恶性和非恶性前列腺组织中线粒体乌头酶和柠檬酸盐代谢

摘要

背景

在前列腺癌（PCa）中，恶性肿瘤主要发生于前列腺周围区的腺上皮。区别正常前列腺组织和恶性前列腺组织的一个主要且持久的特征是前者的柠檬酸含量极高，而后者的柠檬酸浓度较低[有关综述，请参阅[1-4]]. 正常分泌上皮细胞具有产生和分泌超高水平柠檬酸的特殊功能。为了实现这一能力，这些“柠檬酸生成”细胞具有一种独特的限制性间乌头酸酶活性，可削弱柠檬酸氧化。在恶性细胞中，间乌头酸酶活性不受限制，柠檬酸氧化也不受影响。正常柠檬酸生成细胞向柠檬酸氧化恶性细胞的代谢转化是前列腺恶性肿瘤发展过程中的重要事件。此外，良性前列腺增生（BPH）涉及柠檬酸分泌腺的增殖。这些是一致的关系，已被人类前列腺原位磁共振波谱成像所证实和建立；这是目前识别和定位前列腺恶性位点最可靠的方法[4-6]]. 因此，有必要建立正常分泌上皮细胞柠檬酸氧化受损的机制，以及与恶性细胞代谢转化相关的柠檬酸生成的改变。

在正常哺乳动物细胞中间代谢中，间乌头酶通常过量存在，不是限速或调节酶，并催化平衡反应：

~88柠檬酸盐←→4顺-锥形盐←～8异柠檬酸盐.

这导致大多数哺乳动物组织的特征柠檬酸盐/异柠檬酸盐比率约为10/1，与柠檬酸盐浓度无关。相反，柠檬酸盐分泌的正常前列腺和增生腺体显示柠檬酸盐/异柠檬酸盐比率约为30/1；这表明m-乌头糖酶活性有限[1,7]. 柠檬酸积累前列腺细胞的柠檬酸氧化受损而非异柠檬酸氧化证实了这一点[8,9]. 间乌头酸酶活性有限可能是酶受到抑制和/或酶水平降低的结果。先前的研究证实，正常前列腺细胞中锌含量高的积累[三,10,11]，导致m-乌头酸酶活性受到抑制，其平衡向柠檬酸转移[12,13]. 在前列腺癌中，恶性前列腺细胞不积累锌，这导致期望间乌头酶活性在这些细胞中不受抑制，柠檬酸盐氧化发生。在最近一项涉及前列腺癌组织切片测量的研究中（14），我们证明ZIP1锌转运蛋白下调，并且腺癌腺体腺上皮中的锌水平耗尽。然而，另一种或额外的考虑是，在柠檬酸盐诱导的正常前列腺细胞中，间乌头酸酶水平可能较低，和/或该酶可能在恶性细胞中过度表达。因此，测定人前列腺组织样品中间乌头酸酶的水平并比较其在恶性和非恶性腺体中的水平是很重要的。此外，本研究使用与我们之前报告中相同的样本进行；从而可以将ZIP1水平变化的差异与间乌头碱水平的当前结果进行对比。本报告首次鉴定了恶性和非恶性前列腺腺上皮中的间乌头酸酶。

结果

Costello等人[15]据报道，本研究中使用的m-乌头酶抗体对线粒体亚型具有特异性，并且与细胞溶质（c-）乌头酶无反应。这一结论基于分离线粒体制剂提取物的阳性免疫反应（Western blots）和细胞溶质提取物制剂的阴性反应。然而，对于目前的免疫组织化学研究，必须确定可以检测到线粒体内m乌头酸酶，并且抗体反应仅限于线粒体。为此，对LNCaP细胞进行免疫荧光分析，并结合线粒体染色和Mitotracker。图​图11结果表明，m-乌头酶免疫反应与线粒体室相关并具有特异性，且抗体对m-乌头酸酶同工酶具有选择性。

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图1

间乌头糖的亚细胞定位。A-D公司免疫荧光检测。用Mitotracker探针检测LNCaP前列腺细胞系，然后用乌头糖-2抗体固定免疫荧光，并用激光扫描共聚焦显微镜观察。A类.细胞核内无染色（DAPI）。B类细胞质中线粒体呈红色点状染色（Mitotracker）。C类细胞质中m-乌头糖的绿色荧光（FITC）。D类红色和绿色荧光合并显示间乌头酶在线粒体中的共定位。E类间乌头糖的免疫细胞化学检测。注意细胞质中的深棕色点状线粒体染色；和清晰的细胞核。

然后，我们分析了人类前列腺组织切片中恶性和非恶性病灶中的m-乌头糖免疫反应。图​图22介绍了前列腺增生、恶性、正常和PIN病灶中m-乌头酸酶的代表性免疫组织化学检测。结果表明，无论病理状态如何，间乌头酸酶都存在于所有腺体的腺上皮中。此外，间质组织中m-乌头糖的细胞水平始终低于腺上皮。最重要的是，间乌头酶的免疫阳性检测在恶性腺体和正常腺上皮中很明显。

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图2

人类前列腺组织切片的代表性m-乌头酸酶免疫组化。左侧面板.A类。阴性对照。B类显示邻近前列腺增生和恶性病灶的区域。C类现场显示邻近PIN和恶性腺体。右侧面板.A-D公司H&E染色；a-d公司免疫组织化学染色。注意所有病例的腺上皮均呈强棕色阳性染色；对比基质染色较少。

表​表11本文总结了22例前列腺癌组织切片中m顺乌头酸酶反应的免疫组化评分。该表显示了用于定量间乌头酶水平的两个参数：腺体内表现出间乌头酶免疫阳性的细胞百分比；以及细胞内m乌头糖阳性点（线粒体）所代表的m乌头酶的细胞水平。在本研究中，我们将分析局限于同一组织切片中腺体中间乌头糖的比较。其中一个原因是为了消除或至少最小化抗体扩散到细胞和线粒体以产生免疫反应所产生的任何潜在差异。因此，在同一组织切片的不同腺体中观察到的免疫反应水平的任何比较性差异都是由于间乌头糖水平的比较性差异所致。

从表中可以明显看出​表11间乌头酶免疫反应性对于前列腺增生腺上皮和腺癌腺基本上是相同的。前列腺增生腺体像正常的外周带腺体一样是柠檬酸分泌腺体；而腺癌腺体是柠檬酸氧化腺体。此外，肿瘤分级与m-乌头糖免疫反应性之间没有相关性。这与恶性肿瘤细胞中柠檬酸盐的减少在恶性肿瘤的早期发生并持续到恶性肿瘤的进展这一事实相一致[4-6]. 尽管含有正常腺体和PIN（许多人认为是恶性肿瘤的前兆阶段）的组织样本的病例数不足以进行统计分析，但这些腺体的m-乌头糖评分彼此相似，与前列腺增生和腺癌相似。这些结果表明，间乌头酸酶水平的改变（即间乌头酸酶表达/生物合成的改变）与恶性细胞与非恶性细胞中柠檬酸盐氧化或生成的改变无关。这与我们早期的研究形成了对比[14]ZIP1转运体水平在本报告中使用的相同组织样品切片中的变化。为了进行比较，表​表11显示了早期的结果。在恶性腺体与非恶性腺体中ZIP1转运体水平显著下调的同一腺体中，间乌头酸酶水平无变化。此外，伴随ZIP1下调的是细胞锌水平的相应降低[14]. 因此，间乌头酸酶水平没有明显变化不是由于某些人为效应。

为了进一步证实这些结果，我们测定了间乌头酸酶在LNCaP、DU-145和PC-3恶性前列腺细胞系中的表达，以及锌处理对恶性前列腺细胞株中间乌头酸酶水平的影响。结果（图​（图3）三)表明m-乌头糖在所有恶性细胞系中均有表达。值得注意的是，未经处理的LNCaP细胞中间乌头酸酶的水平高于PC-3细胞，尽管与PC-3细胞的高柠檬酸氧化相比，LNCaP细胞的柠檬酸氧化可以忽略不计[16,17]. 这是由于LNCaP细胞中锌的高积累抑制了m-乌头糖活性[16]. 细胞暴露于锌对间乌头糖水平没有影响（图​（图3）。三). 然而，所采用的条件会导致细胞内锌（18，19）的积累，从而抑制间乌头酶活性和柠檬酸氧化。因此，这些研究首次确定，正是锌对间乌头酸酶活性的抑制水平的积累，而不是限制间乌头酸酶的水平，阻止了前列腺细胞中的柠檬酸氧化。

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图3

人前列腺癌细胞株中m-乌头酸酶水平的Western blot分析。将细胞暴露于添加15 uM锌的培养基和未添加锌的培养液中24小时。

讨论

在典型的哺乳动物细胞代谢中，柠檬酸盐是通过克雷布斯循环进行氧化以及随后通过耦合磷酸化产生ATP的必要中间产物。柠檬酸必须通过间乌头酸酶的作用转化为异柠檬酸，作为其通过克雷布斯循环氧化的入门步骤。在哺乳动物细胞的中间能量代谢中，间乌头酸酶不是一种限制性反应，它基本上不会截断克雷布斯循环，这一点很重要。因此，构成性间乌头酸酶活性在哺乳动物细胞中通常过量，这确保了柠檬酸盐到异柠檬酸盐的足够流量，以便进行如下氧化：

然而，在正常前列腺上皮细胞中，柠檬酸盐主要是中间代谢的最终产物，而不像大多数其他细胞那样是可利用的中间产物。众所周知，柠檬酸产生的前列腺细胞及其线粒体容易氧化异柠檬酸盐，但不会氧化柠檬酸盐[7-9,20]. 这些集体观察结果表明，柠檬酸盐诱导前列腺细胞中柠檬酸盐的积累主要是由于间乌头酸酶活性有限（有关其他支持证据，请参阅[1-4,21]. 因此，前列腺细胞中间乌头酸酶的组成水平可能很低，这可能是间乌头酸酶活性有限的一个因素。然而，对大鼠前列腺细胞、猪前列腺细胞和人前列腺细胞系的几项研究一致表明，与典型的柠檬酸氧化细胞相比，柠檬酸诱导细胞中间乌头酸酶的表达和水平并不低[15,22-24]. 虽然在动物研究和细胞培养研究中已经建立了这种前列腺间附子酶的关系，但人类前列腺组织中间附子酶的水平从未确定。本研究表明，间乌头酸酶在前列腺增生腺上皮和正常外周带腺上皮（均为柠檬酸分泌腺）以及腺癌腺体（柠檬酸氧化腺）和PIN（推测为早期恶性阶段）中的组成水平基本相同。

与我们最近报道的ZIP1锌摄取转运体的表达和细胞锌水平的变化相比，间乌头酸酶的表达没有改变[14]. 通过消除间乌头酸酶水平改变的参与，可以得出结论，间乌头酸酶的速率限制活性是由于对酶的抑制。众所周知，正常外周带腺体和前列腺增生腺体积累了极高的锌水平，这与其产生和积累极高柠檬酸水平的独特能力有关；在前列腺癌中，恶性腺体的锌水平和柠檬酸水平显著下降[10,11]. 这些关系与锌在抑制间乌头酶活性和柠檬酸氧化中的既定作用一致[12,13]，这允许柠檬酸盐净产生的独特的外周区腺功能（如在其他动物的前列腺中）。在前列腺癌中，恶性细胞失去了积累锌的能力，从而消除了对间乌头酶活性的抑制；从而增加柠檬酸的氧化，降低细胞内柠檬酸的水平。

结论

本研究表明，与柠檬酸氧化的恶性细胞相比，非恶性柠檬酸诱导的正常和前列腺增生腺上皮细胞中存在类似水平的间乌头酸酶。因此，柠檬酸盐诱导的上皮细胞的限制性间乌头酸酶活性并不是酶水平不足的结果（反应1）；柠檬酸氧化细胞间乌头酸酶活性的增加并不是酶水平升高的结果（反应2），如下所示：

这些结果与以前的报告一致，确立了调节正常人前列腺腺上皮细胞中间乌头糖和柠檬酸氧化以及恶性细胞中代谢转化的机制。锌水平升高对间乌头酸酶活性的抑制作用是导致正常和BPH柠檬酸分泌前列腺细胞柠檬酸氧化受损的原因（反应1）。恶性细胞积累锌的能力丧失，消除了对现有间乌头糖的抑制，从而发生柠檬酸氧化（反应2）。这一与代谢转化为柠檬酸盐氧化相关的机制的阐明为前列腺癌细胞恶性过程的表现提供了必要的生物能量和合成需求。因此，对前列腺癌发病机制和进展的遗传/代谢关系的重要见解正在形成，这将为前列腺癌的检测和治疗提供新的方法。

方法

作者的贡献

KS在罗斯韦尔公园癌症研究所指导这项研究。MD对前列腺癌切片进行组织病理学和免疫组织化学分析；恶性前列腺LNCaP细胞的免疫荧光研究。KS和MD提供了这些分析的数据。

RBF和LCC构思了这项研究，开发并提供了间乌头糖抗体；在马里兰大学进行了恶性细胞系研究。所有作者都参与了手稿的写作；并阅读并批准了最终手稿

致谢

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