最近的研究发现了一种人类Na+-极性中性氨基酸依赖性转运体（hASCT2；基因名，SLC1A5）是一大类广泛分布的逆转录病毒干扰群的共同受体，这些逆转录病毒包括猫内源性病毒（RD114）、狒狒内源病毒（BaEV）、人内源性病毒W型（HERV-W）和D型灵长类或猴逆转录病毒（SRV）导致感染性免疫缺陷(6,23,28,33). 其他证据表明，水平传播的脾坏死病毒和网状内皮组织增生症病毒是由一种罕见的人畜共患病引起的，该病毒是由与BaEV密切相关的逆转录病毒引起的，随后是对鸡和鹅类鸟类的适应性辐射(4,16,18,19). 这些禽逆转录病毒也可能与上述病毒发生在同一干扰群中(19). 尽管HERV-W在人类基因组中不是一种完整的前病毒，但至少有一种全长HERV-W包膜糖蛋白基因在胎盘和几种炎症性疾病中自然表达(5,6,9,14,17,27). HERV-W包膜糖蛋白具有高度融合原性，可以假型人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）病毒，这意味着它可能有助于HIV-1传播到CD4阴性特权组织，如胎盘或大脑(1,23).
ASCT2是谷氨酸转运体超家族的成员，它还包含一个密切相关（约54%的同源性）的转运体ASCT1（基因名，SLC1A4）。ASCT1和ASCT2运输一组重叠但不相同的中性氨基酸，一个重要的区别是仅通过ASCT2转运谷氨酰胺(三,8,15,35). 这个超家族中的转运蛋白都含有一个相关的氯离子−由可运输氨基酸打开的通道(13,30). 然而，Cl的通量−与氨基酸通量分离(8,30,38). 谷氨酸转运体的拓扑结构也已被研究(7,29). Brocke等人的模型(7)与我们对ASCT蛋白的证据一致，并用于本研究。我们的证据来源于发现羧基末端位于细胞质中，并且被鉴定为细胞外环2（ECL2）的区域包含N-连接的低聚糖，这与细胞外定向一致(25).
尽管该干扰家族中的所有哺乳动物逆转录病毒都感染人类细胞并使用hASCT2作为共同受体，但这些病毒具有不同的宿主范围。例如，只有BaEV和HERV-W假型病毒能够感染小鼠细胞，而中国仓鼠卵巢（CHO）细胞对所有这些病毒都具有完全抵抗力。相反，小鼠细胞在暴露于衣霉素（一种蛋白质N-连接糖基化抑制剂）后对所有病毒高度敏感(20,25). 基于这些结果，最初令人惊讶的是，发现小鼠ASCT2直系物（mASCT2）作为所有这些逆转录病毒的受体是不活跃的，并且通过诱变去除其N-连接的低聚糖不能使其介导RD114或灵长类D型逆转录病毒感染(25). 然而，对这些病毒宿主范围特性的部分解释来自以下发现：小鼠蛋白mASCT1是BaEV和HERV-W假型病毒的特异性受体，并且通过诱变使mASCT1-脱糖基化激活其作为该家族其他哺乳动物逆转录病毒的受体(23,25). 因此，这些病毒感染小鼠细胞的能力似乎由mASCT1而不是mASCT2决定。
病毒与ASCT1和ASCT2受体相互作用的活性位点此前尚未进行详细研究。事实上，关于这一问题的唯一证据来自mASCT1的N-脱糖基化将其转化为D型灵长类逆转录病毒和RD114的活性受体的观察结果(25). 由于mASCT1中仅有两个N-连接的低聚糖出现在ECL2的羧基末端区域，因此推测该区域可能对RD114和D型灵长类逆转录病毒的接收很重要，但对BaEV和HERV-W可能不重要(23,25). 这两种N-连接的低聚糖协同抑制RD114和D型灵长类逆转录病毒对mASCT1的利用，消除任一糖基化位点都足以减轻抑制(25).
我们现在报告了与该问题相关的其他研究，包括嵌合体分析和活性hASCT2受体和非活性mASCT2直系同源序列的定点替代突变。我们的结果表明，ECL2羧基末端区域21个氨基酸的高变序列对该干扰家族中所有病毒的接收有重要影响。尽管人类和小鼠ASCT2的这些ECL2区域中存在N-连接低聚糖，但它们对病毒接收的影响似乎不如氨基酸序列差异重要。除了对ASCT2的这些研究外，我们还分析了CHO细胞对所有这些病毒依赖膜霉素敏感性的基础。与mASCT1相比，仓鼠ASCT1只含有两种N-连接的低聚糖，在同一关键ECL2区域，仓鼠的ASCT1还含有一种额外的邻近N-连接的寡糖。通过诱变去除这种N-连接的低聚糖将仓鼠ASCT1转化为该家族中所有病毒的活性受体。因此，剩下的两种N-连接低聚糖在mASCT1环境中阻断RD114和D型灵长类逆转录病毒的感染，但在仓鼠ASCT1的环境中没有。综合考虑，我们的结果强烈表明，ASCT1和ASCT2中ECL2的羧基末端区域在控制逆转录病毒的接收中起着关键作用。这种控制是由氨基酸序列变化和N-连接低聚糖的组合决定的，个别变化的后果取决于它们发生的整体序列背景。这些结果对理解病毒-受体相互作用和预防人畜共患疾病的宿主因素具有重要意义。
材料和方法
细胞系、质粒和病毒。
人类胚胎肾HEK293T细胞（ATCC CRL-1573）在添加10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle's高糖培养基中生长。TE671人横纹肌肉瘤细胞（ATCC CRL8805）在补充有10%FBS的Dulbecco改良Eagle培养基中生长。CHO细胞（ATCC CCL-61）和衍生的克隆在补充有10%FBS的α改良最低必需培养基中生长。稳定表达仓鼠ASCT1、仓鼠ASCT1 N194T、N194T-N201T、N194T-N206T，和N201T-N206T通过使用myc公司-标记的受体-表达pcDNA3.1载体。用G418筛选转染细胞，并分离出单个抗基因素菌落。通过Western免疫印迹法，使用一种针对myc公司标签。我们采用了人类、小鼠和仓鼠的通用名称ASCT1和ASCT2作为受体蛋白。其基因的标准命名分别为SLC1A4和SLC1A5（OMIM数据库，美国国立卫生研究院国家生物技术信息中心；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez).
其他地方描述了编码HERV-W、HERV-Wcyt16、BaEV-Rless和RD-Rless包膜的phCMV表达载体(23). pCMVdR8.74载体编码除包膜外的HIV-1结构蛋白和pRRLsin18.cPPT。CMV.eGFP公司。WPRE编码一种增强型绿色荧光蛋白（GFP）编码报告基因，由意大利都灵都灵大学医学院的Luigi Naldini善意提供(36).
LacZ（RD114）由TELCeB6/RDF-7无辅助包装细胞生产(10). LacZ（BaEV）通过感染水貂Mv-1-Lu细胞而被挽救，该细胞含有lacZ公司向量(34)具有复制能力的BaEV库存。感染复制能力强的SRV-2株的TELCeB6细胞用于产生LacZ（SRV-2）(33).
艾滋病毒/艾滋病-用表达HERV-W包膜的phCMV-HERV-W载体pCMVdR8.74和pRRLsin18.cPPT共转染人HEK293T细胞，制备W假型病毒。CMV.eGFP公司。WPRE，使用PolyFect试剂（加利福尼亚州巴伦西亚市齐根）(23).
仓鼠ASCT1（CHO.ASCT1）cDNA克隆。
用总RNA逆转录PCR扩增仓鼠ASCT1（CHO.ASCT1）受体cDNA。用RNeasy-Midi试剂盒（Qiagen）从CHO细胞中制备总RNA。1.599 kb CHO。使用与mASCT1编码区5′端和3′端互补的引物（上游引物5′-AA）扩增ASCT1 cDNAAAGCTT公司ATGGAGAGCGGCGAGACC-3′，包含Hin公司dIII限制位点[带下划线的序列]；下游底漆，5′-AACTCGAG公司TCACAGCACTGACTCC-TTGGA-3′，包含Xho公司I限制站点[带下划线的序列]）。PCR产物随后被克隆到pCDNA3.1V5His-TOPO哺乳动物表达载体（Invitrogen，Carlsbad，Calif.）中，并由微生物学和分子免疫学核心设施在PE/ABD 377测序器上使用染料终止循环测序化学进行测序（Applied Biosystems，Foster City，Calif..）。
嵌合受体的构建和定点突变。
采用重叠PCR技术构建人-鼠ASCT2嵌合体。相应的cDNA通过使用与假定的细胞内环2（h/m-和m/hASCT2）、假定的跨膜3和4（hECL2/mASCT2和mECL2/hASCT2。随后将PCR产物克隆到pCDNA3.1V5His-TOPO哺乳动物表达载体（Invitrogen）中，并按上述方法进行测序。使用两个互补的突变引物（包含目标点突变和QuikChange定点突变试剂盒）通过PCR诱变对仓鼠ASCT1受体残基进行突变（加州拉霍亚市斯特拉赫内）。对三个独立克隆的质粒DNA进行测序以确认突变。DNA序列的测定如上所述。突变体由亲本受体名称、突变氨基酸、残基数和新氨基酸指定。
感染和细胞融合分析。
表达hASCT2、mASCT2的CHO细胞、人鼠ASCT2嵌合体、仓鼠ASCT1（CHO.ASCT1）或CHO。通过使用SuperFect转染试剂（Qiagen）瞬时转染相应的cDNA，生成ASCT1 N-脱糖基突变体。瞬时转染者被LacZ（RD114）、LacZ或LacZ伪型病毒攻击，转染后24小时开始与病毒隔夜培养。通过用0.25%戊二醛处理细胞对受感染的细胞进行染色，并用5-溴-4-氯-3-吲哚基-β测定β-半乳糖苷酶活性-d日-吡喃半乳糖苷作为底物(24). 计数蓝色CFU，感染滴度表示为每毫升病毒上清液中的CFU数。为了进行HIV/HERV-W假型病毒感染检测，将稳定表达hASCT2、hASCT1、仓鼠ASCT1，仓鼠ASCT N194T、N194T-N201T、N1949 T-N206T和N201T-N206T的CHO细胞克隆以0.5×10的密度接种在48个平板中4每个孔的细胞数，并在37°C下培养过夜。向细胞中加入250微升稀释的病毒样品，每毫升含有8微克聚溴乙烯，并在1200×克在25°C下持续2小时。去除上清液后，将细胞在37°C的常规培养基中培养48至72小时。对于细胞-细胞融合分析，将细胞接种在12孔板中，密度为105每个孔的细胞数。20小时后，使用PolyFect试剂（Qiagen）将phCMV-RD114-Rless、phCMV-BaEV-Rless或phCMV-HERV-W转染细胞。转染后24至36小时，根据制造商的建议，用May-Grunwald和Giemsa溶液（Merck）固定细胞并进行染色。
我-[三H] 丙氨酸转运。
这个我-[三H] 对瞬时表达ASCT受体的HEK293T细胞进行丙氨酸转运试验。初始利率我-[三H] 如前所述，在转染开始后48小时分析丙氨酸摄取(37).
免疫印迹分析。
用于研究CHO的细胞表面表达。ASCT1及其N-去糖基化突变体，用相应的myc公司-使用SuperFect转染试剂（Qiagen）标记表达载体。转染后48小时，通过向HEK293T细胞表面添加2 mM磺化NHS-LC-生物素（Pierce，Rockford，Ill.）到2×107电池在4°C下放置1小时。用20 mM甘氨酸将反应淬灭15 min。将洗净的细胞从培养皿中刮下，置于低温磷酸盐缓冲盐水中，并在200×克然后将细胞颗粒重新悬浮在裂解缓冲液中（50 mM Tris-HCl[pH8.8]、150 mM NaCl、0.1%十二烷基硫酸钠、1%NP-40、0.5%脱氧胆酸钠和蛋白酶抑制剂混合物[Complete；Boehringer Mannheim]）并在冰上培养30分钟。通过15000×离心去除细胞碎片和细胞核克在4°C下持续10分钟。生物素化分子在4°C下吸附在链霉亲和素琼脂糖珠（GIBCO BRL）上。用裂解缓冲液洗涤珠子三次，并将其重新悬浮在20μl裂解缓冲液中。用N-糖苷酶F（2 h；37°C）处理10微升小球。用等体积的2×Laemmli样品缓冲液煮沸处理过和未处理过的珠子(21)然后在0.1%十二烷基硫酸钠存在下，在12%聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分析。然后将蛋白质转移到硝化纤维膜上，然后用5%的奶粉在磷酸盐缓冲盐水中处理硝化纤维膜。使用抗Myc标签单克隆抗体9E10（Sigma）检测硝化纤维印迹，并使用辣根过氧化物酶结合山羊抗鼠抗体（Southern Biotechnology Associates，Inc.）和增强化学发光试剂盒（NEN Life Research Products，Boston，Mass.）进行开发。
核苷酸序列登录号。
中国仓鼠ASCT1 cDNA的GenBank登录号为AF537346型.
结果
ECL2羧基末端区21个氨基酸的不同序列控制人和小鼠ASCT2的病毒受体活性。
图根据对密切相关的谷氨酸转运体的研究，显示了ASCT蛋白的假定拓扑结构(7)以及ASCT1和ASCT2中ECL2的N-连接糖基化的相容证据(25; 另请参见下文）。该模型包括ECL 3-4和ECL 4-5之间的两个重入环，它们显然在膜中移动并参与氨基酸转运(7). 尽管人类和小鼠ASCT2直系同源性为81%，但ECL2的两个区域出现了显著的差异聚集，这两个区域之间的序列不仅在ASCT1和-2中高度保守，而且在谷氨酸转运体超家族的其他成员中也高度保守（图。) (30).
hASCT2/mASCT2嵌合体的构建。（A） hASCT2和mASCT2推测ECL区域的氨基酸序列比较。序列左侧的数字对应于所示的第一个和最后一个氨基酸的位置。点表示氨基酸身份。序列中的删除用破折号表示。N-糖基化位点用星号表示。序列右侧的数字表示氨基酸身份的百分比。（B） 野生型和嵌合型ASCT2蛋白的拓扑结构和命名。顶部的图示显示了hASCT2和mASCT2细胞表面受体的假定拓扑结构；假定ECL编号为1至5。
我们通过构建和分析图中所示的相互嵌合体来分析人类和小鼠ASCT2的病毒受体特性。最初的研究表明，h/mASCT2作为LacZ（RD114）和LacZ（BaEV）假型病毒的受体是活跃的，而相互作用的m/hASCT2嵌合体是不活跃的（图。)随后，我们通过研究图中所示的其他嵌合体来扩展这一分析。结果表明，所有包含来自hASCT2中ECL2羧基末端区域的21个氨基酸片段的嵌合体都是活性受体，而所有缺少该序列的嵌合体则是非活性的。该序列如图所示。作为高度发散区域C。
hASCT2、mASCT2和嵌合受体介导感染。用瞬时转染受体表达载体的CHO细胞进行感染性分析。开始转染24小时后，开始感染LacZ（RD114）和LacZ伪型病毒。滴度是三个独立实验的平均值±标准误差。一些受体的RD114滴度为零，在这些情况下，没有显示条形。
瞬时转染这些野生型和嵌合ASCT2蛋白表达载体的HEK293T细胞均增加了对我-[三H] 丙氨酸，表明它们是在细胞表面表达的活性转运蛋白（表，分析A）。除m/hASCT2嵌合体外，所有病例的结果在95%置信水平上均具有显著性，其结果不太显著（见表脚注). 然而，我们的结论是hASCT2区域C对病毒受体功能是必要的，这并不取决于m/hASCT2-嵌合体获得的数据（图。和).
表1。
我-[三H] 表达野生型、突变型和嵌合ASCT2和ASCT1蛋白的HEK293T细胞对丙氨酸的摄取
| 检测外源受体一 | 我-[三H] 丙氨酸摄取（nmol/min/mg蛋白质） |
|---|
| 分析Ab条 | |
| pcDNA3.1 | 29.7 ± 1.5 |
| hASCT2型 | 45.6 ± 2.4 |
| mASCT2型 | 61.2 ± 1.6 |
| 小时/分钟ASCT2 | 43.7 ± 1.9 |
| 米/小时ASCT2 | 33.6 ± 1.9 |
| hECL2/mASCT2型 | 41.9 ± 2.0 |
| mECL2/hASCT2 | 39.5 ± 2.2 |
| mhECL2/hASCT2 | 35.3 ± 2.5 |
| hmECL2/hASCT2型 | 42.3 ± 1.5 |
| 分析Bc（c） | |
| pcDNA3.1 | 8.4 ± 1.6 |
| CHO公司。ASCT1型 | 19.0 ± 4.7 |
| CHO公司。ASCT1.N194T号 | 15.7 ± 3.0 |
| CHO公司。ASCT1.N201T号 | 19.4 ± 3.8 |
| CHO公司。ASCT1.N206T号 | 16.2 ± 3.0 |
| CHO公司。ASCT1.N194T-N201T | 14.0 ± 3.0 |
| CHO公司。ASCT1.N194T-N206T | 17.2 ± 4.3 |
| 乔。ASCT1.N201T-N206T | 17.7 ± 4.1 |
| CHO公司。ASCT1.N194T-N201T-N206T | 14.4 ± 2.7 |
如图所示。hASCT2和mASCT2的C区几乎完全不同，这使得它们的排列不确定，并使我们通过替代突变来比较它们的工作变得复杂。然而，我们在图中确定的mASCT2中进行了小的缺失。作为X和Y，我们发现突变体作为病毒受体不活跃（结果未显示）。此外，我们之前报道过，从mASCT2的ECL2中去除N-连接的低聚糖并没有激活BaEV、RD114或D型灵长类逆转录病毒的受体活性，尽管N-脱糖基的mASCT2是HERV-W假型病毒的部分受体(23,25).
隧道粘菌素依赖性地鼠细胞对这些逆转录病毒感染的敏感性。
上述病毒受体活性测定（图。)由于CHO细胞对该干扰组中的所有病毒都具有高度抵抗力，因此我们使用CHO细胞进行了研究。但是，如表所示经衣霉素治疗后，CHO细胞也容易感染。由于小鼠细胞对RD114和D型灵长类逆转录病毒的膜霉素依赖性敏感性先前显示依赖ASCT1而非ASCT2，因此我们从CHO细胞中分离RNA，并使用逆转录PCR分离中国仓鼠ASCT1 cDNA。仓鼠ASCT1 cDNA序列分析（登录号非洲537346)这意味着编码的蛋白质与mASCT1的同源性为93%。图比较mASCT1和仓鼠ASCT1蛋白的ECL2序列。有趣的是，仓鼠序列包含三个紧密聚集的N-连接糖基化共识位点，其中两个（N201和N206）与mASCT1中的相同，另一个位于N194。
mASCT1和仓鼠ASCT1（CHO.ASCT1）假定ECL2的氨基酸序列比较表明87%的序列一致性。序列左侧的数字对应于所示的第一个和最后一个氨基酸的位置。点表示氨基酸身份。N-连接的糖基化位点用星号表示。
表2。
金黄地鼠细胞经膜霉素治疗后可感染RD114和猿猴D型逆转录病毒
| 细胞 | LacZ假型滴定度（CFU/ml）一
|
|---|
RD114型
| SRV-2型
| BaEV公司
|
|---|
| （−）束腰裤 | （+）束腰 | （−）音调 | （+）束腰 | （−）束腰裤 | （+）束腰 |
|---|
| 首席人事官 | 0 | 1.0 × 105 | 0 | 2.2 × 104 | 4.1 | 5.2 × 104 |
为了确定仓鼠ASCT1在N194位的N-连接糖基化是否参与CHO细胞对RD114、BaEV和SRV-2型D逆转录病毒感染的衣霉素依赖性敏感性，我们在该蛋白的羧基末端添加了Myc表位标签，并构建了单个突变体N194T、N201T和N206T，双突变体N194T-N201T、N194T-N206T和N201T-N206T，以及三突变体N1949 T-N201T-N206Tmyc公司-标记仓鼠ASCT1 cDNA克隆。我们在CHO细胞中瞬时表达这些标记的仓鼠ASCT1蛋白和一个对照标记的mASCT1蛋白质，然后我们分析细胞对RD114、BaEV和SRV-2病毒感染的敏感性。如图所示。，所有包含N194T介导的病毒感染的仓鼠ASCT1突变体，而其他突变体均未激活。因此，N194残基对感染具有显著的抑制作用。然而，如下文进一步证实的，含有N194T替代物的双突变体和三突变体在病毒接收中的活性是单个N194T突变体的数倍。与图中的结果一致。，我们之前展示了野生型mASCT1，其中包含N201和N206（图。)，在介导BaEV和HERV-W感染中活性高，但在介导RD114和D型猿逆转录病毒感染中活性低50至100倍(23,25). 此外，通过诱变去除mASCT1的N201和/或N206处的N-连接低聚糖消除了对RD114和D型灵长类病毒感染的抑制(25). 因此，我们惊讶地发现，单一突变仓鼠ASCT1（N194T）是所有这些病毒的强受体（图。). 为了确定mASCT1第194位的D是否可以选择性抑制RD114和SRV-2的感染，我们构建了仓鼠ASCT1的N194D突变体。如图所示。，仓鼠ASCT1（N194D）突变体在介导这些病毒感染方面与N194T突变体相似。这一结果表明，mASCT1和仓鼠ASCT1（N194D）之间的病毒接受差异一定是由这些蛋白质之间的其他氨基酸序列差异引起的。此外，N201和N206的病毒抑制作用明显取决于它们发生的氨基酸序列背景。
野生型和突变仓鼠ASCT1蛋白的表面表达和病毒受体特性。（A） 瞬时表达CHO的CHO细胞中LacZ假型病毒的感染程度。ASCT1及其N-糖基化突变体。转染开始24小时后，开始感染LacZ假型病毒。感染滴度是三个独立实验的平均值±标准误差。对于几个受体，RD114或SRV-2病毒的滴度为零，在这种情况下，没有显示条形。（B） 野生型和突变型仓鼠ASCT1蛋白在HEK293T细胞表面的表达和N-连接寡糖的分析。瞬时表达Myc-tagged CHO的HEK293T细胞。ASCT1及其N-脱糖基化突变体按照材料和方法中的描述进行表面生物素化。通过亲和层析纯化生物素化蛋白。用抗Myc标记单克隆抗体9E10（Sigma）进行Western免疫印迹分析未经PNGaseF处理（−）或处理（+）的样本。
由于仓鼠和小鼠ASCT1蛋白含有Myc表位标签，我们能够通过使用不渗透膜的生物素试剂来分析它们的细胞表面表达(22,23,32). 使用链霉亲和素-琼脂糖珠对生物素化蛋白进行亲和纯化后，在电泳和使用抗Myc单克隆抗体9E10进行Western免疫印迹之前，用蛋白N-聚糖酶F（PNGaseF）处理或未处理小份样品（图。). 结果表明，ASCT1蛋白在细胞表面的表达均相似。用PNGaseF处理野生型小鼠或仓鼠ASCT1可增加其电泳迁移率，与预期一致M（M）第页未糖基化蛋白55000。此外，单仓鼠ASCT1突变体N194T、N201T和N206T以及双突变体N1949 T-N201T、N194T-N206T和N201T-N206T的电泳迁移率均略高于未消化野生型仓鼠ASCT蛋白，且其迁移率进一步增加至表观迁移率M（M）第页经PNGaseF消化的55000份。相反，三只仓鼠ASCT1突变体N194T-N201T-N206T与完全脱糖野生型蛋白大小相同，不受PNGaseF的影响。这些结果表明，仓鼠ASCT1在N194、N201和N206这三个位置都是N-糖基化的。然而，对双突变体的仔细检查结果如图所示。表明与N201和N206相比，N194位的N-连接低聚糖可能具有相对较小的尺寸。
仓鼠ASCT1的N-连接糖基化也阻断HERV-W包膜。
在先前的研究基本完成后，我们确认HERV-W包膜糖蛋白可以假型HIV-1病毒核心，并且我们还发现这些病毒可以以类似于BaEV的方式使用完全糖基化的mASCT1(23). 为了验证和扩展上述结果，我们制作了CHO细胞衍生物，组成性表达编码仓鼠ASCT1或其单个N194T或双N194T-N201T、N194T-N206T或N201T-N206T N-脱糖基突变体的载体。然后使用HERV-W或HERV-Wcyt16包膜假型HIV-GFP病毒感染这些细胞，如材料和方法所述。HERV-Wcyt16包膜有一个缩短的胞质尾部，只含有16个氨基酸，它比全长HERV-W包膜更有效地形成假型病毒粒子(23). 作为这些检测的对照，我们还使用MuLV-LacZ（RD114）和LacZ（BaEV）假型病毒、组成性表达hASCT2、hASCT1和人类TE671细胞的CHO细胞。如图中的传染性数据所示。表达带有N194T突变的仓鼠ASCT1的CHO细胞对HERV-W包膜糖蛋白假型病毒高度敏感，而对照CHO细胞和表达野生型CHO仓鼠ASCTI或N201T-N206T双突变的细胞具有耐药性。因此，仓鼠ASCT1在N194处的糖基化对所有这些病毒的感染具有主要的抑制作用，而这些抑制作用不能通过消除N201和N206处的寡糖来减轻。然而，后一种N-连接低聚糖显然有助于抑制，因为N194T-N201T和N194T-N206T双突变体在介导所有这些病毒感染方面的活性是N194T单突变体的4到20倍（图。和). 此外，这些结果表明，人类ASCT1在选择性介导BaEV和HERV-W感染方面的功能类似于mASCT1，但在RD114感染方面没有。研究我-[三H] 丙氨酸摄取表明野生型和突变型ASCT1蛋白都在细胞表面表达（表)从而证实了图中所示的生物素化结果。.
仓鼠ASCT1（CHO.ASCT1）的N-连接糖基化阻断了HERV-W包膜糖蛋白介导的感染性和膜融合。（A） CHO介导HIV/HERV-W假型病毒感染。ASCT1及其N-脱糖基突变体。用组成性表达蛋白质的CHO细胞克隆进行感染性分析。滴度是三个独立感染实验的平均值±标准误差。（B） 显示细胞-细胞融合分析中每个病毒-受体组合的平均融合指数的直方图（误差条为标准偏差；n个= 3). 融合指数表示细胞群中融合事件的百分比，定义为[（N−S）/T]×100，其中N是合胞体中的细胞核数，S是合胞体内的细胞核数；T是计数的细胞核总数(2).
HERV-W包膜糖蛋白具有高度融合原性，可能有助于胎盘中合胞体耐受细胞的形成(6,26). 因此，我们将HERV-W Env表达载体瞬时转染到上述稳定表达仓鼠CHO的CHO细胞克隆中。ASCT1或其N-去糖基化突变衍生物，然后我们分析培养物中的合胞体。正如上述分析所预期的那样，表达野生型仓鼠ASCT1的正常CHO细胞及其衍生物在表达HERV-W Env后不会形成合胞体（图。)而表达仓鼠ASCT1（N194T）的细胞形成丰富的合胞体。有趣的是，表达双突变体N194T-N201T或N194T-N206T的CHO衍生物比N194T单突变体形成更多的合胞体。此外，这些CHO细胞衍生物表达了类似数量的野生型和突变ASCT1蛋白，如用Myc抗体免疫染色和如上所述的细胞表面生物素化所示。这些结果强烈支持我们的结论，即仓鼠ASCT1在N194的N-连接糖基化对HERV-W介导的感染和膜融合过程具有强烈的抑制作用，并且N201和N206的寡糖也有助于这些抑制。
讨论
一般结论。
这些结果提供了强有力的证据，证明ECL2羧基末端部分中称为区域C的序列（图。和)在控制不同哺乳动物物种的ASCT1和ASCT2蛋白的逆转录病毒受体功能方面发挥着重要作用，并且通过氨基酸序列变化和不同位置的抑制性N-连接寡糖的组合，以协同方式确定该干扰家族中所有病毒的这种控制。C区序列的高变性与假设一致，即它们是宿主病毒协同进化的关键战场(23,31). 在mASCT2的情况下，耐药性主要取决于C区的不同氨基酸序列，而与易感人同源基因hASCT2相比。然而，由于mASCT2的N-脱糖基突变体衍生物在通过HERV-W包膜介导感染性和膜融合方面具有活性，因此，N-连接的低聚糖似乎也有助于这种耐药性(23). 同样，如下文所述，我们的结果强烈暗示，ASCT1区域C中的氨基酸序列变化和N-连接低聚糖的组合控制了其介导该干扰家族中不同逆转录病毒感染的能力。然而，在ASCT1的情况下，N-连接的低聚糖似乎具有主要影响。
C区可能是阴性对照屏障，而不是病毒附着位点。
虽然我们的结果强烈表明ASCT1和ASCT2的C区对其逆转录病毒受体功能至关重要，但我们强调，我们的数据不能排除这些蛋白中其他位点也可能导致感染的可能性。这种不确定性源于对敏感和抗性物种的受体直系物进行比较研究时固有的局限性。特别是，在以前的研究中，人们普遍认为，这些同源序列之间的序列差异可以用于识别病毒感染所需的活性位点。恰恰相反，正如我们在其他地方所建议的那样(31)有充分的理由相信，许多逆转录病毒之所以能够存活下来，部分是因为它们已经适应识别对受体正常功能很重要的不变位点，因此宿主很难在不丧失适应度的情况下进行修改。因此，我们提出，以区域C为例的高变序列可能主要是负控制区，这些区域被阐述为防御屏障，以抑制病毒接近附近不变的病毒相互作用位点。根据这一解释，将功能性受体的发散序列替换为抗药性直系同源序列可能仅因为被替换序列的抑制性低于被替换序列而导致感染。本质上，比较方法忽略了被比较蛋白质中保守序列的可能影响。
一些证据支持这样的假设，即ASCT1和ASCT2的C区主要是上述定义的阴性对照区。首先，尽管mASCT1和仓鼠ASCT1的hASCT2和N-脱糖基衍生物是该干扰组中所有逆转录病毒的活性受体，但这些蛋白质的C区序列相似性很小。此外，mASCT2的脱糖基衍生物也是HERV-W假型病毒的活性受体(23). 因此，C区的不同部分似乎不太可能是这些病毒的特定识别位点。第二，C区与ECL2中约25个氨基酸的中心区域相邻，ECL2不仅在ASCT1和ASCT2蛋白质中，而且在谷氨酸转运体家族的其他成员中高度保守(23,30,31). 类似地，如其他地方更详细地描述的那样，其他γ-逆转录病毒受体中的高变控制区也出现在高度保守序列附近(31). 第三，正如ASCT2基因相应编码区中非同义和同义核苷酸序列变化的高比率所表明的那样，C区序列似乎受到了强大的选择压力，难以多样化(23,31). 这有力地支持了这样一种假设，即这种多样性渗透到宿主C区域并不仅仅是由遗传漂变引起的，而是因为序列多样化是有利的。假设C区的负选择压力只发生在抗性物种中是不合理的，因为易感物种受到病毒的威胁最大。相比之下，以前对受体的嵌合体和突变研究假设，易感物种中的差异序列对感染有积极贡献，而抗性物种中的相应序列具有中性效应。第四，我们的证据证明C区的N-连接低聚糖对病毒感染具有抑制作用（图。和和参考文献23和25)，这与它们的作用是阻止病毒进入受体中的一个重要识别位点的想法一致。因此，我们解释了我们对ASCT2的嵌合体和突变研究（即图。)这意味着hASCT2的C区对病毒的屏障作用可能不如mASCT2相应区域强大。
N-连接糖基化和氨基酸序列变化在控制ASCT1蛋白受体功能中的协同作用。
本研究的一个显著结果是，仓鼠ASCT1 C区N194位的N-连接寡糖在预防RD114、BaEV、D型灵长类逆转录病毒和HERV-W假型病毒感染CHO细胞方面起着关键的显性抑制作用，而在N201和N206添加的两种低聚糖具有较弱的抑制作用。因此，如图。和，仓鼠ASCT1 N-脱糖基化突变体N194T、N194D、N194T-N201T、N1949 T-N206T和N194T-N201T-N206T是所有这些病毒的活性受体，而野生型仓鼠ASCT蛋白和N201T，N206T，和N201T-N206T突变体是非活性的。然而，N201和N206低聚糖显然对感染性具有辅助抑制作用，因为N194T-N201T和N194T-N206T双突变体和N194T-N201T-N206T三突变体的活性病毒受体的重复性约为单个N194T突变体的5-20倍（图。和). 在合胞体分析中也观察到类似的增强作用，这意味着N201和N206低聚糖也影响由HERV-W包膜糖蛋白介导的膜融合过程（图。). 令人惊讶的是，与N201和N206位置的寡糖相比，仓鼠ASCT1中N194位置的寡聚糖具有显著的抑制作用，因为N194寡糖似乎相对较小，这可以从其对蛋白质表面的影响中看出M（M）第页通过电泳测定（图。).
与我们实验室之前的结果一致(23,25)本报告中的证据证实，mASCT1和人类ASCT1在介导BaEV和HERV-W感染方面的活性至少是RD114或D型灵长类逆转录病毒感染的50至100倍（图。和). 此外，我们之前表明，mASCT1的N201T、N206T和N201T-N206T突变体都是逆转录病毒整个干扰组的有效受体，包括RD114和D型灵长类病毒(23,25). 因此，在mASCT1的背景下，N201和N206寡糖协同作用，强而选择性地抑制RD114和D型猴逆转录病毒的感染。鉴于mASCT1和hASCT1的这些结果，我们惊讶地发现，仓鼠ASCT1的N194T和N194D突变体在介导该干扰组中所有病毒的感染方面具有高度一致的活性，包括RD114和灵长类D型逆转录病毒SRV-2（图。,、和). 因此，mASCT1和仓鼠ASCT1之间必然存在氨基酸序列差异，从而调节N201和N206低聚糖的影响。与仓鼠ASCT1相比，这些低聚糖在mASCT1中的抑制作用明显更强。然而，即使在mASCT1的情况下，这些N201和N206寡糖也不能完全抑制，因为它们不能防止BaEV和HERV-W假型病毒的感染，并且因为这些寡糖都不足以阻止任何病毒的感染(23,25). Eiden及其同事在研究发生于印度侏儒小鼠成纤维细胞(11,12). 具体来说，他们发现M.邓尼介导生态型小鼠白血病病毒Moloney株感染的CAT1受体可以通过诱变消除N-连接的低聚糖、用衣霉素处理细胞或通过ILeu-to-Val取代N-连接低聚糖位点以外的15个氨基酸来缓解(11,12). 综合考虑，这些结果表明，N-连接糖基化对逆转录病毒受体功能的抑制作用可能取决于受体附近的氨基酸序列。
