多位点蛋白激酶A和糖原合成酶激酶3β磷酸化导致SCF对Gli3泛素化^βTrCP

细胞培养和转染。

细胞系在含有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中生长。为了通过免疫印迹分析细胞提取物，将细胞置于12孔板中，并使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染总计500 ng的质粒。在每个孔中转染50毫微克Flag-Gli3表达载体，当需要时，共转染50 ng PKA、50 ng GSK3β、50 ng GSK3βR85或250 ng血凝素βTrCP（HA-βTrCP）表达载体。将空表达载体质粒添加至总计500 ng。当提及时，用以下物质处理细胞：20μM MG132、20 mM LiCl、50μM forskolin或100 ng/ml多西环素。转染磷酸盐缓冲液（PBS）后24小时收集细胞，并将其重新悬浮在裂解缓冲液中（50 mM Tris，pH 8，150 mM NaCl，1%NP-40，1 mM EDTA，和蛋白酶抑制剂混合物[Roche]）。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离全细胞裂解物，并通过蛋白质印迹和ECL检测（Amersham）进行分析。Chemigenius对截断和全长Flag-Gli3对应的信号进行了量化²（Syngene）。截短的Gli3-83的相对水平表示为检测到的总Gli3的百分比。实验重复至少两次，结果相似，并显示了包括量化在内的代表性实验。

通过小干扰RNA沉默。

将HEK-293T或HeLa人类细胞以40%至50%的合流率接种到12孔板上，使用Lipofectamine 2000转染10nM小干扰RNA（siRNA）双工体。24小时后，用siRNA和质粒的混合物使用Lipofectamine 2000对细胞进行第二次转染。用于βTrCP沉默靶点βTrCP和高度同源的βTrCP2 mRNA的siRNA双工体(13). 人类细胞中siRNA敲除和小鼠胚胎干细胞中βTrCP基因敲除的研究表明，βTrCP和βTrCP2对β-catenin和IκB等底物具有冗余活性(13). 对照组为以荧光素酶为靶点的21个核苷酸双链体。

免疫沉淀。

对于外源表达蛋白之间的相互作用，使用Lipofectamine 2000在6孔板中用3μg质粒DNA/well转染NIH 3T3细胞。对于外源性βTrCP和内源性Gli3之间的相互作用，使用C3H-10T1/2细胞。转染后24小时，在PBS中收集细胞，并将其重新悬浮在裂解缓冲液中。蛋白质提取物在4°C下与蛋白G-琼脂糖珠（Roche）孵育1小时进行预处理，在4°C下与抗Flag或抗-HA抗体孵育2小时，在4℃下与蛋白G琼脂糖珠子孵育1h进行免疫沉淀。用裂解缓冲液洗涤提取物三次，用添加0.3 M NaCl的裂解缓冲液冲洗两次，并在30μl Laemmli缓冲液中洗脱。免疫沉淀蛋白通过SDS-PAGE分离，并使用辣根过氧化物酶偶联的抗Flag或抗HA抗体通过Western blotting显示。

体内泛素化试验。

用250 ng Flag-Gli3（或其突变体）、1μg HA-ubiquitin、125 ng PKA、125 ng GSK3β表达载体和1μg myc-βTrCP或对照表达载体将NIH 3T3细胞转染在6孔板中。转染后24小时，在PBS中收集细胞，在95°C下在100μl裂解缓冲液中裂解10分钟，该缓冲液补充有5%SDS，10 mMN个-乙基马来酰亚胺，并在补充有10 mM的500μl细胞裂解缓冲液中稀释N个-乙基马来酰亚胺。蛋白质提取物进行抗病毒免疫沉淀，用添加1%SDS的裂解缓冲液洗涤四次，然后在Laemmli缓冲液中洗脱。免疫沉淀蛋白通过SDS-8%PAGE分离，并通过使用辣根过氧化物酶偶联的抗-Flag或抗-HA抗体的蛋白质印迹来揭示。洗脱液的一部分（1/20）用于检测鞭毛Gli3及其衍生物，剩余部分用于检测HA-ubiquitin。

Gli3蛋白水解过程需要βTrCP。

我们选择测试βTrCP在PKA和GSK3β刺激的Gli3加工中的作用。首先我们调制SCF^βTrCP转染野生型βTrCP表达载体的活性(15). 为了跟踪Gli3的处理过程，我们使用四环素依赖的Flag-Gli3表达载体进行了转录关闭实验。添加四环素类似物多西环素后，共表达的Tet-Off转录因子抑制Flag-Gli3载体的转录。当福斯科林同时添加到多西环素中时，我们可以观察到转录关闭后截短的Gli3的相对水平逐渐增加，在4小时内达到总Gli3含量的56%（图。​（图2A，2安培，左侧面板）。βTrCP过度表达后，截短的Gli3水平增加更快，在4小时时达到总Gli3的80%（图。​（图2A，2安培，比较左右面板）。为了抑制SCF^βTrCP，我们接下来使用针对人类βTrCP mRNA的RNA干扰(13). 图​图2B2B型表明针对人类βTrCP的特异性siRNA(13)转染人293T或HeLa细胞后，Western blotting检测到PKA和GSK3β过度表达刺激的截短Gli3水平显著降低。因此，我们发现刺激SCF^βTrCP导致刺激Gli3处理，反之，干扰内源性SCF^βTrCP导致其抑制。综上所述，这些结果表明SCF^βTrCP是Gli3蛋白水解过程所必需的。此外，与泛素化后蛋白酶体的作用一致，用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞可抑制Gli3处理（图。​（图2C），2摄氏度)，类似于最近一份关于一系列蛋白酶体抑制剂的报告(12).

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图2。

截短的Gli3合成需要βTrCP。（A） 野生型βTrCP的过度表达刺激转录阻断实验中截短Gli3的合成。用pBI-G-Flag-Gli3、pTet-Off和GSK3β表达载体以及对照（−）或HA表位标记的βTrCP（HA-βTrCP）表达载体转染NIH 3T3细胞。用50μM forskolin（FSK）和100 ng/ml多西环素（DOX）处理细胞，并在0 h、4 h和8 h后收集，以分析截短与全长Flag-Gli3的相对水平。（B） βTrCP下调抑制Gli3处理。将抗人βTrCP（+）或荧光素酶（−）的siRNA与Flag-Gli3、PKA和GSK3β表达载体一起转染HeLa和293T细胞。右侧面板显示siRNA对抗βTrCP对HA-βTrCP的特异性下调。将抗βTrCP（+）或荧光素酶（−）的siRNA与HA-βTrCP表达载体一起转染293T细胞。用抗HA抗体检测等量的细胞裂解物，检测HA-βTrCP和抗-β-半乳糖苷酶（βGal），作为转染和巨细胞病毒表达水平的控制。（C） MG132蛋白酶体抑制剂抑制Gli3加工。用Flag-Gli3、PKAc和GSK3β表达载体转染NIH 3T3细胞。用20μM MG132（+）或载体（−）处理细胞6 h，并通过反标记免疫印迹分析等量的细胞裂解物。

βTrCP与多个Gli3结构域相互作用。

为了测试βTrCP是否直接将Gli3连接到泛素蛋白酶体系统，我们在共免疫沉淀实验中检测了Gli3和βTrCP之间的相互作用。

首先，使用山羊抗Gli3抗体从C3H-10T1/2（先前报道表达Gli3）中免疫沉淀内源性Gli3（图。​（图3A）。3A级). 由于缺乏有效的抗βTrCP抗体，因此在总蛋白提取物或免疫纯化组分中均无法检测到内源性βTrCP。然而，HA-标记的βTrCP是由抗Gli3抗体而非山羊抗FGFR4对照抗体特异性共免疫沉淀的。此外，HA-βTrCP可被Flag-Gli3特异性共免疫沉淀（图。​（图3B）。第3页). 这些结果与Gli3和βTrCP在体内的物理相关性一致。

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图3。

Gli3与βTrCP相互作用。（A） 内源性Gli3与HA-βTrCP相互作用。用HA-βTrCP表达载体转染C3H-10T1/2细胞。将来自四个C3H-10T1/2细胞板的细胞裂解液分成两半，并使用对照（αCtAb，对照FGF4R抗体）或抗Gli3N抗体进行平行免疫沉淀。免疫沉淀物用抗HA抗体免疫印迹法检测HA-βTrCP或用抗Gli3抗体检测内源性Gli3。IP，免疫沉淀。（B） HA-βTrCP与Flag-Gli3共免疫沉淀。将HA-βTrCP表达载体和对照Flag或Flag-Gli3表达载体与PKA和GSK3β表达载体一起转染NIH 3T3细胞，以刺激截短Gli3的合成。等量的细胞裂解物进行反标记免疫沉淀，并通过免疫印迹法进行分析。（C） Gli3与HA-βTrCP共免疫沉淀的三个不同区域。将表达载体与PKA和GSK3β表达载体一起转染NIH 3T3细胞，以刺激截短Gli3的合成。质粒混合物包含HA-βTrCP或βTrCP-myc表达结构，后者在共免疫沉淀实验中用作阴性对照。使用抗-HA抗体对细胞裂解物进行βTrCP免疫沉淀，然后进行抗Flag或抗-HA免疫印迹。在底部面板中，显示了不同的构造。指出了合成截断Gli3（垂直条）所必需的PKA位点P1至P6的位置以及负责DNA结合（ZF）的锌指区域。通过与HA-βTrCP共免疫沉淀分析推断出的βTrCP结合位点用加号表示。实验表明Gli3ΔN含有两个与βTrCP独立的结合位点，但未显示（然而，Gli3中心686-1100结构域与βTrCP结合，见图。​图5）。5). 在PKA和GSK3β的刺激下，Gli3ΔN生成了一个截断形式，该形式不与βTrCP结合，很可能是由于缺乏N末端βTrCP相互作用域。在与Gli3位置461至880相对应的通道中，我们检测到截短产物的水平很低，这可能是由于低水平的本构加工，因此不受PKA、GSK3β或βTrCP过度表达的调节（数据未显示）。wt，野生型；Nter，N端子；Cter，C端子。

接下来测试了一系列Gli3蛋白片段在体内结合βTrCP的能力，如图所示。​图3C3C公司总结如图。​图3D。三维在HA-βTrCP免疫沉淀物中可以检测到全长和截短的Gli3，这表明截短的Gli3（大致对应于位置1至位置700/740的片段）足以与βTrCP结合。含有负责DNA结合的锌指区域的461至880位片段和665至670位的DSGSHS序列不足以与βTrCP结合。这表明DSGX_2-4Gli3中665-670位的S基序不足以与βTrCP结合，这与我们的发现一致，即该基序的突变不影响Gli3的处理（数据未显示）。有趣的是，我们发现一个缺乏DSGX的N端域_2-4S基序足以与βTrCP结合，并可能是截短的Gli3和βTrCP之间观察到的相互作用的原因。然而，ΔN_[461-1595]缺乏该N末端结构域，仍能结合βTrCP。最后，在进一步的共免疫沉淀分析中，我们可以从ΔN中找到两个片段_[461-1595]它们各自能够独立结合βTrCP：一个位置686到1100的中心片段（指定为中心686-1100结构域），包含PKA和GSK3β位点，以及一个位置1100到1595的C末端结构域（数据未显示）（图中的示意图。​图3D）。三维). 因此，我们得出结论，βTrCP与Gli3中至少三个独立的结构域相互作用。为了进一步分析βTrCP结合域在Gli3加工中的作用，我们接下来选择（i）检查N-末端和C-末端结合域对加工是否必要；（ii）测试PKA位点在βTrCP与中央686-1100结构域结合中的重要性；以及（iii）研究βTrCP是否与Gli3结构域直接相互作用。

βTrCP-结合域是高效Gli3处理所必需的。

我们首先研究了N端和C端βTrCP结合域在Gli3加工中的作用。N或C末端结构域的缺失显著降低了相应ΔN表达的截短Gli3水平_[461-1595]和ΔC_[1-1100]碎片（图。​（图4，4，将9号和2号车道分别与1号车道进行比较）。正如预期的那样，后一种结构中含有PKA磷酸化位点的Gli3结构域的缺失（分别给出跨越位置461-880和1-880的片段）与多个PKA位点突变时观察到的一样，显著减少了加工（图。​（图4，4、10号和11号车道以及3号和4号车道）。因为我们对共免疫沉淀试验的研究表明，βTrCP仍能与ΔN结合_[461-1595]和ΔC_[1-1100]片段，我们测试了βTrCP过表达是否仍能有效刺激加工。我们发现，βTrCP过度表达会强烈诱导N端和C端结构域缺失的突变体的加工，并观察到截短蛋白的水平接近野生型Gli3的水平（图。​（图4，4，分别为12和6车道）。令人惊讶的是，多个PKA位点突变体仍然无法产生截短的蛋白质（图。​（图4，4分别为泳道14和8）。这些发现表明，βTrCP与N端和C端结构域的结合对于有效的蛋白水解过程是必要的，但在βTrCP过度表达的情况下是不必要的。

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图4。

Gli3 N端和C端结构域是高效处理所必需的。将指示的构建体用PKA和GSK3β表达载体转染到NIH 3T3细胞中，并通过免疫印迹分析截短（trunk）和全长产物的相对水平，如图图例所述。​图1。1.mP2P3表示PKA位点P2和P3的丝氨酸-丙氨酸突变。

βTrCP与Gli3中央686-1100结构域的结合依赖于PKA磷酸化。

接下来，我们研究了与Gli3中央686-1100结构域结合的βTrCP上PKA位点突变的后果。单位点P2、P3或P4的突变不会显著损害βTrCP与中央686-1100结构域结合的能力，而P2和P3位点突变的突变体不再能够与βTrCP相互作用（图。​（图5A）。5A级). 与这些结果一致，我们发现βTrCP过度表达显著刺激了单个PKA位点上Gli3突变体的加工，而多个磷酸化位点上的Gli3突变则没有（图。​（图5B，第5页，将车道1至5与车道6至10进行比较）。因此，似乎Gli3的多位点PKA磷酸化是βTrCP与Gli3中央686-1100结构域结合和加工所必需的。相反，在共免疫沉淀分析中，我们没有检测到单个或多个PKA位点突变对βTrCP和全长Gli3之间的相互作用的任何影响（数据未显示）。此外，我们发现βTrCP与N-和C-末端结构域的结合在PKA刺激后没有改变（数据未显示）。综上所述，这些结果表明，在我们的实验系统中，βTrCP通过其N-和C-末端结构域与Gli3相互作用，而不依赖于PKA磷酸化，并且在PKA磷酸化时诱导与中央686-1100结构域的额外结合。

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图5：。

PKA位点突变对βTrCP与Gli3中央686-1100结构域结合的影响。（A） 用HA-βTrCP、PKA和GSK3β表达载体以及野生型Gli3中央686-1100结构域、突变型Gli3-中央686-100结构域或对照（ct）表达载体转染细胞。细胞裂解物进行抗病毒免疫沉淀（IP）并进行免疫印迹分析。（B） 使用PKA和GSK3β表达载体将所示构建物转染到NIH 3T3细胞中，并通过免疫印迹分析截短产物和全长产物的相对水平，如图图例所示。​图1。1mG2、mP2和mP2P3分别表示G2位点、P2位点以及P2和P3位点的突变Flag-Gli3。

Gli3中央686-1100结构域中直接βTrCP结合位点的鉴定。

βTrCP的直接结合通常由磷酸化的DSGX介导_2-4泛素化底物中的S基序(11,36). 在共免疫沉淀试验中发现与βTrCP相互作用的Gli3结构域没有DSGX_2-4S图案。然而，在中央686-1100结构域中，我们可以识别出四个与DSGX相关的序列基序，命名为β1到β4_2-4S基序，因此可能参与βTrCP的直接结合（图。​（图6A）。6A级). 其中一个基序与先前确定的PKA或GSK3β位点不重叠。因此，我们重点测试其在Gli3加工中的作用以及与βTrCP的直接相互作用。数字6B和C表明β4基序确实是Gli3加工和βTrCP与Gli3中央686-1100结构域结合所必需的（图。6B和D，比较车道1和2）。为了确认Gli3中识别的基序是βTrCP结合位点，我们进行了肽交换实验，并将基序β4替换为来自β-catenin（其非活性突变体）的βTrCP连接基序、串联基序β1+β2或基序β3。当基序β4被来自β-catenin的βTrCP-binding基序所取代时，Gli3处理稍有增强（图。​（图6B，6亿βTrCP与中心结构域的结合得到了强烈增强（图。​（图6C，6摄氏度相反，用β-catenin的非活性突变体基序替换β4不允许βTrCP的显著加工和结合（图。6B和C，车道4）。此外，我们发现β4基序可以被串联的β1+β2或β3基序取代（图。​（图6B，6亿，车道5和6），以及图。​图6C6摄氏度强烈提示模体β1+β2、β3和β4是直接的βTrCP结合位点（第5和第6道）。重要的是，这些数据在Gli3的直接βTrCP结合和蛋白水解过程之间建立了紧密的关联。

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图6。

Gli3处理需要βTrCP的直接结合。（A） 与DSGX相关的四个序列基序的鉴定_2-4SβTrCP结合位点位于PKA位点P1和P4之间。SCF公司^βTrCP先前识别的基板包含DSGX_2-4βTrCP结合所必需的磷酸化的S序列。图中下划线的序列基序β1至β4与DSGX有关_2-4用黑体表示的残留物对齐的S图案。对方框所示的16氨基酸序列进行突变，以测试基序β4在βTrCP的加工和结合中的作用。（B） 基序β4突变对Gli3加工的影响。用PKA和GSK3β表达载体将指示的构建物转染NIH 3T3细胞，并通过免疫印迹分析截短和全长Gli3的相对水平。所测试的结构包含斜体所示的含有基序β4的16-氨基酸盒的突变。β-catenin（βcat）βTrCP-binding位点的定位使得关键丝氨酸在PKA磷酸化位点P4（即在模拟其正常磷酸化的环境中[1]). 突变的β-catenin基序不结合βTrCP(15,36). （C） β4基序突变对βTrCP与Gli3中央686-1100结构域结合的影响。如图所示，用HA-βTrCP、PKA和GSK3β表达载体以及野生型（wt）或突变型（mut）Gli3中央686-1100域表达载体或对照表达载体（ct）转染NIH 3T3细胞。细胞裂解物进行抗病毒免疫沉淀（IP）并进行免疫印迹分析。显示了联合免疫沉淀（coIP）HA-βTrCP免疫印迹的短期和长期暴露。（D） 基序β1+β2和β3突变对Gli3在其自然背景下（上面板）或替换基序β4时（下面板）的加工的影响。用PKA和GSK3β表达载体将指示的构建物转染NIH 3T3细胞，并通过免疫印迹分析截短和全长Gli3的相对水平。mP2P3表示PKA位点P2和P3处的突变Flag-Gli3。

为了进一步测试β1+β2和β3基序的重要性，我们选择突变与磷酸化位点P1和P2分离的β1+α2中的丝氨酸855和856，以及突变为丙氨酸的丝氨酸S864，其对丙氨酸的突变不会修改RRXS PKA位点，因此应该保留PKA磷酸化S865（P2位点）的能力。图中的上部面板。​图6D第6天表明每个突变都会损害Gli3处理（第2和第3道），并且含有S855A、S856A和S864A突变的突变与多位点PKA突变（第5和第6道）处理效率低下。此外，我们检查了突变的β1+β2和β3基序不能取代基序β4（图。​（图6D，第6天，下部面板，通道4和6）。我们的结论是，在PKA和GSK3β刺激下，为了充分发挥Gli3处理的效率，所确定的多个βTrCP结合位点都是必需的。

由泛素蛋白酶体系统进行处理。

我们的研究表明，Gli3属于受泛素蛋白酶依赖性加工调节的转录因子小家族(30). 在NF-κB途径中，p100和p105被加工成C末端截短的蛋白质，这些蛋白质转移到细胞核并激活转录(6,10). 泛素化将这些转录因子靶向蛋白酶体，但直接加工而非降解的分子机制尚不清楚。最近的体外研究证实，蛋白酶体可以进行模型底物的处理，在到达抗性蛋白域时，蛋白质水解被停止(21). Gli3中的解理位点似乎位于锌指结构域的末端。研究蛋白酶体加工是否受阻将是一件有趣的事情顺式在Gli3的切割位点附近或反式可能通过二聚作用(20).

修订的共识βTrCP结合基序。

我们发现了Gli3加工所需的多个βTrCP结合位点，这些位点偏离了DSGX_2-4在大多数βTrCP底物中发现S基序。通过用β-catenin基序替换基序β4，我们发现βTrCP的结合和加工被恢复，这正式证明了βTrCP结合是Gli3加工所必需的，并强烈表明模序β4是真正的βTrCP绑定位点（图。​（图6C）。6摄氏度). 基序β1+β2和β3也可以取代基序β4，也可能是直接的βTrCP结合位点（图。6B和C). 非DSGX_2-4最近在其他几个SCF中发现了SβTrCP结合基序^βTrCP基底。我们将其与Gli3中的βTrCP结合基序对齐，并提出了一个修正的共识βTrCP绑定基序（图。​（图8）。8). 与DSGX相比，分子建模和体外相互作用研究对于解决βTrCP如何与Gli3中的多个基序结合至关重要_2-4S主题。

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图8。

已知SCF中βTrCP结合基序的比对^βTrCP基底。第一个SCF^βTrCP识别的基板允许定义通用DSGX_2-4βTrCP结合需要磷酸化的S序列(11). 最近确定的底物中βTrCP结合位点的比对允许提出修订的一致性βTrCP连接基序。对于hCDC25A、Per2、p100、xCDC25A和Wee1A基板，请参阅参考文献三,8,10,19、和35分别是。

PKA通过GSK3β和CK1触发Gli3磷酸化级联反应。

有趣的是，在Wee1A和xCDC25A的情况下，DSGX中的一个或两个丝氨酸_2-4S基序被丝氨酸磷酸模拟物天冬氨酸或谷氨酸取代（图。​（图8）。8). 相反，Gli3中的基序具有适合DSGX的丝氨酸_2-4因此，βTrCP的S基序和结合预计严格依赖于磷酸化。事实上，β3基序中的S865对应于PKA位点P2。对于Gli3的βTrCP结合基序中的其他丝氨酸，我们认为它们在PKA初始启动后通过GSK3β和CK1的顺序活性被磷酸化（图。​（图9）。9). S855和S864在模体β2和β3与DSGX的对齐中占据天冬氨酸的位置_2-4S基序，可以预见，通过GSK3β/CK1级联对这些丝氨酸进行磷酸化将有助于有效的βTrCP结合。因此，PKA可能通过GSK3β和CK1触发Gli3磷酸化级联反应，从而激发βTrCP的直接结合和泛素化。这个简单的模型很好地解释了PKA和GSK3β位点对βTrCP结合和Gli3加工的重要性（图。​（图11和​和5）。5). 在这篇论文发表期间发表的研究表明，GSK3β引发的CK1磷酸化，而不仅仅是先前描述的PKA引发的CK1磷酸化，确实是在D.黑腹果蝇，最有可能是导致直接Slimb绑定(17).

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图9：。

通过推测的GSK3β、CK1和PKA磷酸化级联实现βTrCP结合位点的磷酸化。PKA磷酸化红色箭头所示的共有RRXS位点中的丝氨酸。GSK3β将丝氨酸四个残基N端磷酸化为磷酸丝氨酸，而CK1将丝氨酸三个残基C端磷酸化成磷酸丝氨酸；两者都可以在引发后对底物进行多磷酸化(1,9,14). 因此，模体β1中的S855可以如下磷酸化：通过PKA启动S852和S855的顺序磷酸化，通过CK1实现S849（P1）磷酸化。模体β2中S856的磷酸化可能如下：PKA通过CK1启动S868，然后通过GSK3β启动S864、S860和S856。除S850和S894（用黑色箭头表示）外，β1至β4基序中的所有丝氨酸（蓝色和绿色箭头分别表示CK1和GSK3β的磷酸化）都可以很容易地提出类似的磷酸化途径。S850和S894缺少丝氨酸n个+4或n个磷酸化启动的−3个位置，其序列上下文与未启动的CK1位点的序列上下文不相似(14). 另一种候选激酶被融合。如果βTrCP可以与重叠的DSS结合，则可能不需要S850磷酸化₈₅₀ASTIS图案（带S₈₅₀与一致意见中的G/A对齐），而不是图。​图8。8在任何情况下，P1到P4的65氨基酸片段中的19个丝氨酸，包括βTrCP结合基序β1到β4中的大多数丝氨酸，可能在PKA启动后被GSK3β和CK1磷酸化。

然而，PKA/GSK3β/CK1磷酸化的级联可能不是参与Gli3加工并可能受Hedgehog信号调节的唯一磷酸化事件。基序β1和β4中的S850和S894不太可能被GSK3β和CK1磷酸化（图。​（图9）。9). 另一种候选激酶可能是融合丝氨酸/苏氨酸激酶(24). 此外，PKA位点P5和P6对Gli3加工至关重要(34)，但它们与GSK3β、CK1或潜在的βTrCP结合基序不相邻，可能通过不同的机制起作用。

Gli3，一种具有多个βTrCP结合位点的非经典底物。

SCF中存在多个结合位点是不常见的^βTrCP基底。Gli3中发现的βTrCP结合位点的结合亲和力可能低于β-catenin。当motifβ4被β-catenin的βTrCP结合位点取代时，βTrCP与Gli3的结合显著增加_[686,1100]在共免疫沉淀分析中观察到（图。​（图6C）。6摄氏度). 相反，用基序β1+β2或β3替换β4并没有改变检测到的相互作用水平。然而，也可能涉及磷酸化水平的差异，这里再次需要使用合成肽进行体外研究，以直接检查βTrCP与Gli3位点的结合与β-catenin位点的结合如何不同。

有趣的是，Sic1来自酿酒酵母已证明包含F-box蛋白Cdc4的多个低亲和力磷酸化依赖性结合位点。精液结构-功能研究表明，这种结构导致高亲和力结合，如通过单个高亲和力位点获得的，但允许通过磷酸化对结合进行更严格的控制(26). 至少在肢芽中，Gli3处理导致截短蛋白的分级水平与顺轴方向的Shh剂量成反比(34)，并且这种空间分级的响应看起来不同于酵母细胞周期期间Sic1降解的严格全控制或无控制。如果像在Sic1中一样，Gli3泛素化和加工需要一个多位点磷酸化阈值，那么它有望在Shh的剂量依赖性调节中发挥许可而非指导作用。或者，不同水平的Gli3磷酸化可能导致不同水平的Gli3加工。在我们的分析中，单个磷酸化位点的突变确实使我们能够观察到Gli3处理的中间水平（图。​（图1C1摄氏度和​和6D），第6天)βTrCP与Gli3直接结合的水平可以通过磷酸化进行更精细的控制，而不是使用过表达的βTrCP进行联合免疫沉淀分析（图。​（图5A）。5A级). 在体内分析此处报道的磷酸化和βTrCP结合位点的相互交织作用，将是理解Hedgehog信号调节Gli3加工的一个重要挑战。

SCF复合物的建模表明，βTrCP与底物的结合导致执行泛素结合的酶Cdc34与βTrCP结合肽并列，并解释了与DSGX相邻的赖氨酸残基_2-4位于8到20个残基N末端的S基序是β-catenin和IκB的泛素化靶点(37). 然而，在Gli3中，没有与βTrCP结合基序相邻的赖氨酸，我们证明位于基序β1 N端至少48个残基的赖氨酸类是SCF^βTrCP处理所需的泛素化目标（图。​（图7）。7). 这一结果重要地加强了我们对SCF的证明^βTrCP-Gli3处理需要介导的泛素化。赖氨酸773、779、784和800与Cdc34的接近性是泛素结合的先决条件，这可能是Gli3结构固有的，或者，可以通过构象变化来实现，这可能对Gli3加工进行额外的调节。有趣的是，与在Gli3ΔNΔC上下文中观察到的情况相反，赖氨酸773、779、784和800的突变对泛素化Gli3的水平没有影响（图。​（图7C）。7摄氏度). 这表明N端和C端结构域包含Cdc34在结合SCF后可获得的替代赖氨酸靶点^βTrCP但这种赖氨酸的泛素化不足以进行加工。因此，特定赖氨酸的泛素化（位于773、779、784和800位）对于介导蛋白酶体的加工而非破坏可能至关重要。

D.T.由MNRT和ARC的博士研究金资助，M.C.由国家计划部（智利）的博士研究基金资助。这项工作得到了INSERM和ARC的支持。

我们感谢贝纳鲁斯实验室对βTrCP表达质粒的研究和讨论。B.Vogelstein、H.Sasaki、D.Bohmann、M.Raymonjean、M.Pap、G.M.Cooper、M.J.Birnbaum和K.Hattori好心地提供了质粒。我们感谢科钦研究所DNA测序设施的F.Letourneur及其同事。