简介
极化上皮细胞是最常见的细胞极性类型之一，其顶端表面面向管腔，基底外侧表面面向其他细胞和细胞外基质(Drubin和Nelson，1996年;莫斯托夫等。, 2000). 另一类细胞极性存在于迁移细胞中，包括细胞在发育过程中的运动、趋化性、伤口愈合和转移(纳比，1999年;弗兰兹等。, 2002;韦伯等。, 2002). 在这些类型的运动中，细胞在运动方向上发生极化。迁移极化似乎与上皮细胞看似更为静态的极化截然不同。然而，上皮细胞可以被诱导成为能动的，并呈现出类似于迁移细胞（如成纤维细胞）的形态和极化。这发生在发育或肿瘤发生的上皮-间充质转化过程中(阿里亚斯，2001;萨瓦格纳，2001). 在此，我们重点关注细胞如何从上皮极性转变为迁移极性。
解决这一问题的一种模型是用肝细胞生长因子（HGF）治疗极化上皮细胞，如Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞(伯奇迈尔和格拉迪，1998年). HGF也被称为分散因子，因为它会诱导MDCK细胞在固体支架上过快生长，从而“分散”，即变得高度能动(Comoglio和Boccaccio，2001年). 在细胞外基质（如I型胶原）三维凝胶中生长的细胞中，也可以研究从上皮极性到迁移极性的转变。这些培养条件可能更接近体内环境，并为研究多细胞上皮结构的形成提供了有用的模型系统(小丑等。, 2001;奥布莱恩等。, 2002;塞赫尔斯等。, 2003).
当MDCK细胞的单细胞悬浮液嵌入这种凝胶中时，细胞分裂并形成球形囊肿，其中一层细胞包围着中央管腔。细胞极化，顶面朝向管腔(奥布莱恩等。, 2001). 用HGF治疗这些囊肿，使其形成精细的分支小管。这个过程涉及细胞极性和运动的一系列复杂变化(蒙特萨诺等。，1991年a,b条;Metzger和Krasnow，1999年;Hogan和Kolodziej，2002年;奥布莱恩等。, 2002). HGF诱导的小管生成可分为四个阶段，称为延伸、链、索和小管(波拉克等。, 1997,1998). 添加HGF后约6-12小时，一些细胞产生伸长，大伪足从其基底外侧表面凸出。这些细胞保留一个小的顶端表面，因此是单层的一部分。～24小时，一到三个细胞链从囊肿中伸出。在这个阶段，细胞失去了顶端-基底极性。随后，链子转变成两到三个细胞厚的绳索。细胞之间形成由新建立的顶端表面排列的小管腔。这些管腔扩张，最终形成一个与原囊肿管腔相连的管腔，标志着成熟小管的完成。
在此，我们研究了囊肿壁单层细胞形成延伸和链的早期阶段，因为这些可能对应于上皮极性向迁移细胞极性的转变。这些阶段也涉及细胞运动，因为延伸的形成涉及部分细胞的运动，而链的形成涉及整个细胞远离囊肿的运动。为了分析延伸和链形成的潜在机制，我们研究了四类已知参与其他系统中极化和运动的分子和过程。1） 磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）。我们发现PI3K的产物集中在伸展的前沿，伸展形成需要PI3K。2). 微管。令人惊讶的是，延伸形成并不需要微管动力学。3). Rho效应器，Rho激酶（ROCK）。我们发现ROCK决定了扩展的数量和长度。4). 细胞分裂。延伸形成不需要细胞分裂，但链的形成需要细胞分裂。当细胞分裂并向外迁移形成链时，它们将分裂方向从平行于单层平面改变为大致垂直于单层平面。这是一个在实验可处理的哺乳动物系统中定向细胞分裂的例子，这将有助于未来对这一重要过程的分析。
材料和方法
细胞培养、膀胱生成和肾小管生成
MDCK细胞保存在含有Earle平衡盐溶液（Cellgro；Mediatech，Herndon，VA）的最低基本培养基中，补充5%胎牛血清（Hyclone Laboratories，Logan，UT），100单位/ml青霉素，100μg/ml链霉素（以下为对照培养基），5%CO295%空气。为了使细胞在三维胶原凝胶中生长，将细胞胰蛋白酶化，然后在室温下研磨成4×10的单细胞悬浮液4含有66%卵黄蛋白100的I型胶原蛋白溶液中的细胞数/ml（3 mg/ml；Cohesion Technologies，加利福尼亚州帕洛阿尔托）(波拉克等。, 1998;奥布莱恩等。, 2001). 将悬浮细胞镀到Nunc Anopore过滤器上（直径10 mm，孔径0.02-μm）。胶原蛋白混合物在37°C、5%CO下培养30分钟295%的空气使胶原蛋白凝胶，然后添加对照培养基。细胞每3天喂养一次，并生长7–10天，直到形成带腔的囊肿。对于小管生成，用含有MRC5人肺成纤维细胞HGF的1:1条件培养基（CM）刺激7天大的囊肿：对照培养基。
细胞转染
早期传代MDCK细胞在10-cm塑料培养皿上生长至～30%的汇合处，转染20μg编码绿色荧光蛋白（GFP）-α-微管蛋白（BD Biosciences）的cDNA表达载体Clontech公司，加利福尼亚州帕洛阿尔托），GFP-pleckstrin同源性（PH）-Akt(仆人等。, 2000)或GFP-肌球蛋白轻链（MLC），根据之前发布的协议(布莱特菲尔德等。, 1989;利普舒兹等。, 2001). 转染后72小时，将转染细胞重新置于含有700μg/ml G418的培养基中。每3-4天更换一次培养基。G418选择12天后，挑选存活的克隆并筛选GFP表达。表达GFP标记蛋白的克隆通过共焦激光扫描显微镜观察和用1:1000稀释的抗GFP抗体进行Western blot检测。选择在胶原蛋白凝胶中形成囊肿的每个克隆体进行使用。所有细胞系均用G418进行筛选。
抗体和试剂
本研究中使用的主要抗体是小鼠抗顺-Golgi酶GM130（肯塔基州列克星敦市转导实验室）、小鼠抗α-微管蛋白抗体（密苏里州圣路易斯市Sigma-Aldrich）、山羊抗P-MLC（Thr18，Ser19）和兔抗-MLC（加州圣克鲁斯市圣克鲁斯生物技术）。所使用的二级抗体是抗小鼠Alexa 594（Molecular Probes，Eugene，OR）。肌动蛋白丝用Alexa Fluor 488 phaloidin（Molecular Probes）染色。用TOPRO-3（分子探针）标记细胞核。本研究中使用的试剂为诺卡唑和LY29004（Sigma-Aldrich）、丝裂霉素C和Y27632（加州圣地亚哥Calbiochem）以及G418（加州卡尔斯巴德Invitrogen）。
MLC水平的Western Blot分析
MDCK细胞在24 mm直径的孔中生长汇合，然后分别用CM、CM和30μM Y27632和Y27631处理16 h。在500μl Triton X-100裂解缓冲液（10 mM三乙醇胺，pH 7.4，1.0%Triton X-100%，0.1%SDS，100 mM NaCl，1 mM EDTA，1 mM-EGTA，1 m M NaF，20 mM Na）中裂解细胞4P2O（P2O）7和2 mM Na三沃4). 将裂解液煮沸5分钟并通过离心进行清除。蛋白质浓度通过双钦酸蛋白质分析测定(皮尔斯化学公司，Rockford，L），并在4-15%SDS-PAGE凝胶上电泳等量的蛋白质(美国伯乐，Hercules，CA），免疫印迹，并用增强化学发光系统检测（PerkinElmer Life Sciences，Boston，MA）
用试剂治疗MDCK囊肿
LY294002。
将7天大的MDCK囊肿与20μM LY294002在37°C的CM中孵育16 h。作为对照，囊肿仅用CM处理16 h。对于链形成，囊肿用CM处理16h以产生延伸，然后用20μM的LY29400 2在CM中处理。
诺卡唑。
将7天龄的囊肿在4°C下预孵育1小时，然后分别在37°C下的200 ng/ml诺卡唑溶液中孵育16或40小时。作为对照，囊肿仅用CM治疗16或40小时，不进行4°C的孵育。为了在小管形成期间将细胞阻滞在有丝分裂阶段，用CM刺激囊肿72小时，然后在200 ng/ml诺可唑中再培养24小时。
丝裂霉素C。
七天大的囊肿在37°C下用0.5 ng/ml丝裂霉素C预孵育过夜，然后在37°C下用CM中的丝裂霉素C分别处理16或40小时。作为对照，囊肿仅用CM治疗16或40小时。
免疫荧光染色
免疫荧光染色的程序在以前的出版物中有详细描述(波拉克等。, 1998;奥布莱恩等。, 2001). 所有样品用磷酸盐缓冲盐水+快速冲洗两次，然后在37°C下用VII型胶原酶（Sigma-Aldrich）处理10分钟。在室温下用3%多聚甲醛固定30分钟，用0.25%Triton X-100固定10分钟，然后用50 mM NH淬火4Cl作用10分钟，用0.1%皂苷和0.7%明胶渗透30分钟。然后将样品在4°C的一级抗体中培养过夜。充分清洗后，样品在37°C下用0.1 mg/ml核糖核酸酶处理10分钟，然后在4°C下以1:50的稀释度在Alexa 594-结合二级抗体1:200稀释液和Alexa Fluo 488-鬼臼肽中培养过夜。清洗后，用TOPRO3在37°C下以1:500的稀释度对囊肿进行染色，染色时间为1小时。所有样品用Prolong培养基（分子探针）固定，然后在室温下干燥过夜。
时间段图像
表达GFP-α-微管蛋白的细胞在上述三维胶原凝胶中生长。使用涂有Sigmacote（Sigma-Aldrich）涂层的玻璃盖底腔室（Nalge Nunc，Naperville，IL）生长囊肿，以获得活细胞图像。培养7天后，将囊肿在无酚红培养基中培养48小时，然后喂入无酚红Leibovitz的L-15培养基，以允许在含有1%抗生素和5%胎牛血清的室内空气（Invitrogen）中培养2天。因此，我们使用了重组人HGF（rhHGF；加州南旧金山Genentech的R.Schwall慷慨捐赠）在这些实验中，因为CM中的缓冲成分与活细胞成像不兼容。用510共焦显微镜（德国耶拿卡尔蔡司公司）通过氩激光和60×水浸透镜观察经rhHGF（100 ng/ml）处理8小时或未经处理的囊肿。通过使用温度控制阶段将温度保持在37°C。一旦发现分裂细胞，就会收集延时图像作为TIFF文件，然后使用NIH 1.62和Adobe PhotoShop软件进行分析。
图像分析
相位对比照片由配备有Aviovert 100显微镜（卡尔蔡司）的数码相机（Hamamatsu，Bridgewater，NJ）通过使用开放实验室软件拍摄。然后将图像转换为PhotoShop格式。扩展数量的量化如前所述(波拉克等。, 1997;利普舒兹等。, 2000). 用1024共焦激光扫描显微镜观察免疫荧光染色样品(美国伯乐)配备Eclipse TE显微镜（日本东京尼康）或两台不同的510 LSM共焦显微镜（卡尔蔡司），其中一台配有加热台。图像作为原始文件收集，然后使用PhotoShop软件进行分析。
结果
PI3K在扩展和链中的作用
PI3K与趋化中性粒细胞的极化有关，粘液菌和成纤维细胞(Firtel和Chung，2000年;哈夫等。, 2000;仆人等。, 2000;Comer and Parent，2002年;王等。, 2002). 在这些细胞中，PI3K的磷脂产物不对称地积聚在前缘的质膜上。相反，在星形胶质细胞伤口愈合过程中，伤口边缘细胞的极化和迁移与PI3K无关(艾蒂安·曼尼维尔和霍尔，2001年).
已知PI3K被HGF激活(Khwaja河等。, 1998;镰仓等。, 2000). 为了研究PI3K在HGF诱导的小管形成的特定阶段中如何以局部方式发挥作用，我们制备了一株表达GFP的MDCK细胞系，该细胞系融合到Akt的pleckstrin同源结构域（GFP-PH-Akt），用作PI3K磷脂产物（磷脂酰肌醇-3,4-P）的探针2和-3,4,5-P三). 为了用HGF模拟细胞，我们通常使用由MRC5成纤维细胞调节的培养基（条件培养基，CM）。CM含有高浓度的HGF，这是CM中的促小管生成活性（图、A和B）(蒙特萨诺等。，1991年a,b条). 事实上，当我们向CM中添加2.5μg/ml的中和抗HGF抗体时，肾小管生成被完全消除（图C） ●●●●。我们发现，在对照囊肿中，GFP-PH-Akt均匀地定位于基底外侧膜，但不包括在顶部表面（图D） 。之前在滤膜上作为单层生长的MDCK细胞中也观察到类似的探针定位(Watton and Downward，1999年), (蒙特萨诺等。，1991年a,b条). 在用CM处理16小时并形成延伸的细胞中，GFP-PH-Akt在延伸中显著累积，因此提示PI3K可能参与延伸形成（图E） ●●●●。
PI3K在HGF诱导的延伸和链形成中的作用。（A–C）相位对比度图像。（A） 未经治疗的囊肿。（B） 用CM处理囊肿16小时，以形成扩张。（C） 在2.5μm/ml抗rhHGF IgG的存在下，用CM处理囊肿16小时，该IgG可抑制扩张的形成。（D和E）表达GFP-PH-Akt的囊肿的共焦荧光图像。（D） 未经治疗的囊肿。（E） 用CM刺激表达GFP-PH-Akt的囊泡16小时以形成延伸。（F–H）相位对比度图像。（F） 用CM处理囊肿16小时（G）在20μM LY294002存在下用CM处理囊16小时。（H） 用CM和20μM LY294002处理囊肿16小时，然后冲洗LY294002，然后用CM再处理24小时。（I）用CM刺激40小时以形成链的表达GFP PH Akt的囊肿的荧光图像。（J） 用CM刺激囊肿40小时以产生链。绿色、蓝色为细胞核的荧光类卵磷脂。（K） 用CM刺激囊肿16小时，然后用CM和20μM LY294002再处理24小时。如J.Bars染色，A、B、C、F、G和h染色50μM，D、E、I、J和K染色10μM。
接下来，我们用一种特异性PI3K抑制剂LY294002治疗囊肿。在20μM时，LY294002强烈抑制了延伸的形成，并导致囊肿只形成很少的短而薄的延伸（对比图、F和G）。用25μM沃特曼素治疗后也获得了类似的结果（我们未公布的数据）。此外，在药物洗脱后，LY294002和沃特曼处理细胞中的延伸形成（我们未发表的数据）完全恢复（图H） 这一观点反驳了药物的作用可能是由于毒性或诱导细胞凋亡。这些发现表明在伸展形成期间需要PI3K。
我们还检测了GFP-PH-Akt在用CM处理40小时以形成链的细胞中的定位。与囊肿中的非刺激细胞或含有延伸物的CM-刺激细胞相比，链状细胞的GFP-PH-Akt均匀分布在整个质膜周围（图一） ●●●●。为了测试PI3K在链形成中的作用，我们首先用CM处理囊肿16小时以产生延伸，然后在CM持续存在和LY294002同时存在或不存在的情况下，将囊肿再培养24小时。正如预期的那样，在没有LY294002的情况下，延伸部分继续形成链条（图J） 。然而，在LY294002存在的情况下，没有发现链，实际上几乎没有延伸（图K） ●●●●。据推测，LY294002导致了已经形成的延伸部分坍塌。
高尔基定向
在几种细胞类型（如成纤维细胞、T细胞和星形胶质细胞）的迁移过程中，高尔基体重新朝向前缘(Schliwa和Hóner，1993年;自动加料机等。1995年;Nobes和Hall，1999年;Etienne Manneville和Hall，2001年). 这可能有助于将生物合成囊泡和再循环囊泡输送到质膜的生长区域。因此，很有意思的一个问题是，高尔基人是否同样转向了延伸和/或链条的前沿。如前所述，在对照囊肿中，高尔基体位于顶面下方，即细胞核和顶面之间（图A）(奥布莱恩等。, 2001). 令人惊讶的是，对于保留在囊肿壁中并有延伸的细胞，用CM治疗16小时后，高尔基体并没有朝向延伸的前缘。相反，在100%（n=30）的此类细胞中，高尔基体仍位于顶端表面以下（图B） ●●●●。其中一些细胞只剩下很小的顶面，细胞核开始离开囊肿。相反，CM 40小时后，对于链状细胞（即没有可检测到的顶端表面），高尔基体经常重新定向。对于链顶端的细胞，69%的高尔基体现在定向在前缘（示例如图所示B） 而只有18%的高尔基体仍朝向囊肿壁，13%的高尔基体位在细胞两侧（n=61）。在位于链中部的细胞中（即，既不在囊壁也不在链的顶端），高尔基体明显是随机定位的（31%朝向囊壁，36%朝向囊顶，33%朝向囊膜，n=45）。
高尔基体在伸展和链中的取向以及诺可唑对伸展和链形成的影响。（A） 用CM处理囊肿16小时以延长。高尔基体标记物（GM130）为红色，荧光性卵磷脂为绿色，细胞核为蓝色。一个细胞形成了一个延伸部分，在该延伸部分的尖端，靠近面板的右边缘处有肌动蛋白的浓度。该细胞仍有一个小的顶面，位于囊肿腔的深凹痕底部。请注意，该细胞中的高尔基体仍位于顶端表面下方（箭头所示）。（B） 用CM处理囊肿40小时，形成短链。链中的细胞离开了单层。请注意，细胞核靠近保留在单层细胞中的细胞核。箭头表示链状细胞中的高尔基体，朝向细胞的前缘，远离囊肿。（C和C′）诺卡唑处理的伸展中高尔基体的解体。将囊肿在4°C下预孵育1 h，然后用CM和200 ng/ml诺卡唑处理16 h。（C） 与A.C′染色一样，仅通过GM130染色强调高尔基体碎片。（D） 将囊肿在4°C下预孵育1 h，然后用CM和200 ng/ml诺卡唑处理16 h。绿色是荧光性的卵磷脂，蓝色是细胞核，红色是微管。可以看到相当正常的延伸。（E） 与D组一样，除了治疗40小时外。注意，囊肿内和周围的许多细胞在有丝分裂（红纺锤体）中停滞。棒材，10μm。
微管动力学的作用
高尔基体通常位于中心体或微管组织中心附近，其定位可以作为微管组织中枢位置的标记。中心体在某些类型的细胞（如中国仓鼠卵巢）迁移过程中重新定向，而在其他类型的细胞中（如PtK）则不重新定向(伊冯等。, 2002). 考虑到高尔基体定位的变化，我们询问微管（MT）的动态变化是否在延伸和链的形成中发挥作用(Wittmann和Waterman-Storer，2001年). 虽然极化上皮细胞中的MT相对稳定，并且耐诺可唑解聚，但低浓度的该药物（例如200 ng/ml）可以阻断MT动力学(巴斯克斯等。, 1997). 将囊肿在4°C下预孵育1 h，然后在37°C下与CM孵育16或40 h，是否存在200 ng/ml诺康唑。经过16小时和40小时的诺克唑治疗后，具有有丝分裂象的细胞数量（大多数具有正常外观的纺锤体）分别增加了13倍和41倍，从而证实诺克唑抑制了MT动力学。（较高浓度的诺卡唑产生异常纺锤波。）碎片高尔基体对MT动力学的抑制作用更为明显（图、C和C′）。在16小时时，用诺卡唑治疗的囊肿已形成扩展，其数量、大小和形状与诺卡唑阴性对照组相似（图、C和D，与图中的控制进行比较、B和E）。然而，在40小时时未观察到链形成。囊肿外可见一些孤立的圆形细胞，但这些细胞似乎没有相互接触或与囊肿接触（图E） ●●●●。由于诺卡唑对MT动力学的抑制，这些细胞似乎在有丝分裂中停滞。这与仅用CM治疗40小时的对照组中观察到的形态良好的链形成对比（图、I和J）。
肌动蛋白细胞骨架和Rho激酶的作用
我们观察到，肌动蛋白抑制剂latrunculin B和jasplakinolide（我们未发表的数据）阻断了延伸和链的形成。肌动蛋白细胞骨架在细胞极性和运动中的功能由Rho家族的小GTPases调节，如Rho、Rac和Cdc42(Bishop and Hall，2000年;雷德利，2001).
我们以前曾报道过，Rac1的显性阴性形式导致囊肿极性反转(奥布莱恩等。, 2001)并防止因HGF而导致的肾小管化（O'Brien和Mostov，未发表数据）。我们在Cdc42的显性阴性版本中也发现了类似的结果（Datta和Mostov，未发表的数据）。为了研究RhoA在延伸和链形成中的作用，我们使用了药物Y27632，该药物可以阻断RhoA的主要效应器ROCK I和ROCK II(乌哈塔等。, 1997). ROCK对于维持皮层肌动蛋白网络以及应力纤维的形成和收缩性是必要的(Nobes and Hall，1999年). 我们首先用30μM Y27632单独处理细胞24小时。虽然经处理的囊肿在相差显微镜下看起来几乎正常（我们未发表的数据），但使用荧光卵磷脂的共焦显微镜显示存在非常短的基底外侧延伸（对比图A、 对照组，用E，Y27632处理）。使用Y27632治疗后3小时，这些扩展就可见，与仅使用CM治疗3小时后的扩展相当（我们的未公开数据）。然而，仅限CM的延长线继续增长，而仅限Y27632的延长线在时间>3小时时明显保持相同的长度（我们的未发布数据）。
岩石参与延伸和链形成。囊肿的共焦显微照片。Phalloidin染色呈绿色，细胞核呈蓝色。（A） 未经治疗的囊肿。（B、C和D）分别用CM治疗囊肿24、40或72小时。（E） 用30μM Y27632处理24小时的囊肿（F–h）分别用CM和Y27631处理24、40或72小时的囊肿。棒材，A和E中为10μm；所有其他面板中为50μm。
当用CM和30μM Y27632处理细胞24小时时，我们注意到延伸的数量和长度显著增加（图3，与B和F相比）。24小时时延伸的数量增加了~9.5倍（仅CM有59个囊肿，CM+Y27632有35个囊肿）。仅CM组的平均伸展长度为32.2±5.0（SD）μm，Y27632+CM组为67.8±8.4μm（每组55次伸展）。综上所述，这些数据表明，ROCK通常会限制扩展的数量和长度。我们还研究了Y27632对链形成的影响。在用CM和Y27632治疗40或72小时的囊肿中，细胞从囊肿中移出（图，将C与G进行比较，将D与H进行比较）。然而，这些细胞与相邻细胞失去了联系，形成了孤立的细胞（图。、G和H）。没有看到链条。
令人惊讶的是，除了移离囊肿外，一些细胞在24小时后移到囊肿中心（图F） 到40-72小时，囊肿的腔被迁移到其中的细胞所覆盖（图、G和H）。这表明Y27632破坏了正常情况下导致细胞只向远离囊肿的方向迁移的定向机制，相反，它允许细胞向多个方向迁移。
ROCK有几种已知基底。其主要底物之一是肌球蛋白磷酸酶，它导致磷酸化肌球蛋白轻链（P-MLC）升高(木村等。, 1996). P-MLC又与肌球蛋白II细丝的组装和肌球蛋白ATP酶活性的激活相关(Chrzanowska-Wodnicka和Burridge，1996年). MLC也可能是ROCK的基底(天野之弥等。, 1996). 我们使用一种对P-MLC特异的山羊抗体（在Thr18和Ser19上磷酸化）来定位P-MLC。在囊肿壁单层细胞中，未经治疗的囊肿的大部分P-MLC信号位于基底表面（图A） 与基底表面下方的肌动蛋白应力纤维一致（我们未发表的数据）。一些P-MLC在顶部集中在紧密连接区域（箭头）。
P-MLC和GFP-MLC的本地化。（A、A′和A“）未经治疗的囊肿的共焦显微照片。P-MLC（A，合并A中的红色）。箭头表示TJ区域的P-MLC。GFP-MLC（A′，合并时为绿色）主要定位于基底质膜，细胞核呈蓝色。（B、D和F）P-MLC分别在Y27632治疗后延长（B，16 h CM）、链（D，40 h CM）和延长（F，16 h CM+30μM Y27633）。（B） 实心箭头表示P-MLC与基底外侧质膜延伸相关。（D） 开放箭头表示链状细胞细胞质中的P-MLC。左开放箭头位于单元格的前导区域，而右开放箭头位于单元的尾部区域。（F） 星号表示狭长的延伸。（C、E和G）GFP-MLC分别用于Y27632治疗后的延长期（C，16 h CM）、链期（D，40 h CM）和延长期（G，16 h CM+30μM Y27633）。GFP-MLC主要位于基底外侧膜，但在顶部靠近紧密连接处（箭头）观察到一些染色。（H） CM和Y27632不影响MCL表达水平。24 mm微孔上的汇合MDCK细胞未经处理，或在没有或存在30μM Y27632的情况下用CM处理16小时，或单独用Y27631处理16小时。使用抗MLC抗体通过Western blotting检测全细胞裂解液中的MLC。
我们无法定位总的内源性MLC，因为可用的抗体不能对包埋在厚胶原凝胶中的囊肿进行免疫细胞化学。因此，我们表达了一种GFP-MLC融合，其定位与内源性的类似mlc公司(病房等。, 2002). GFP-MLC主要定位于基底表面，尽管少量定位于顶端区域，与P-MLC类似（图，A′和A”，箭头）。我们能够使用Western blot测量MLC的总量，并且这与CM和/或Y27362没有变化（图H） ●●●●。
在延伸部分，大多数P-MLC和GFP-MLC位于细长的基底表面（图，B和C，实心箭头）。在链状细胞中，大多数P-MLC位于新的位置，主要是细胞质（图D、 打开箭头）。GFP-MLC主要仍与基底外侧膜相关。细胞质P-MLC位于细胞的“尾部”部分，即细胞核和囊肿壁之间的细胞质和细胞的“前导”部分。P-MLC的这种重新调整是扩展和链之间的另一个区别。当用CM和Y27632治疗囊肿时，P-MLC信号较弱（图F） 与Y27632导致P-MLC磷酸化抑制的想法一致。一些P-MLC位于加长延伸段中（图F、 星号），似乎比没有Y27632的形状要窄（例如图中的实心箭头B） ●●●●。由于CM+Y27632存在时形成的延伸部分明显狭窄，很难确定P-MLC是否为细胞质和/或与延伸部分质膜的内表面相关。一些P-MLC仍然与TJ相关（图F、 箭头）。与对照组的TJ相关P-MLC相比，这种TJ相关P-MLC的强度没有明显降低（图B） 表明TJ-相关的P-MLC可能对Y27632引起的磷酸化损失具有相对抗性。
综上所述，这些结果表明，ROCK通常会引起肌动蛋白肌球蛋白束的收缩，从而抑制延伸的产生和延伸。Y27632对岩石的堵塞缓解了延伸的抑制，导致延伸越来越长。MLC的磷酸化可能是ROCK活性的相关结果，尽管可能涉及ROCK的其他下游效应器。
细胞分裂的作用
一些无脊椎动物小管的发育，如气管果蝇属，发生在有丝分裂后(Metzger和Krasnow，1999年;Hogan和Kolodziej，2002年). 我们研究了在HGF/MDCK系统中，细胞分裂是否是小管生成所必需的。除了增强细胞活力和细胞散射外，HGF在各种细胞类型中都是一种有效的有丝分裂原，包括过滤生长的MDCK细胞(伯奇迈尔和格拉迪，1998年). 事实上，我们观察到，在CM治疗16小时的囊肿中，有丝分裂像增加了6倍（CM治疗细胞中每100个囊肿中有47个囊肿，而在未治疗的对照组中有7个囊肿）。如图所示nocodazole处理导致细胞分裂和链形成受阻，这表明细胞分裂在肾小管生成中起作用。为了进一步分析细胞增殖在HGF诱导的小管生成中的作用，我们通过在37°C下用细胞周期抑制剂丝裂霉素C预孵育囊肿过夜来抑制细胞增殖。然后，在丝裂霉素C存在下用CM处理囊肿额外16小时。正如诺可唑所观察到的那样，用丝裂霉素C处理的囊肿仍然形成扩展（图，比较A和B），但小管生成没有进行，因为在丝裂霉素C存在下用CM处理40小时的囊肿没有形成链（图，比较C和D）。此外，囊肿失去了大部分延伸。重要的是，囊肿的一般极化结构基本上没有改变。这表明丝裂霉素C治疗对细胞没有完全毒性，因为毒性会导致囊肿结构崩溃和细胞死亡，这也是未观察到的。另一种细胞周期抑制剂也获得了类似的结果，我-含羞草素（我们尚未公布的数据）。这些结果表明，细胞分裂不是形成延伸所必需的，而是形成链所必需的。
丝裂霉素C对延伸和链形成的影响。囊肿用荧光阴茎肽染色。（A） 用CM处理囊肿16小时。（B）用CM和0.5μg/ml丝裂霉素C处理囊肿16个小时。注意明显正常延伸。（C） 用CM处理囊肿40小时以产生链。（D） 用CM和0.5μg/ml丝裂霉素C处理囊肿40小时。注意没有链。
单元划分位置
小管生成期间细胞在哪里分裂？在一些哺乳动物系统中，如肺和内皮，细胞分裂主要发生在生长的小管和分支的尖端(Mollard和Dziadek，1998年;野川等。, 1998;Huang和Ingber，1999年). 我们分析了CM处理的细胞中有丝分裂图的位置。我们发现细胞分裂并没有发生在小管的特定部位。典型结果如图所示，显示同一分支小管的三个共聚焦切片（间隔4μm），其中包含几个有丝分裂细胞。在这些有丝分裂细胞中，一个位于小管顶端（细胞a），两个位于底部（细胞d和e，两者都处于有丝分裂后期），还有几个位于小管中部（细胞b、c和f）。这一结果表明，小管可以通过细胞增殖沿整个小管生长。
细胞分裂的位置。（A、B和C）用CM刺激囊肿72小时，然后用CM和200 ng/ml诺卡唑刺激24小时（以在有丝分裂中积累细胞），囊肿中复杂分支结构的三个连续共聚焦切片，相隔4μm。红色是α-微管蛋白的免疫荧光染色，绿色是荧光性卵磷脂，蓝色是细胞核。单个有丝分裂细胞用小写字母表示；其中一些细胞在多个切片中可见。
链形成过程中细胞分裂的方向
细胞分裂的方向在几个系统的形态发生中起着重要作用。这主要是在遗传易驯化的方面进行研究，如酵母，秀丽隐杆线虫、和果蝇属(2001年1月和1月;Knoblich，2001年;Wodarz，2002年). 定向分裂也在哺乳动物大脑的神经发生和伤口愈合过程中发挥作用(Chenn和McConnell，1995年;海恩斯等。, 2001;Estivill-Torrus公司等。, 2002;歌曲等。, 2002). 我们研究了细胞分裂的方向是否在小管生成过程中起作用。我们专注于链形成的初始步骤，其中细胞首先离开囊肿壁的单层。
以前曾报道过滤过器上生长的MDCK细胞在有丝分裂过程中纺锤体的取向和分裂轴(Reinsch和Karsenti，1994年). 总之，间期MDCK细胞的中心粒正好位于顶面中心的下方。这个中心粒重复，在早期的前期，其中一个中心粒移向细胞核的基底侧。在早期前期，早期纺锤体形成，其轴平行于细胞的顶基轴，即垂直于单层平面。在前中期，主轴开始旋转90哦，所以在中期，纺锤体现在平行于单层的平面。纺锤体保持在这个位置直到有丝分裂完成，这样两个子细胞都保持在单层的平面上。
我们首先分析了未经HGF处理的囊肿中分裂细胞的纺锤取向。（为了在活细胞中跟踪这一点，我们建立了稳定的表达GFP-α-微管蛋白的MDCK细胞系，并通过共焦显微镜收集了延时图像。）
在我们分析的所有细胞中,主轴旋转90度哦平行于心尖基底轴（图A、 0′）平行于单层平面（图A、 15′），很像过滤器上的细胞。纺锤体保持与单层平行，直到分裂完成。
有丝分裂纺锤体定向的时间图像。所有图像均为用延时共聚焦显微镜拍摄的表达GFP-α-微管蛋白的囊肿。（A） 未经治疗的囊肿。有丝分裂纺锤体在0分钟（虚线）时定位于顶基轴，旋转90哦到达单层平面15分钟，并在有丝分裂完成后保持这个方向。（B） 用CM处理的囊肿。有丝分裂纺锤体在0分钟时定向在顶端基底轴（虚线），并在9分钟时旋转到单层平面。在这种情况下，纺锤体轴在有丝分裂完成时保持在这个方向，细胞不会离开单层。（C） 用CM治疗囊肿。纺锤体表现出很少的旋转，并保持与顶基轴平行。（D） 用CM治疗囊肿。囊肿表现为纺锤体的跷跷板运动。心轴在0 min时位于心尖-基底轴上（实线）。它首先逆时针旋转到70哦7分钟（虚线）。然后心轴顺时针旋转，在17分钟时穿过心尖-基底轴，达到45哦在25分钟时以相反的方向旋转。最终，主轴旋转出焦点平面。
相比之下，HGF治疗的囊肿表现出广泛的旋转程度和类型。一些细胞表现得很像未经处理的囊肿，即它们经历了90哦以纺锤轴旋转，使两个子细胞保持在单层的平面上。（图B） ●●●●。
然而，在一些HGF处理的分裂细胞中，纺锤体没有经历90哦旋转和其中一个子细胞明显离开单层平面。例如，在图C、 纺锤体未能从其顶部-底部方向旋转，但确实经历了小的偏移。在其他情况下（图D） 纺锤体经历了较大的偏移，例如跷跷板运动，围绕心尖-基底轴来回摆动。如图中实线所示，在0分钟时，心轴平行于心尖-基底轴D.主轴首先沿逆时针方向远离心尖-基底轴旋转，最大偏移为～70哦7分钟。然而，主轴随后朝相反方向旋转，达到～45哦25分钟时以相反方向旋转。然后主轴明显部分旋转出截面平面。应该记住，主轴可能在三维空间中旋转，因此在我们的延时图像中，只有部分旋转可能是明显的，这些图像都在一个焦点平面上。在发育中的哺乳动物大脑中也可以看到发音的三维旋转(亚当斯，1996年).
综上所述，这些数据与假设一致，即在没有HGF的情况下，纺锤旋转机制通常可以确保两个子层都保持在单层中。相比之下，HGF治疗导致这种机制的明显可变损失。
我们还检测了Y27632对无HGF囊肿纺锤取向的影响。我们发现影响是可变的。在图中A、 在0分钟时观察到一个平行于单层的纺锤形细胞，并旋转25分钟使其垂直于单层。该细胞似乎在有丝分裂中延迟，但在86分钟内仍未完成。图B显示了一种非常不同的模式，纺锤形细胞呈近似垂直于单层细胞的形状（16和36分钟），最终分裂，细胞可能离开单层细胞（60分钟）。纺锤体取向的这些可变缺陷可能解释了我们所看到的Y27362单独对囊肿形态的影响，例如24小时出现的棘波。然而，这些棘波似乎主要不涉及分裂的细胞，而更可能是由于肌动蛋白细胞骨架的变化。这些纺锤体定向缺陷也可能至少部分解释了用Y27632和HGF联合处理所看到的一些影响，例如在长时间点所看到的分离细胞，甚至可能是延伸数量增加（尽管这些更可能是在没有有丝分裂的情况下产生的）。
抑制ROCK对囊肿纺锤体取向的影响。通过延时共聚焦显微镜拍摄到表达GFP-α-微管蛋白的活囊肿图像。（A） 在用30μM Y27632治疗24小时的囊肿中，纺锤轴旋转90°，从垂直于顶基轴（0′）到平行于顶基轴线（25′）。86′后细胞分裂未完成。（B） 该纺锤体在顶基轴上几乎不旋转，最后在顶基轴线上分裂。
讨论
我们的基本结果是，胶原蛋白中的MDCK细胞表现出两种极化和运动，当细胞从延伸过渡到链时，HGF诱导细胞从一种类型切换到另一种类型。具有延伸的细胞类似于单层中明显不移动的极化上皮细胞，因为它们仍然具有顶基外侧极性。然而，这些细胞有一种运动类型，即它们伸出假足延伸。相反，链中的MDCK细胞几乎失去了上皮极性的所有残余，而与其他典型的迁移细胞类似，例如迁移的成纤维细胞。
PI3K对于扩展的启动和维护都是必需的。在成纤维细胞、中性粒细胞和粘液菌PI3K的脂质产物在HGF诱导的伸展中积聚。此外，LY294002对PI3K活性的抑制阻止了延伸形成。推测PI3K与中性粒细胞和粘液菌，为迁移方向提供细胞内信号。然而，并非所有的细胞迁移都依赖于PI3K，例如，星形胶质细胞在创伤愈合期间沿迁移方向形成的长假足延长类似于MDCK延长（都是长的、大的、相对缓慢的移动），但不受PI3K抑制剂的影响(艾蒂安·曼尼维尔和霍尔，2001年).
快速改变方向的细胞，例如中性粒细胞，不依赖高尔基体或MT相对缓慢的极化(Schliwa和Hóner，1993年)而是取决于肌动蛋白细胞骨架的重排。相反，形成伪足的细胞缓慢而运动缓慢，例如星形胶质细胞，更多地依赖于线粒体进行运动，而星形胶质细胞极化和伪足的形成并不依赖肌动蛋白聚合(艾蒂安·曼尼维尔和霍尔，2001年). MDCK延伸形成与星形胶质细胞中假荚膜形成类似，比中性粒细胞迁移慢得多（时间尺度为小时而非分钟）。因此，令人惊讶的是，伸展形成并不依赖MT动力学或高尔基体再定向，而是依赖肌动蛋白聚合。
从这个角度来看，延伸在某种程度上类似于中性粒细胞，因为它们需要PI3K和肌动蛋白，但不涉及高尔基体重新定向或MT。相反，链的形成涉及高尔基体重新定向，因此类似于成纤维细胞和星形胶质细胞。很难评估PI3K和聚合肌动蛋白在链中的作用，因为它们的抑制剂会导致作为链的前体的延伸崩溃。还很难评估MT动力学在链中的作用，因为诺康唑抑制有丝分裂，而有丝分裂是链形成所必需的。
延伸和链形成之间的差异在体内具有相似性。唾液腺和气管的发育果蝇属细胞首先发出假足延伸，然后整个上皮细胞移动。基因突变丝带基因并不能阻止这些发育中的腺体细胞的延伸形成，但可以阻止细胞体的运动，这可能类似于MDCK系统中的链形成(Bradley和Andrew，2001年;垫片等。, 2001).
ROCK控制扩展的数量和长度
目前尚不清楚是什么控制着延伸管或小管的数量或长度。尽管囊肿均匀地暴露于HGF，并且所有细胞理论上都有反应，但囊肿中只有少数细胞产生延伸，然后产生小管。Y27632极大地增加了HGF诱导的延伸的数量和长度，并且自身产生了非常小的延伸。这些效应与之前的数据一致，即Rho激活抑制HGF诱导的MDCK细胞散射(雷德利等。1995年). 抑制ROCK也会在神经母细胞瘤细胞和成纤维细胞中产生突起和伪足(Hirose公司等。, 1998)并在伤口愈合试验中增加成纤维细胞的移动速度(Nobes and Hall，1999年). 我们的数据表明，正常情况下，ROCK（以及它控制的收缩性和应力纤维）抑制许多系统中的运动和伪足形成，包括MDCK细胞延伸。
ROCK活性导致产生P-MLC，进而促进肌动蛋白-肌球蛋白的收缩性。我们发现，在囊肿壁单层的细胞中，大部分P-MLC位于基底表面之下，一些位于紧密连接区域。在伸展形成过程中，P-MLC保持在拉长的基底表面下方。然而，P-MLC在链中的定位完全不同，其中大部分P-MLC弥漫在细胞质中，尤其是细胞质的尾部。这种拖尾位置与迁移中性粒细胞中的位置类似，其中P-MLC主要位于迁移中性粒细胞核的尾部或尾足（J.Xu，F.W.和H.B.，未发表）。事实上，ROCK是分离迁移白细胞中的尿足类所必需的(阿尔布拉斯等。, 2001;沃伊塔克等。, 2001).
通常，在HGF作用下，细胞向心远离囊肿，而Y27632作用下，一些细胞向中心移动。这可能是由于破坏了通常导致细胞只向一个方向移动的机制，即向HGF来源移动。有趣的是，Y27632对中性粒细胞的治疗也有类似的效果，它在随机方向上产生多个伪足（Wang和Bourne，未发表的数据）。我们不能排除其他可能性，例如，Y27632使紧密连接处漏水，使细胞向HGF趋化，而HGF已渗入管腔(沃尔什等。, 2001).
细胞分裂在肾小管生成中的作用
脊椎动物的大多数肾小管生成涉及细胞增殖(Hogan和Kolodziej，2002年). 与此一致，我们发现抑制MDCK细胞分裂阻止了链的形成，尽管延伸没有受到影响。
定向细胞分裂在发育的许多步骤中起着至关重要的作用。未刺激囊肿壁中的细胞的行为与生长在过滤器支架上的细胞相似。心轴形成平行于心尖-基底轴，然后持续旋转90度哦与单层平面平行。与之形成鲜明对比的是，HGF治疗的旋转变化很大。有些主轴几乎没有旋转，有些主轴正常旋转，有些主轴有较大的跷跷板偏移。在定向细胞分裂中观察到类似的跷跷板运动黑腹果蝇(卢等。, 2001;罗杰斯等。, 2001). 我们的结果表明，HGF处理后，正常旋转纺锤并产生共面分裂的机制会发生变化。这导致一些子细胞离开单层，可能引发或促成链。
至少从表面上看，MDCK细胞分裂的重新定向与果蝇属神经发生。成神经细胞起源于上皮，一些细胞在单层的平面上分裂，因此留在单层中。最近的证据表明，主轴的方向由分级机构控制(卢等。, 2001;罗杰斯等。, 2001). 中的默认情况果蝇属该系统使纺锤体在顶端-基底方向上定向。涉及粘附连接的叠加信号可以使纺锤体平行于单层平面。从这个角度来看，我们的数据表明一个模型，其中MDCK在单层中正常分裂，纺锤体旋转90哦因为它被捕获到与单层平行的位置。这种捕获机制可能涉及星形微管与粘附连接相关蛋白的相互作用。我们认为，在HGF诱导的小管生成过程中，这种正常的捕获机制可能会在一些（但不是所有）细胞中消失。结果可能是主轴未固定在任何特定方向，在某些情况下可能会发生跷跷板运动。
MDCK微管生成可能提供了一个可用于解剖哺乳动物细胞分裂定向机制的系统。被认为在哺乳动物细胞纺锤体定向和细胞分裂中发挥作用的蛋白质，因此可能是HGF诱导的分裂重新定向的靶点，包括LIS1(福克纳等。, 2000)、PINS（inscutable的合作伙伴）、NuMA(杜等。, 2001),动力蛋白、EB1和APC（大肠腺瘤性息肉病）(杜贾丁和瓦利，2002年;冈德森，2002). 我们还发现，抑制ROCK会导致纺锤定向和旋转方面的各种缺陷，这表明ROCK可能参与了这一过程。我们的结果增加了细胞分裂方向可能在小管生成中起作用的可能性，因此在成人发育和小管生成过程中可能都很重要，这发生在正常生理（例如乳腺和子宫内膜腺体的循环）、再生（例如肾小管坏死后）、，小管的病理增生（如高分泌性肺病）。
