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BMC神经科学。2006; 7: 29.
2006年4月3日在线发布。 数字对象标识：10.1186/1471-2202-7-29
预防性维修识别码：项目经理1488864
PMID：16584562

生酮饮食作为肌萎缩侧索硬化潜在的新型治疗干预

钟钊,1 戴尔·J·兰格,2 安德烈·沃斯蒂亚努克,2 多纳尔·麦格罗根,1 Lap Ho公司,1 杰森·苏,1 纳尔逊·乌马拉,1 Meenakshisundaram Thiyagarajan公司,1 王军（Jun Wang）,1和朱利奥·帕西内蒂通讯作者1,三
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

背景

肌萎缩侧索硬化症（ALS）神经元死亡的原因尚不明确，但线粒体功能障碍可能起重要作用。酮促进线粒体能量生成和膜稳定。

结果

根据已知的人类配方，给SOD1-G93A转基因ALS小鼠喂食生酮饮食（KD）。在治疗组和疾病对照组中测量运动能力、寿命和运动神经元计数。由于线粒体功能障碍在ALS的神经元细胞死亡中起着核心作用，我们还研究了主要酮体D-β-3羟基丁酸酯（DBH）对线粒体ATP生成和神经保护的影响。与对照组相比，KD喂养的动物的血酮水平高出3.5倍以上。与疾病对照组相比，喂食KD的小鼠在25天后失去了50%的基线运动能力。在研究终点，KD动物比疾病对照动物重4.6克；饮食与体重变化的交互作用显著（p=0.047）。在研究终点获得的脊髓切片中，KD喂养动物的运动神经元较多（p=0.030）。DBH阻止鱼藤酮介导的线粒体复合物I抑制，但不阻止复合物II的丙二酸抑制。DBH也抑制SMI-32免疫阳性运动神经元的鱼藤酮神经毒性。

结论

这是首次研究表明，饮食，特别是KD，改变了G93A SOD1转基因ALS小鼠模型的临床和生物学表现的进展。这些影响可能是由于酮体能够促进ATP合成和绕过线粒体呼吸链中复合物I的抑制。

背景

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种成年发病的神经退行性疾病，脊髓和皮层运动神经元死亡，导致全身骨骼肌持续进行性无力和萎缩[1]. 患者通常在症状出现后3-5年内死亡[2]. 神经细胞死亡的原因尚不明确。ALS的发病机制与氧化控制丧失、氧化自由基过度生成、神经丝积聚、兴奋毒性和线粒体膜功能障碍有关[三,4]. 细胞凋亡被认为是细胞死亡的机制[2].

ALS是10%患者的遗传性疾病（家族性ALS，FALS）[1]. 编码Cu/Zn超氧化物歧化酶1（SOD1）的基因突变是第一个与FALS相关的突变[5]. 携带突变人类SOD1转基因的转基因小鼠患有与人类FALS相似的疾病，其特征是肌肉进行性无力，最终导致呼吸肌无力和呼吸衰竭死亡[6]. SOD1基因突变如何导致ALS尚不清楚。然而，FALS综合征并非源于SOD1功能的丧失，而是源于功能的毒性增加[2].

线粒体可能在ALS的发病机制中发挥关键作用，并且可能是突变SOD1蛋白的靶点[7]. 突变的SOD1定位于线粒体结合bcl2，bcl2是细胞主要的抗凋亡蛋白[8,9]. 血小板线粒体复合物I活性降低[10]ALS患者的肌肉和脊髓活检[4,11,12]. 在用阻断复合物I的药物治疗的培养神经元中，添加酮体可恢复复合物I功能[13].

由于酮类能够改变线粒体功能，线粒体在ALS中的神经元细胞死亡中可能发挥关键作用，因此我们在G93A-SOD1转基因ALS小鼠模型中研究了生酮饮食的临床和生物学效应。

结果

生酮饮食对SOD1-G93A小鼠的临床影响

A.酮的产生：与喂食标准实验室食物的动物相比，喂食KD的小鼠血液中循环酮体（丙酮、乙酰乙酸盐和D-3-β羟丁酸盐）的浓度增加了3.5倍以上（1056±197 vs 360±43μM，p=0.012）（图​（图1A）。1安培). 酮体的主要形式是DHB，占血酮的78%以上。与对照组相比，喂食KD的动物血液中DHB的升高幅度大于2.5（806±158 vs.315±46μM，p=0.023）（图​（图1B1磅).

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酮类水平，体重运动功能。（A） SOD1-G93A转基因小鼠血清总酮体（DHB和乙酰乙酸）含量。（数据=平均值±se；标准饮食：n=5，KD:n=6；*-p<0.05）。（B） SOD1-G93A转基因小鼠血清DHB含量。（数据=平均值±se；标准饮食：n=5，KD:n=6；*-p<0.05）。（C） 与标准饮食相比，喂食KD的SOD1-G93A转基因小鼠在85天至136天龄时的失败时间（50%的基线表现）。（数据=平均值±se；标准饮食：n=5，KD：n=6；p=0.027）。（D） KD在治疗开始（第50天）、症状前（第89天）和研究结束时对SOD1-G93A小鼠体重的影响。（数据=平均值±se；标准饮食：n=5，KD:n=6[AV3]；p=0.047）。

B.运动性能测量：采用Rotarod试验确定KD对SOD1-G93A转基因小鼠运动功能丧失的影响。失效时间分析（图​（图1C）1个)研究表明，在整个研究期间，KD喂养的动物比SOD1-G93喂养标准饮食的小鼠保持运动功能的时间更长。与标准饮食喂养组（在第109天失败）相比，最后一只KD喂养的动物在第134天未能达到50%基线表现（90秒）的旋转动物终点（p=0.027）。与喂食标准实验室饮食的SOD1-G93转基因小鼠相比，喂食KD的动物的死亡年龄在统计学上没有显著差异（133±4 vs.131±4天，p=0.914）

C.体重：在研究期间，在三个点测量每只小鼠的体重（图​（图1D）。一维). 研究开始时，标准饮食组的动物平均体重为23.5克，而KD喂养的动物的平均体重为24.6克。在症状前阶段（第89天），受试KD动物的体重超过标准喂食小鼠（分别为25.1克和27.8克/天）。在研究结束时，标准喂食动物的体重为19.9克，而KD喂食组的体重为24.5克。两个治疗组之间的体重差异并不显著，尽管存在明显的趋势（p=0.070）。饮食和时间之间的相互作用具有统计学意义（p=0.047），表明KD动物体重的观察变化模式依赖于饮食。正如预期的那样，减肥的时间效应具有统计学意义（p<0.001）。

生酮饮食可防止运动神经元死亡

为了确定生酮饮食是否能防止伴随ALS临床症状的运动神经元丢失，我们在研究终点统计了年龄和性别匹配的WT和SOD1-G93A小鼠的腰脊髓运动神经元数量（图​（图2A）。2安培). 野生型动物每节脊髓平均有13.594±1.272个运动神经元。在研究期结束时，与喂食标准饲料的SOD1-G93小鼠相比，KD喂食SOD1-G93A小鼠的腹角运动神经元明显更多（9.382±1.125 vs 6.826±0.607；（p=0.03））（图​（图2B）。2B型). 正如预期的那样，无论饮食如何，SOD1-G93小鼠的运动神经元计数均显著低于WT（p<0.01）。

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尼氏染色的腰脊髓运动神经元计数。KD对SOD1-G93A转基因小鼠在研究终点Nissl染色神经元细胞计数的影响。（A） 野生型（WT）（A）、标准饮食-（b）和KD（c）处理的SOD1-G93A小鼠腰椎脊髓腹角典型Nissl染色切片的显微照片。水平钢筋=25μm。（B） WT对照组和标准饮食或KD治疗的SOD1-G93A组大运动神经元的计数（数据=平均值±se；WT:n=5，Tg G93A:n=4，Tg G 93A+KD n=6；##-p=0.003，Tg G-93A vs。

DBH对SOD1-G93A小鼠运动神经元线粒体功能的影响

SOD1突变小鼠线粒体功能障碍降低ATP生成[14]. 原因被怀疑是组成呼吸链的分子复合物异常，尤其是复合物I[15]. 含量最高的酮体DHB通过改善线粒体呼吸和ATP生成纠正线粒体能量生成缺陷[13,16]. 我们对从SOD1-G93A小鼠分离的纯化线粒体的研究表明，添加DHB可在接触底物12分钟内将ATP合成增加10000个相对发光单位（RLU）（图​（图3A）。3A级). 在添加DHB的三分钟内，与疾病对照组相比，ATP的产生率显示出统计学上的显著增加（198±7对125±9 RLU/100 s/mg蛋白质，p＜0.001）（图​（图3B），3B公司)从而证实DHB可促进G93A-SOD1转基因小鼠的ATP生成。

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DHB对线粒体活性的差异影响。（A） 脊髓ATP合成测量的代表性示例表示为相对发光单位（R.L.U.）。（B） 脊髓纯化的SOD1-G93A线粒体的ATP合成速率（数据=平均值±se；重复测量，n=9；**-p<0.001）。（C） DHB对鱼藤酮介导的细胞活性的影响。SOD1-G93A小鼠的原代混合脊髓神经元在有或无DHB（5 mM）的情况下培养，并暴露于线粒体复合物I抑制剂鱼藤酮（数据=平均值±se；Rot:n=4，Rot+DHB:n=4；***-p<0.001，Rot vs.Rot+DHB）。（D） 暴露于线粒体复合物II抑制剂丙二酸盐的SOD1-G93A培养物中缺乏DHB的特异性抑制（数据=平均值±se；Mal:n=4，Mal+DHB:n=4）。

为了确定呼吸链运动神经元培养物中功能失调的特定复合物，将其浸泡在DHB（5 M）中，然后暴露于剂量增加的复合物I抑制剂鱼藤酮中（图​（图3B）。3B公司). 鱼藤酮在浓度低于3nM时对运动神经元的ATP合成没有影响。当鱼藤酮的剂量增加到10 nM时，未经处理的神经元的ATP生成量下降到60%，但仍保持在处理动物ATP生成量的90%（57665±1577 vs.81485±2545 RLU，p<0.001）（图​（图3C）。3C公司). 在任何测试浓度的平行培养物中用复合物II抑制剂丙二酸盐处理后，未发现DHB生成ATP的可检测保护作用（图​（图3D三维).

DHB对G93-SOD1转基因小鼠运动神经元细胞死亡的保护作用

接下来，我们确定是否细胞死亡是由于G93A-SOD1转基因小鼠脊髓分离的运动神经元中复合体I抑制产生的ATP减少所致。鱼藤酮用于脊髓运动神经元导致细胞膜溶解导致细胞死亡的细胞数量呈剂量依赖性增加，这是通过培养基中LDH的量来测量的（图​（图4A）。4A级). DHB有效地阻断鱼藤酮的作用，但不存在丙二酸盐，这表明DHB克服了对复合物I的抑制，从而减少了细胞死亡的发生（图​（图4B4B类).

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DBH对脊髓运动神经元的神经保护作用。（A） DHB对鱼藤酮介导毒性的影响。SOD1-G93A小鼠的原代脊髓神经元在有或无DHB（5 mM）的情况下培养，并暴露于鱼藤酮和细胞毒性，通过培养基中释放的LDH活性测量，以对照组的百分比表示（数据=平均值±se；Rot:n=4，Rot+DHB:n=4；**-p<0.01，Rot vs.Rot+DHB）。（B） 暴露于丙二酸的SOD1-G93A培养物中缺乏DHB的神经保护作用，以对照的百分比表示（数据=平均值±se；Mal:n=4，Mal+DHB:n=4）。（C） 在对照组（顶部）、鱼藤酮（中部）、鱼藤酮和DHB（底部）处理的脊髓培养物中，使用SMI-32抗体对运动神经元进行代表性染色的显微照片。运动神经元SMI32阳性，其特征是细胞体大，树突多。（D） DHB对鱼藤酮所致慢性线粒体毒性的影响。在有或无DHB（5 mM）的情况下培养SOD1-G93A的脊髓神经元，并用鱼藤酮（3 nM）处理（数据=平均值±se；对照组：n=4，鱼藤酮：n=4,Rot+DHB:n=4；#-p=0.041，鱼藤烯酮vs.Rot+DHB；**-p=0.004，鱼藤素vs.对照组）。

为了测试LDH浓度的增加是否与运动神经元的丢失有关，在三种类型的细胞培养物中对SMI-32免疫组织化学标记的运动神经元进行计数：一种来自正常小鼠，两种来自SOD1-G93A转基因小鼠：一种培养基用鱼藤酮处理；另一种是鱼藤酮和DHB（图​（图4C）。4摄氏度). 与DHB/鱼藤酮处理的培养物（5.5±0.3 vs.7.8±0.1，p=0.041）或野生型动物培养物的神经元计数（5.5±0.3vs.9.9±1.1，p=0.004）相比，从SOD1-G93转基因小鼠鱼藤酮治疗的培养物中获得的神经元计数显著降低（图。​（图4D）。4D（四维）). 从鱼藤酮+DHB处理的培养物中获得的神经元计数与从野生型动物培养物中获取的计数没有显著差异（7.8±0.1 vs.9.9±1.1，p=0.056）。因此，DHB在减缓复合物I抑制诱导的细胞死亡速度方面具有潜在作用。

讨论

我们的研究表明，KD上的SOD1 G93A转基因ALS小鼠在该病的临床表现和生物学方面发生了显著变化。在研究结束时，喂食KD饮食的SOD1-G93A转基因小鼠的运动性能得到了保护，同时腰脊髓中的运动神经元也得到了显著保护。我们观察到两组之间的体重变化有很强的趋势，这表明KD喂养的动物在症状前阶段体重增加得更快，而随着疾病的发展，体重减轻得更慢。然而，饮食和治疗之间存在统计上显著的关系，表明KD喂养动物的体重增加取决于其饮食。我们无法进行标准寿命分析（Kaplan-Meier），因为数据未达到正态性和方差的基本方差分析要求。然而，治疗组和疾病控制组在死亡时没有显著差异。这很可能代表了弱化动物减少食物摄入量时饮食效应的丧失，因此体验到的基于饮食的治疗带来的益处更少。

在原代脊髓运动神经元培养中，DBH对鱼藤酮（复合物I）诱导的慢性线粒体抑制具有神经保护作用，但对丙二酸（复合物II）介导的毒性没有保护作用。当DHB用作底物时，这种神经保护作用似乎与分离的脊髓SOD1-G93A线粒体中ATP生成增加有关（方案1，见图​图55).

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方案1：呼吸链和抑制位点的线粒体酶复合物。

我们发现DHB保护来自SOD1-G93A脊髓的运动神经元在体外鱼藤酮介导的细胞死亡。鱼藤酮降低线粒体质子泵和ATP生成，导致自由基生成增加和随后的神经细胞死亡[17]. Kashiwaya等人假设DHB的神经保护作用可能与其恢复线粒体电子传递底物的能力或通过调节线粒体中NAD/NADH和辅酶Q水平降低活性氧（ROS）生成的能力有关[16]. 此外，Tieu等人证明，在帕金森病动物模型中，DHB可以保护多巴胺能神经元免受1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）介导的毒性。他们提出DHB输注通过生成琥珀酸作为氧化底物而不是通过还原ROS来克服MPTP对复合物I的阻断[13]. 与复合物I旁路假说一致，我们发现DHB克服了鱼藤酮对SOD1 G93A脊髓运动神经元的毒性，但无法克服丙二酸对线粒体复合物II的抑制。

我们发现，当DHB用作氧化底物时，会增加从SOD1-G93A大脑和脊髓分离的线粒体中ATP的生成速率。DHB的这种作用机制与Sato等人（1995年）的研究一致，他们发现酮可以增加线粒体和细胞质之间的电势，从而增加细胞溶质ATP的自由能[18]. 在DHB存在的情况下，由于收缩能力的增强和耗氧量的减少，工作心脏的效率至少提高了25%。酮体似乎改变了能量代谢的模式，酮体在线粒体ATP生成中的代谢效率高于葡萄糖或脂肪[18,19].

DHB在ALS模型中的神经保护作用在体外和体内提示酮体可能对ALS和其他神经退行性疾病患者有潜在的治疗益处[19]. 饮食诱导的血酮类升高或DHB升高到高酮类浓度可能通过增加线粒体功能和ATP生成来改善线粒体缺陷。这一推理导致了最近对一小部分帕金森病患者进行的可行性研究，该研究得出结论：尽管不能排除安慰剂的作用，但生酮饮食可以改善静息时的震颤、冻结、平衡、步态、情绪和能量水平[20]. 随着口服酮酯的出现[19]在不久的将来，可能会进行有关使用酮体作为膳食补充剂的ALS临床试验。

结论

本研究提供的实验证据表明，生酮饮食预防性治疗可以通过促进SOD1-G93A ALS小鼠线粒体的能量生成，减缓运动退化并保护运动神经元。酮体的神经保护作用为通过饮食干预治疗ALS提供了一种新途径。

方法

G93A转基因小鼠与饮食条件

雄性SOD1-G93A突变转基因小鼠（库存#002297）从Jackson实验室（ME Bar Harbor）获得，并在我们的转基因小鼠设施中繁殖，以产生SOD1-G93 A小鼠和野生型（WT）对照鼠。在为本研究确定的27只SOD1-G93A转基因ALS小鼠中，选择了11只雄性。由于背景和性别对ALS小鼠模型存活率的影响，仅使用雄性[21]. 在50天大的时候，动物们要么吃生酮饮食（热量成分，脂肪60%，碳水化合物20%，蛋白质20%），要么吃标准的啮齿动物实验室饮食（脂肪10%，碳水化合物70%，蛋白20%）。这两种饮食中每克胆固醇的百分比相等（新泽西州新不伦瑞克研究饮食公司）。老鼠被关在一个12小时的光照、12小时的黑暗循环中，允许随意获取食物。在治疗开始、第89天（症状前）和研究终点对小鼠进行称重。研究终点被定义为满足以下任何一个条件：60秒内没有自主呼吸或运动，对疼痛没有反应；动物在被推倒10秒后无法直立；或后肢完全瘫痪。

小鼠通过颈椎脱位处死。解剖脊髓并快速冷冻，并在-80°C下保存。采集血液，在4°C下凝块和离心15分钟后获取血清。西奈山医学院动物护理机构委员会审查并批准了本研究中使用的所有实验方案。

运动功能评估

如前所述，SOD1-G93A小鼠在加速旋转体上进行了测试（7650 Ugo Basile Biol.Res.App.，Comerio，Italy）[22]. 老鼠被给予5天的练习，以熟悉旋转木马和人类的操作。检查人员对治疗组进行了盲法检查。在老鼠存活85天直至死亡的过程中，测量了老鼠在旋转杆上停留的时间。只有能够连续2天成功维持180秒平衡的动物才被纳入研究，以确保所有动物在发病时运动表现的均一性。（n=10:5 KD；5标准饲料）。测试是在光周期的最后4小时内，在一个有最小刺激（噪音、运动、光线或温度变化）的环境中进行的。

组织学和体视学分析

为了进行体视学分析，通过每只动物（WT对照组；n=5）和喂食KD（n=6）或标准饮食（n=4）的SOD1-G93A小鼠的腰椎（L3至L5）脊髓，切割10个连续冠状切片（12μm厚）350μm。这些部分被安装在带正电荷的玻璃载玻片上（Superfrost Plus、Fisher Scientific），并进行尼塞尔染色。在放大×200倍的光学显微镜下，在腹角内计数大（>25μm）的Nissl染色神经元。这些计数处于同质结构中，使得体视学的原理有效。使用Neurouscina系统在放大×250倍的情况下，从每只小鼠脊髓的六个L3-L5组织切片中，对两个腹角区域的Nissel染色神经元进行计数，大小区分为直径>25μm的类别。所有细胞都是从中央管穿过脊髓的侧线下方的腹角内计数的。对所有标本进行组织切片厚度校正。

血清酮测定

有三个酮体：D-β-3-羟基丁酸（DBH）、丙酮和乙酰乙酸。所有三个身体的浓度代表血液中酮体的总浓度。根据制造商的说明，分别使用Autokit 3-HB和Autokit Total酮体（Wako，Osaka，Japan）测定SOD1-G93A小鼠中酮体的浓度。血清（3μl稀释5倍或10倍）与202.5μl试剂R1在96孔板中孵育5分钟，37°C。然后再添加67.5μl试剂R2 5分钟，并在37°C下培养。使用Dynatech MR5000分光光度计96孔板阅读器（Coulton）在405 nm处用分光光度法测量硫代-NADH生成速率。使用总酮体校准品（Wako）的两倍稀释液，从300μmol/L开始，建立标准曲线。将样品稀释0、3、5或10倍，以符合标准曲线，该标准曲线在6倍稀释液上呈线性。

神经元培养

根据Spalloni等人[16,23]. 简单地说，脊髓培养物是从与SOD1-G93A雄性交配的怀孕WT雌性的E14胚胎中分离出来的。解剖每根脊髓管，从脑膜中取出，在37°C的0.25%胰蛋白酶/EDTA中培养10分钟，然后用火焰抛光的巴斯德吸管轻轻研磨分离。将得到的混合神经元接种在D-MEM/F12中的多聚-D-赖氨酸涂层的8孔室玻片（Nalge Nunc Inc.，NY）上，该玻片补充有10%的胎牛血清（FBS），并在含5%CO的湿化环境中保持在37°C2。电镀后2至3小时，用添加2%B-27、0.5 mM谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素的神经基础培养基替换培养基。

毒性实验

鱼藤酮、丙二酸、叠氮化钠和DHB从密苏里州圣路易斯市Sigma-Aldrich获得。将10天大的神经元培养物暴露于不同浓度的鱼藤酮或丙二酸盐中，加入或不加入5mM DHB 48小时。使用CellTiter-Glo通过ATP生成水平测量细胞活力®发光细胞活性检测试剂盒符合制造商的说明（威斯康星州麦迪逊市Promega Corp）。

使用CytoTox96通过细胞培养液中释放的乳酸脱氢酶（LDH）活性测定细胞毒性®根据制造商说明进行非放射性细胞毒性试验（Promega公司）。

线粒体制剂和ATP测量

根据制造商的说明（Sigma），分别使用线粒体分离试剂盒和5’-三磷酸腺苷（ATP）生物发光检测试剂盒进行线粒体分离和ATP测量。在冰上解剖8周龄WT和Tg SOD1-G93A动物的脊髓，用3ml特氟隆杵快速研磨缓冲液A中的组织，每次10-15次。经过几次旨在富集线粒体部分的离心步骤后，将最终的线粒体颗粒重新悬浮在隔离缓冲液A中（10 mM HEPES、pH7.5、200 mM甘露醇、70 mM蔗糖、1 mM EDTA和1 mg/ml白蛋白）。使用BioRad蛋白质测定试剂盒测定蛋白质含量。对于ATP生成测量，在Fluorotrac 200 96孔板（Nunc）中以100μl总体积制备分析。每个分析都包含缓冲液A（35 mM K-PO4，pH7.5，10 mM醋酸镁，180 mM蔗糖，1 mM EDTA，0.1%BSA，50 mM丙酮酸）和新添加的100μM ADP，100μM P1，P5-二（腺苷）五磷酸、150μg/ml荧光素和1.2μg/ml萤光素酶，在存在或不存在5 mM DHB和各种抑制剂的情况下。通过添加10μl体积的线粒体制剂（含30μg总分离线粒体）开始分析。Fusion™Universal Microplate Analyzer（马萨诸塞州Perkin Elmer）每分钟记录一次荧光素酶发光，持续10分钟。

免疫细胞化学

10天龄的神经元培养物用药物处理24小时，然后用新鲜的无药物培养基培养48小时，加或不加5mM DHB。细胞用4%多聚甲醛固定，并用抗NSE和抗SMI32双重染色进行免疫细胞化学。总神经元为NSE阳性神经元，运动神经元为SMI32阳性神经元。SMI32阳性神经元在显微镜下以×250的放大倍数在至少5个随机选择的区域进行计数。主考人对治疗一无所知。

统计分析

使用SigmaStat（3.0版，SPSS公司，伊利诺伊州芝加哥）进行统计分析。采用独立测量t检验比较对照组和生酮饮食组的DHB和总酮体的终点血清含量。采用重复测量t检验比较添加和不添加DHB培养的神经元培养物获得的ATP合成速率数据。运动功能恶化（旋转试验）通过Kaplan-Meier生存分析（Mantel-Cox对数秩检验）进行评估，“失败”定义为动物无法达到其至少50%的基线运动性能。之所以选择这个终点，是因为它是一个与进入标准明显相关的指标，是力量必然下降的中线，并且不受观察者偏见和动物非常虚弱时使用的动物适应技能的影响（例如，握住旋转杆而不走路）。由于数据未通过正态性和等方差检验，因此无法进行双向重复测量方差分析，因此选择了非参数失效时间分析。生酮饮食对寿命的影响也通过Kaplan-Meier生存分析（Mantel-Cox对数秩检验）进行评估，“失败”定义为动物死亡。通过Huynh-Feldt校正的双向重复测量方差分析来分析动物的体重数据。运动神经元计数数据和免疫化学评价的SMI32阳性神经元计数数据用单因素方差分析进行分析。采用双向方差分析法分析鱼藤酮和丙二酸盐存在时ATP和LHD水平的数据。显著时，采用Student-Newman-Keuls多重比较测试进行方差分析。由于与Bonferroni测试相比，纽曼-凯尔斯测试的灵敏度更高，因此选择学生测试进行事后多重比较。在所有测试中，概率值小于0.05的结果被认为具有统计学意义。除非另有说明，否则呈现的数据显示为平均值±se。

缩写

肌萎缩侧索硬化

KD：生酮饮食

胸径：D-β-3-羟基丁酸

SOD：铜/锌超氧化物歧化酶

RLU：相对发光单位

LDH：乳酸脱氢酶

ROS：活性氧物种

竞争性利益

提交人声明他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

ZZ和DM：参与项目构思和实验设计、数据采集、分析和解释，还参与手稿的起草和修订。

DJL：参与项目构思和设计、数据解释和手稿修订。

AV：统计分析和手稿修订

LH：有助于项目构思和实验设计、动物行为分析。

JS和NH：为动物护理和行为分析做出贡献。

JW：进行了酮体测量。

TM：进行免疫细胞化学研究。

GMP：参与项目构思和实验设计、数据解释、手稿编制和最终审批。

致谢

在MDA和退伍军人事务部的支持下，ALS研究资助GMP。

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文章来自BMC神经科学由以下人员提供BMC公司