水孔蛋白-1拓扑在成熟过程中的重新定向内质网

体外转录/翻译

用SP6 RNA聚合酶转录mRNA(新英格兰内切酶，Beverly，MA），在40°C下10μl体积中放置1 h，as如前所述(什考奇等人。, 1994). 小份是立即使用或冷冻在液氮中并储存在−80°C下。转录混合物直接添加到翻译混合物中包含[³⁵S] 蛋氨酸（交易³⁵S-label，ICN Pharmaceuticals，加利福尼亚州欧文）和40%兔网织红细胞裂解物（RRL），并进行翻译在上述条件下，在24°C下放置1小时(斯卡赫，1998年). 犬胰腺微粒体膜的制备(沃尔特和布洛贝尔，1983年)添加到最终浓度A类₂₈₀=8.0（翻译开始时）。在使用卵母细胞膜的实验，200μl等分样品冷冻膜（如下所述制备）被快速解冻，用0.3体积的90 mM KCl、50 mM HEPES（pH 7.1）稀释，并在10,000 ×克在4°C下持续10–15分钟。上清液是将其全部移除，然后将颗粒（～2μl体积）直接重悬于18μl的翻译混合物中。翻译然后按照上述方法进行。对于脉冲相位实验，通过添加环己酰亚胺（0.5 mM），样品在24°C下培养指示的时间。

非洲爪蟾卵细胞表达

对于功能研究，质粒线性化巴姆HI和体外转录，转录混合物为直接注入消泡阶段V或VI爪蟾莱维斯所述卵母细胞(Zhang和Verkman，1991年). 对于拓扑和蛋白质分析，50μCi[³⁵S] 蛋氨酸（0.5μl的10×浓缩Tran³⁵S标签[ICN药物]）添加到2μl转录混合物中，并且注入第六阶段爪蟾卵母细胞（50 nl/卵母细胞）冰。在18°C的改良Barth溶液中孵育后[MBS；88mM氯化钠、1 mM氯化钾、2.4 mM氯化氢钠_三，0.82毫米硫酸镁₄，0.33毫米钙（NO_三)₂，0.41毫摩尔氯化钙_2,10 mM HEPES钠，pH 7.4]，卵母细胞在冰上均质，加入10体积0.25 M蔗糖，50 mM醋酸盐、5 mM醋酸盐镁、1.0 mM DTT、50 mM Tris、pH 7.5、，使用特氟隆手持式均质机。在这些条件下，合成放射性标记结构至少需要60-90分钟，并且在最大合成时进行蛋白水解多肽定位于内质网室（我们未发表结果）。对于脉冲相位实验，爪蟾卵母细胞在MBS中培养1.5–3小时，然后在含有2 mM的MBS中追逐防止放射性同位素进一步掺入的蛋氨酸(熊等人。, 1997)。

卵母细胞透水性

在24–48小时后测定卵母细胞的透水性溶胀试验注射(Zhang和Verkman，1991年)。肿胀的时间过程是根据20倍用蒸馏水稀释细胞外Barth缓冲液。定量成像测量卵母细胞体积，间隔1s。通过循环水浴维持温度控制。卵母细胞透水性（P_（f）)是根据初始膨胀率[d（V/V₀)/dt]由关系：P_（f）=[d（伏/伏₀)/dt]/[（S/V₀)V（V）_w个（奥斯曼_外面的−奥斯姆_在里面],

其中S/V₀= 50厘米⁻¹，V_w个= 18厘米^三/mol和Osm_外面的−Osm公司_在里面=190毫欧。

非洲爪蟾卵母细胞膜的制备

非洲爪蟾制备卵母细胞膜如所述科比尔卡（1990）进行了一些修改。第六阶段爪蟾卵母细胞通过手术获取、解剖和胶原酶处理（IV型，2 mg/ml；Sigma Chemical，圣路易斯，MO）在室温下45分钟。用5体积的90mM KCl，50mM HEPES，pH 7.1。缓冲区被替换为90 mM KCl、50 mM HEPES中40%蔗糖（wt/vol），pH 7.1，等于卵母细胞的体积。所有后续步骤均在0-4摄氏度。将混合物通过，使卵母细胞轻轻破碎18号1.5英寸针10次。然后匀浆3000×离心3分钟克.上清液是转移到一个新的试管中，这个过程重复了五次。这个产生的乳白色上清液，含有胞浆和细胞膜，分为200-μl小份，在液氮中冷冻储存于−80°C。

蛋白酶消化

如前所述进行蛋白酶消化(什考奇等人。, 1994). 翻译混合物或XO匀浆分为冰块和氯化钙₂已添加至10 mM最终浓度。然后添加蛋白酶K（PK）（0.2mg/ml最终浓度），在有或无1%Triton®声波风廓线仪的情况下X-100。样品在冰上培养1小时通过与PMSF（10 mM）快速混合并煮沸使蛋白酶失活在10体积的1%十二烷基硫酸钠、0.1 M Tris、pH 8.0中放置5分钟然后在>10体积的缓冲液A（0.1 M NaCl，1%Triton X-100，2 mM EDTA、0.1 mM PMSF、0.1 M Tris、pH 8.0）。RRL样本直接免疫沉淀。XO样品在4°C下孵育1-2小时，16000×离心克持续15分钟至免疫沉淀前清除不溶性碎屑。的准确性蛋白酶保护试验定期使用分泌控制蛋白。只有在保护对照组持续使用>85%。因为蛋白酶保护通常效率为90–95%，即实际的移位效率水通道蛋白结构的含量可能略高于计算值值。

免疫沉淀和免疫吸附

对于免疫沉淀，抗泌乳素抗血清（ICN生物医学，加利福尼亚州科斯塔梅萨）或单克隆抗体myc-9E10(埃文等人。,1985)（小鼠腹水）以1:1000稀释度添加到翻译中产品在缓冲液A中溶解。预培养10–30分钟后，5.0μl蛋白质A–亲和凝胶(美国伯乐，加利福尼亚州里士满），以及样品在4°C下旋转10 h，然后清洗三次使用缓冲液A，两次使用0.1 M NaCl、0.1 M Tris、pH 8.0和添加SDS样品缓冲液。

为了进行免疫吸附，将翻译产物分层到0.5 M蔗糖、100 mM KCl、5.0 mM MgCl₂，1.0 mM DTT，50mM HEPES，pH 7.5，180000×离心克对于4°C下10分钟。将膜颗粒重新悬浮在50μl冰镇0.1 M蔗糖、0.1 M KCl、5 mM MgCl₂, 1mM DTT，50 mM HEPES，pH 7.5，并稀释至0.5 ml 0.1 M NaCl，0.1M Tris，pH 8.0，存在（免疫吸附）或不存在（免疫沉淀）抗体。将等分样品在4°C下培养2h，16000×离心克30分钟，以及将微丸溶解在缓冲液A中。蛋白质A-亲和凝胶（5μl）向每个试管中添加，并向免疫沉淀中添加抗体管。后续步骤与以下步骤相同免疫沉淀。

表位插入对AQP1功能的影响

确定是否存在myc表位改变AQP1折叠，我们首先表达全长AQP1.T120.myc和XO中的AQP1.P77.myc蛋白质，已知可有效合成功能性水道(Zhang和Verkman，1991年;普雷斯顿et（等）阿尔。, 1992). 卵母细胞微注射野生型或myc标记的AQP1 cRNA，质膜透水性为通过渗透性引起的肿胀来确定。如图所示​图1C，1C、，AQP1.T120.myc表现出近70%的野生型AQP1水通道活动。这与普雷斯顿et（等）阿尔。(1994)T120是表位插入的允许位点。相反，myc插入TM2-TM3肽环（AQP1.P77.myc）导致AQP1的表达非常差和快速降解（我们的未公布的结果）和几乎完全破坏水道活动（图​（图1C）。1C） ●●●●。出于这些原因，最初的实验重点是T120 myc标记的构造。

爪蟾卵母细胞AQP1的拓扑结构

通过使用一系列融合蛋白，其中C末端P报告子为在残基N端（R93）或C端工程成天然AQP1（V107、T120或L139）至TM3。cRNA与[³⁵S] 蛋氨酸转化为成熟的XO，以及之后2 h，将卵母细胞均质化，在有PK的情况下用PK消化不含非变性洗涤剂，免疫沉淀抗催乳素抗血清。在这些条件下，合成放射性标记蛋白需要60-90分钟，并进行蛋白水解在最大合成时显著降解之前，而保留在ER隔间中的构件(熊等人。,1997; 我们未发表的结果）。生成的每个构件非糖基化和核心糖基化蛋白与先前一致研究(什考奇等人。, 1994)（图​（图2，2第1、4、7和10车道；这个残基N42处的糖基化位点如图所示）。糖基化通过内切糖苷酶H消化和/或微粒体膜存在与否的体外翻译(什考奇等人。, 1994; 我们未发表的结果）。蛋白酶消化显示P报告基因转位到内质网当在残留物R93处将N端子熔断至TM3。在这个结构中，糖基化和非糖基化多肽都产生了蛋白酶保护带（图​（图2，2，车道1-3）。如前所述(什考奇等人。,1994)，一些新生的链也经历了分裂事件，可能通过信号肽酶产生额外的受保护的蛋白酶，16-kDa肽片段。当P报告员在位置C处熔断时终端至TM3，85–95%的链（车道）中的PK使其退化4–12). 观察到这些细菌有少量的蛋白酶抗性可能代表不完全消化或报告者在少量（<15%）链中易位。总之，这些数据表明，在合成TM4之前，TM3最初以I型拓扑跨越XO-ER膜，其N内质网管腔中的末端侧翼残基及其C末端残基在细胞溶质中。TM3两侧各融合点的位置推导出的拓扑如图所示​图2。2TM1的初始拓扑和TM2也显示为先前研究中确定的结果(什考奇et（等）阿尔。, 1994)。

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图2

XO中TM3的共平移拓扑。AQP1是截短并在残基R93、V107、，T120和L139，如图所示。体外转录表达的卵母细胞cRNA均质，用PK消化，用免疫沉淀抗催乳素抗血清。向上箭头（车道2）表示PK保护的P-反应片段。P的拓扑位置每个融合蛋白中的报告者如下图所示自动射线照片。在3号通道中，有少量蛋白酶抗性在洗涤剂存在下回收材料。观察到这一点在一些实验中，可能代表蛋白质原因是，它对PK消化具有内在抗性。

接下来我们使用myc标记的质粒T120.myc。TM3公司^T型,120亿日元。TM4公司^T型,T120毫米。TM5公司^T型、和120亿日元。TM6公司^T型（在残基L139、P169处截断，V214和V264）或全长AQP1.T120.myc以确定TM3在剩余时间内是否保持在I型方向AQP1合成。构造函数再次标记为[³⁵S] 微量注射XO中的蛋氨酸，消化PK，抗myc或抗P免疫沉淀SDS-PAGE前的抗血清。如图所示​图3A，三A、 残留T120的myc标签没有更改TM3的初始类型I方向。新兴的连锁店如图所示，糖基化（在残基N42处），myc和P记者主要停留在细胞溶质中蛋白酶。合成TM4（质粒120亿日元。TM4公司^T型)，C终端P报告员保持细胞溶质和PK可获得（图​（图3B）。三B） ●●●●。免疫沉淀用myc抗血清回收了一个16 kDa大小的微弱片段（图​（图3B，三B、 车道2）。（长时间曝光后碎片更容易被欣赏[我们未公布的结果]。）虽然这个碎片只有6%车道1中起始材料的强度预计为含有33%编码在完整融合中的蛋氨酸残基蛋白质。AQP1片段中可能保留有两个蛋氨酸残基（M1和M96）。消化P报告中的四种蛋氨酸残留物。（请注意，通道5中没有P-反应碎片。）M1未移除因为AQP1的17-残基胞质N末端是空间位阻的无法访问(什考奇等人。, 1994). 因此，在TM4的合成，myc表位在新生链的小部分（～20%）。

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图3

XO中TM3的拓扑重定向。质粒在AQP1残基T120编码myc报告子，然后编码P报告子表达所示的TM3、TM4、TM5或TM6（分别为A–D）在XO中，在存在或不存在Triton X-100的情况下用PK消化（细节）如材料和方法中所述。样品为用抗myc（myc）或抗催乳素（P）抗血清免疫沉淀SDS-PAGE分析。（E） 全长AQP1.T120.myc的结果。向上箭头（B–E）表示PK保护的多肽片段由蛋白酶消化产生。向下箭头（C）表示细胞溶质环不可触及的全长链蛋白酶。每个自动射线图下方的图表指示电位通过PK消化推导出myc和P表位的拓扑结构。PK网站消化用箭头表示，而无法到达的部位用箭头表示用用线挡住的箭头表示。myc和P的拓扑报告人来源于基于受保护碎片的图案。

对于T120.myc。TM5公司^T型构造，截断于V214残基，P报告基因移位到ER管腔（图​（图3C）。三C） ●●●●。P报告者的转位效率在实验，但为～50%（三个实验的平均值），一致已知信号序列活动编码在TM5中。这个导致残基N205的部分糖基化N42残基与三条全长蛋白带的出现（图​（图3C，三C、 车道1和4），如前所述(什考奇et（等）阿尔。, 1994). 15%至20%的新兴连锁店在没有洗涤剂的情况下，完全抵抗PK消化（图​（图3C，三C、 向下箭头）。因此，myc表位是在这些多肽中是无法接近的。PK消化也产生了几个myc-反应性、蛋白酶保护片段（图​（图3C，三C、 车道2，向上箭头）。有趣的是，一个30-kDa片段对两个P和myc抗体（图​（图3C，三C、 车道2和5，向上箭头）。由于P报告基因的大小为15 kDa，因此很可能产生了这个片段来自TM3 N末端的PK消化（预测的裂解位点如图所示​图3C）。三C） ●●●●。这将去除10–12 kDa的AQP1多肽并生成包含P报告子和额外的15 kDa糖基化、myc标记的AQP1多肽。这些碎片代表10%的初始信号，包含五个六个蛋氨酸残基存在于全长链中。较小的此外，还观察到16kDa大小的myc反应片段表示初始信号的2%，但仅包含33%的初始蛋氨酸残留物（图​（图3C，三C、 车道2）。这些的存在异质碎片表明有几种替代拓扑在AQP1的这个特定阶段，内质网膜中存在形式生物成因（图​（图3C）。三C） ●●●●。根据预测的蛋氨酸分布在融合蛋白中，我们计算出myc表位变成之后立即在35%的新生链中免受蛋白酶的影响TM5的合成。

T120.myc的蛋白酶消化。TM6公司^T型建造生成两个29和26 kDa的myc反应性多肽片段（图​（图3D，三D、 向上箭头）。在这种情况下，尺寸的变化是由于去除P报告子和细胞溶质AQP1 C末端残基分别为糖基化和非糖基化多肽（注意图中无P保护碎片​图3D，三D、 车道5）。受保护的碎片代表16%的初始带强度，但仅包含33%的初始蛋氨酸残留。因此，myc表位是48%的合成链受到保护。同样，49%的从全长AQP1.T120.myc构造派生的链PK消化后生成29-kDa myc反应性核心片段。这个与42残留AQP1 C末端内的PK消化一致细胞溶质域（图​（图3E）。三E） ●●●●。每一个都有受保护的碎片因此，构建物代表AQP1的整个疏水核心与myc标签和N-连接低聚糖一起预测大小约为29 kDa。

这些结果表明，在XO中，AQP1-TM4、-TM5和-TM6与TM3-TM4肽的部分重新定向有关从其初始蛋白酶可获得的细胞溶质位置到蛋白酶保护的、对洗涤剂敏感的部位，可能位于ER中流明。

体外AQP1拓扑

当在补充有犬胰腺微粒体膜的RRL中表达（客户关系管理）(什考奇等人。, 1994). 因此，我们测试了AQP1拓扑成熟也在体外重建。质粒T120毫米。TM4公司^T型，-TM5^T型、和-TM6公司^T型全长AQP1.T120.myc为以RRL表示，并辅以CRM，报告拓扑为通过蛋白酶消化和免疫沉淀测定（图​（图4A）。4A） ●●●●。生成的每个构件核心糖基化蛋白类似于在XO中观察到的蛋白。在CRM中，P在TMs 4和6（图​（图4A，4A、 车道4-6和16-18）。当记者遵循TM5（构造T120.myc.TM5^T型)，两个PK消化后回收的P-反应片段包含信号强度的10%和初始蛋氨酸的三分之二残留物（图​（图4A，4A、 车道10–12）。因此，记者被转移了TM5进入内质网腔，尽管易位再次启动（～15%）的效率明显低于XO。在这些链条中，TM5和TM6均以其预测方向跨越膜，TM5-TM6肽环位于内质网腔中。与…对比XO，myc表位保留细胞溶质，蛋白酶在>所有结构的90%，包括全长AQP1（对比图​图4A，4A、 7–9和13–15车道，图​图3）。三). 这些发现表明补充CRM的RRL未能重新定位TM3-TM4肽循环并生成成熟的六跨AQP1拓扑。符合该发现AQP1.T120.myc也未能获得其抗蛋白酶核心构象。

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图4

体外AQP1拓扑。的表达式T120毫米。TM4公司^T型，-TM5^T型、和-TM6^T型和RRL和犬胰腺微粒体（A）中的AQP1.T120.myc或卵母细胞来源的内质网膜（B）。翻译产品被消化PK和免疫沉淀，如图所示​图3。三.向上箭头表明多肽片段在没有洗涤剂，但没有洗涤剂。的潜在拓扑放射自显影图下显示的表位是从蛋白酶中推导出来的myc和P记者的可访问性。PK消化的位点是表明。

了解XO和RRL，我们尝试使用互补方法。在这方面，补充RRL卵母细胞胞浆和含CRM的体外微量注射将AQP1结构合成到XO中并没有显著改善AQP1成熟效率（我们未发表的结果）。然而，当AQP1构建物在RRL中表达，并辅以XO衍生ER膜（XOmb），myc标记的结构产生了一个紧密的拓扑类似于从完整XO中获得的XO（图​（图4B）。4B） ●●●●。合成后TM4（T120.myc.TM4^T型)，P记者留下了细胞溶质，而myc表位在27%的新生链（图​（图4B，4B、 车道1-6）。（注意16-kDamyc反应片段仅代表初始信号的9%强度。）TM5合成后（T120.myc.TM5^T型)，16%的新兴连锁店再次受到蛋白酶的完全保护（图​（图4B，4B、 车道7–12）和a回收了PK保护的约30kDa片段，其中含有两种myc和P表位。正如我们在卵母细胞中观察到的那样，myc表位是在这个阶段，总共34%的新生链受到蛋白酶的保护合成阶段，该分数与P报告者的易位效率（31%）。类似地，在TM6的合成、P报告子和AQP1 C末端细胞溶质，而myc反应性蛋白酶保护的片段从T120.myc的60%中恢复。TM6公司^T型和42%的AQP1.T120.myc新生链（图​（图4B，4B、 13–15和19–21车道）。这些数据表明，在XOmb中，与完整XO中一样，TM3的重新定向TM4合成后开始，并且重新定向的效率随着合成额外的C末端TM片段而增加。

体内和体外AQP1成熟

确定TM3的不完全重新定向微注射XO和体外表达系统代表了我们研究了低效的成熟过程与延迟的成熟动力学全长myc标记AQP1结构的拓扑成熟使用脉冲相位分析。RNA注射后2小时在XO中，AQP1.T120.myc主要作为核心糖基化物回收表观大小为33 kDa的多肽。PK消化产生29-30kDa myc-反应片段，包含32%的初始片段放射性信号和66%的初始蛋氨酸残留。因此，48%的新合成AQP1蛋白获得了蛋白酶抗性合成后立即构象（图​（图5，5、A和F）。在追逐期间，我们观察到分数和获得的核心糖基化AQP1蛋白的绝对量保护蛋白酶的构象。myc表位的蛋白酶保护在合成后5小时内达到78%的最大值（平均值三个实验；图​图5F）。5F） ●●●●。

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图5

AQP1在体内和体内的拓扑成熟体外试验。编码AQP1.T120.myc的质粒在显微注射中表达爪蟾卵母细胞（A），RRL补充CRM（B），以及如前所述，RRL补充ER-衍生卵母细胞ER膜（D）材料和方法。在RNA注射后指示的时间（A） 或启动体外翻译（B–E），样本为用PK消化并免疫沉淀，如图所示​图3三和​和4。4.向下箭头表示糖化的全长AQP1链。向上箭头表示PK保护的AQP1疏水核。C类E显示分泌控制的蛋白酶保护结果蛋白质，牛催乳素，分别在CRM和XOmb中翻译和培养。（F） 蛋白酶AQP1.T120.myc的抗性由获得PK抗性的糖基化链。（G） 总AQP每个时间点的蛋白质。结果表示三至四个单独的实验±SE。

与XO相比，AQP1.T120.myc的<10%收购了RRL中的蛋白酶抗性构象1小时（图​（图5B，5B、 车道1-3）。这一比例仅增加到23%在12小时的追逐过程中（图​（图5B，5B、 车道4–12和5F）。对于这些实验表明，CRM在引导多肽方面的效率>95%移位，微粒体膜保持完整在追逐期间完全完好无损（图​（图5C）。5C） ●●●●。附加实验表明，AQP1成熟效率当翻译和/或孵育在不同温度下进行（我们未公布的结果）。在RRL中补充有XOmb、34%和75%的糖基化AQP1.T120.myc在1和12小时内获得了一种抗蛋白酶构象，分别（图​（图5，5、D和F）。RRL补充了XOmb，因此在促进AQP1拓扑成熟方面表现出类似的效率作为完整的卵母细胞。移位在XOmb中也很有效，并且膜的完整性在整个孵育期内保持不变（图​（图5E）。5E） ●●●●。因此，AQP1未能在CRM中成熟并不仅仅是一个体外RRL系统的伪影，但却反映了特异性ER衍生微粒体膜的特性。重要的是不同内质网膜对直接易位的效率没有似乎可以预测他们重组其他事件的能力AQP1拓扑成熟所必需的。

排除myc表位保护增加的可能性可能是由于四跨结构的相对不稳定性，对每个时间点的总AQP1蛋白进行定量（图​（图5G）。5G） ●●●●。在每个系统的蛋白质都会逐渐丢失。然而，退化是缓慢的，并且发生的时间无法解释观察到的拓扑结构发生变化。在XO和XOmb中，超过90%的AQP1存在合成后5小时，在重新定向接近完成。

AQP1在ER衍生膜中的免疫吸附

为了进一步证实T120-myc表位被转位到在体外AQP1成熟过程中，我们测试了内质网内腔使用非蛋白水解剂可获得myc表位免疫吸附分析（图​（图6）。6)。全长AQP1构建物AQP1.T120.myc和一种控制蛋白编码N末端myc标签（myc.AQP1）的基因在RRL中表达补充CRM或XOmb。微粒体在存在或不存在抗myc抗体并通过蔗糖沉淀缓冲。然后将吸附抗体回收的蛋白质与洗涤剂后免疫沉淀法回收蛋白质溶解作用。含有在CRM和XOmb中，N-末端myc表位均>50%（图​（图6，6、A和C） ●●●●。这一结果与确定的细胞溶质相一致N端点的方向(Smith and Agre，1991年;什考奇et（等）阿尔。, 1994)并证明膜上的myc标签细胞溶质抗体可获得该蛋白。少于10%当myc表位位于内质网腔（残基P77未发布的结果）。在CRM中AQP1.T120.myc结构在1和8小时内分别为55和45%翻译，分别表明myc表位在残基T120仍然主要可以从胞浆中获得在图中所示的四跨拓扑中预期​图1。1.英寸然而，XOmb的免疫吸附效率最初只是23%，孵育8小时后降至13%，与myc表位重新定位为不可访问的一致，管腔位置（图​（图6，6、B和C）。超过总AQP1的80%蛋白质在8h孵育期内恢复。这些发现支持蛋白质水解实验得出的结论，即XOmb，但不是CRM，有效重建T120-myc表位的易位进入ER管腔。

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图6

myc标记AQP1的免疫吸附。质粒编码M1，myc残基的myc表位。AQP1（A）或残渣T120，AQP1.T120.myc（B），在CRM或翻译后，免疫吸附（IA）和按照材料和方法。（C） 免疫吸附回收的蛋白质百分比经过8h追踪期后，免疫沉淀法恢复了蛋白质。8小时后剩余的总蛋白质显示在自动射线照片。值表示对照质粒myc。AQP1和三个实验（±SE）AQP1.T120myc（AQP1.T120.myc）。

作者感谢Skach实验室的成员对手稿进行有益的讨论和评论，并向K。Moss寻求技术援助。这项工作得到了National的支持卫生研究院资助GM 53457和DK51818。W.R.S.是一个美国心脏协会的资深研究员。