动物和无脊椎动物）对该基因的保护也符合进化上保守的基本功能。进一步了解HIMP1的相互作用可能为治疗糖尿病和/或预防因线粒体功能障碍（如心力衰竭）导致的其他疾病提供策略(36,38)。
材料和方法
有关更多详细信息，请参阅支持文本，作为支持信息发布在PNAS网站上。
细胞培养、胰岛分离、RNA制备、RT-PCR、Northern Blot和体外合成。
程序已描述(25,39). 将HIMP1-a cDNA克隆到pcDNA3.1（+）载体中，用于在体外合成和转染。
抗体、免疫印迹、免疫沉淀和组织学。
在兔子体内培养抗HIMP1 N末端1–17残基的抗血清。抗mtHsp70、VDAC、COX亚单位I、GM130、胰高血糖素、C肽和微管蛋白的抗体都是商业购买的。
免疫印迹、免疫沉淀和免疫荧光染色的方法与上述方法类似(25,39). TUNEL染色采用改良的DeadEnd系统（Promega）进行。对于免疫电子显微镜，将切片样品安装在网格上，并在用金标抗HIMP1血清染色后进行检查。
亚细胞分馏和拓扑研究。
如前所述，分离细胞膜和胞浆部分或蔗糖梯度分馏(22,40). 分离的部分通过免疫印迹分析和/或通过RIA测定胰高血糖素。线粒体的外膜和内膜部分通过洋地黄素处理分离(23). 拓扑研究采用Blobel和Dobberstein方法进行(24)使用在体外合成HIMP1-a蛋白和线粒体的各种膜亚组分，有或没有Tc处理。
HIMP1-a在MIN6细胞中稳定表达，在βTC3细胞中瞬时表达。
将HIMP1-a或载体质粒DNA转染至MIN6或βTC3β细胞。永久表达HIMP1-a的MIN6细胞克隆，称为MIN6HIMP1-a型用G418-resistant和抗HIMP1血清的免疫印迹筛选。βTC3细胞用于瞬时转染研究。
HIMP1-a异位表达的β细胞在不同O条件下的凋亡和活力检测2或葡萄糖条件。
等量克隆10 MIN6HIMP1-a型和载体控制细胞受到缺氧（5%O2)和正常培养条件（95%空气/5%CO2)24小时，或在95%空气/5%CO中进行低（2.5 mM）或高（25 mM）葡萄糖DMEM培养2培养箱培养3天。在βTC3细胞中，转染后48小时，细胞接受与MIN6相同的处理HIMP1-a型细胞。支持信息中提供了总细胞、凋亡细胞和活细胞的数量和百分比的测定、计数和计算方法。
数据以平均值±SEM表示。学生评估了统计显著性t吨测试*，P（P）< 0.05; ∗∗,P（P）< 0.01; ∗∗∗,P（P）< 0.0005.
致谢
我们感谢Raymond Carroll、Jeff Stein、Vytas Bindokas、Yingli Duan和William Chutkow（芝加哥大学）的技术援助；罗西·里克斯（Rosie Ricks）为准备这份手稿提供专家协助；Graeme Bell、Louis Philipson、Manami Hara、Gene Webb（芝加哥大学）和Paul Schumaker（芝加哥西北大学）进行了有益的讨论。这项工作得到了国立卫生研究院DK-13914和DK-20595以及霍华德·休斯医学研究所的支持。
缩写
| TMH公司 | 跨膜螺旋 |
| 温度控制（Tc） | 胰蛋白酶和糜蛋白酶。 |
工具书类
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