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公共科学图书馆-医学。2006年7月；3（7）：e237。
2006年7月4日在线发布。 数字对象标识：10.1371/日志.pmed.0030237
预防性维修识别码：项目经理1483912
PMID：16796401

抗SARS冠状病毒人单克隆抗体组合的协同作用及逃逸突变体的覆盖率

Jan ter Meulen公司,#1,* 爱德华·范登·布林克,#1 利奥·L·M·潘,2 威尔弗雷德·马里森,1 辛西娅·S·W·梁,2 弗里克·考克斯,1 钟耀祥,2 阿扬·Q·贝克,1 约翰内斯·博加兹,1 埃尔斯·范·德文特,1 沃尔夫冈猎犬,三 汉斯·威廉·多尔,三 文森特·周,4 约翰·德克鲁夫,1 约瑟夫·S·M·佩里斯,2和古德斯密特1
丹尼斯·R·伯顿，学术编辑
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

背景

实验动物数据表明，用人单克隆抗体（mAbs）预防严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）感染是可行的。为了在人类中进行有效的免疫预防，需要广泛覆盖不同的严重急性呼吸系统综合征冠状病毒株，并控制潜在的中和逃逸变异株。病毒中和、非竞争单克隆抗体的组合可能具有这些特性。

方法和发现

人类单克隆抗体CR3014已被证明可完全预防感染雪貂的肺部病理学并消除SARS-CoV的咽脱落。我们在体外通过CR3014产生了逃逸中和的SARS-CoV变体，这些变体在逃逸病毒的糖蛋白尖峰（S）中都有一个P462L突变。体外实验证实，CR3014与携带该突变的重组S片段（氨基酸残基318–510）的结合被消除。因此，我们筛选了一个从恢复期SARS患者血液中提取的抗体噬菌体库，以获得与CR3014互补的抗体。一种新的单克隆抗体，CR3022，被鉴定为中和CR3014逃逸病毒，与CR3014不竞争结合重组S1片段，并与来自果子狸SARS-CoV-like株SZ3的S1片段结合。CR3022无法生成转义变体。两种单克隆抗体的混合物通过识别受体结合域上的不同表位，以协同方式中和SARS-CoV。在100%中和时，CR3014和CR3022的剂量减少指数分别为4.5和20.5。由于亚中和抗体浓度增强SARS-CoV感染是值得关注的，我们在这里表明，抗SARS-CoV抗体不会将SARS-Co病毒对人类原代巨噬细胞的流产感染转化为生产性感染。

结论

两种非竞争性人类单克隆抗体CR3014和CR3022的结合可能控制免疫逃逸并扩大保护范围。同时，CR3014和CR3022之间的协同作用可能使被动免疫预防SARS-CoV感染的总抗体剂量更低。

编辑摘要

背景。

2002年末，中国广东省出现了严重急性呼吸综合征（SARS）。2003年2月，一名来自该省的受感染医生将这种新的病毒威胁带到了香港。在这里，住在同一家酒店的人感染了这种疾病，并把它带到了其他国家。SARS正在移动，与国际旅行者搭乘电梯。由于SARS-SARS-CoV病毒是通过密切的人与人接触传播的，导致10%的感染者死亡，因此卫生专家担心会发生全球性疫情。世界卫生组织发布全球警报，警告人们不要前往受影响地区进行不必要的旅行，公共卫生官员隔离患者及其密切接触者，从而避免了这一情况。到2003年7月，第一次SARS疫情结束。8098人感染；774人死亡。自那时以来，当地控制了零星的SARS病例。

为什么要进行这项研究？

SARS的第一次流行是由一种动物病毒引起的，这种病毒适应了人与人之间的传播。没有理由不重复这个过程。如果是这样的话，严格的检疫措施可以再次预防全球疫情，但要付出相当大的经济代价。现在需要的是一种方法来防止SARS在接触过SARS-CoV的健康人群中发展，并对患者进行治疗，使他们的传染性降低，并能够对抗病毒。在这项研究中，研究人员一直在研究“被动免疫”作为限制SARS流行的一种方法。在被动免疫中，通过注射抗体（识别细菌和病毒等外来生物上的特定分子（称为抗原）的蛋白质）来实现对疾病的短期保护，并防止这些生物致病。被动免疫的抗体可以从SARS患者的血液中分离出来，也可以在实验室中作为所谓的“人类单克隆抗体”制造。其中一种人类单克隆抗体-CR3014之前已经被制造出来，并证明可以防止SARS-CoV感染雪貂的肺损伤，并阻止感染动物感染其他动物。但对于有效预防人类疾病来说，一种单克隆抗体可能是不够的。有些SARS-CoV毒株CR3014无法识别，因此无法对抗。此外，当病毒在低抗体浓度下生长时，可以改变CR3014识别的抗原，产生所谓的逃逸变异体；如果发生这种情况，CR3014就不能再阻止这些逃逸变体杀死人类细胞。

研究人员做了什么并发现了什么？

研究人员测试了两种单克隆抗体的组合控制SARS-CoV杀伤人类细胞的效果。首先，他们表明，CR3014逃逸变异体在病毒表面与人类细胞相互作用的部分都有相同的微小变化。CR3014阻断了母株SARS-CoV中的这种相互作用，但在逃逸变异体中没有。然后，他们制造了一种新的单克隆抗体-CR3022，该抗体可防止母SARS-CoV染色和CR3014逃逸病毒杀死人类细胞。这两种抗体与病毒表面的相邻部分结合，并且两者可以同时结合。CR3022也与CR3014不结合的SARS-CoV菌株的表面结合。当他们尝试时，研究人员无法产生CR3022无法结合的任何病毒逃逸变体。最后，两种抗体共同抑制SARS-CoV对人类细胞的杀伤作用的效果超过了各自作用的总和。

这些发现意味着什么？

两种（或多种）识别SARS-CoV表面不同部分并与人类细胞相互作用的人类单克隆抗体的组合可能是一种很好的被动免疫方法。它可以最大限度地降低逃逸变异体产生的可能性，扩大提供保护的病毒株的范围，并减少有效保护所需的抗体量。在将这种方法应用于人体之前，必须在动物身上进行测试。在培养皿中对人体细胞进行的实验结果并不总是在整个动物或人身上重复。如果这种方法通过进一步的测试，那么希望对SARS患者及其密切接触者进行被动免疫接种，可以像采取大规模隔离措施一样，降低感染者的疾病严重程度，减少病毒传播

其他信息。

请通过本摘要的在线版本访问这些网站，网址为http://dx.doi.org/10.1371/journal.pmed.0030237.

•Medline Plus页面非典

•美国疾病控制和预防中心信息非典

•美国国家过敏和传染病研究所关于SARS研究

•维基百科页面非典和单克隆抗体（注：维基百科是一个免费的在线百科全书，任何人都可以编辑）

两种与病毒糖蛋白刺不同部位结合的人单克隆抗体在病毒中和中显示协同作用，并在体外抑制耐药病毒的出现。

介绍

严重急性呼吸综合征（SARS）是由一种新型冠状病毒（SARS-CoV）引起的，该病毒于2003年和2004年从中国南方的广东省传播到亚洲、欧洲和北美的32个国家，导致8000多例病例和774人死亡[1,2]. 2003年底，通过国际协调的公共卫生措施，包括早期隔离SARS患者和隔离接触者，主要疫情得到了遏制，给受影响国家造成了巨大的经济损失[三–5]. 2003年和2004年，中国和其他亚洲国家再次发生了一些孤立的SARS病例；其中一些病例与实验室或未知接触有关，但另一些病例是社区获得性的，与广东省的现场游戏动物餐厅交易有关[6,7]. 同期在调查的棕榈果子狸中发现了与患者分离物几乎相同的SARS-CoV样病毒[7]. 对2002年至2004年收集的大约100株SARS-CoV人类和果子狸分离物的系统发育分析表明，SARS是一种人畜共患疾病，正在棕榈果子狸和人类宿主中进化[7–9]. 此外，据推测，SARS流行前几年，广东省野生动物饲养者中反复出现SARS-CoV-like冠状病毒的无症状感染[9]. 最近，蝙蝠被确定为该病毒的重要自然宿主[10]. 因此，在中国南方大规模扑杀果子狸不太可能足以防止SARS-CoV或SARS-CoV-like病毒进一步向人群扩散。

在寻找SARS疫苗的过程中，通过免疫全灭活病毒或表达SARS-CoV糖蛋白尖峰（S）的重组疫苗构建物，在实验动物中成功地培养了中和抗体[11–13]. 相应地，对SARS患者免疫反应的研究表明，中和抗体的出现与血清、尿液、粪便和鼻咽分泌物中病毒滴度的降低相一致；此外，还报道了恢复期血浆对SARS患者的有益作用[14–16]. 在被动转移实验中，通过实验性疫苗接种或单克隆抗体（mAb）技术产生的针对严重急性呼吸系统综合征冠状病毒的中和抗体已被反复证明可以通过减少病毒复制来保护小鼠免受感染[11,17–20]. 此外，噬菌体展示产生的人单克隆抗体CR3014完全阻止了SARS-CoV感染雪貂模型的肺部病理学，并消除了病毒在咽分泌物中的脱落[21]. CR3014可以阻断S蛋白S1亚单位与其细胞受体ACE2的相互作用[22].

由于使用多克隆血清的被动免疫已被报道可以遏制甲型肝炎病毒的爆发和预防水痘带状疱疹病毒的感染，单克隆抗体预防可能是控制SARS爆发的有效手段[23,24]. 为此，重要的是，单克隆抗体产品能够提供足够的广度保护，以对抗SARS-CoV的所有相关毒株，并防止在患者中选择中和逃逸变异体。因此，在本研究中，我们解决了这两个问题，并展示了CR3014与从恢复期患者分离出的新型SARS-CoV中和人单克隆抗体的结合特征。由于冠状病毒家族（猫传染性腹膜炎病毒）的一个成员在巨噬细胞中观察到病毒复制的抗体依赖性增强，我们还研究了SARS-CoV是否出现类似现象[25]. 据报道，SARS-CoV感染原代人巨噬细胞会导致流产感染，但不会产生感染性病毒后代[26]. 因此，我们研究了在存在CR3014系列稀释液或恢复期SARS患者血清的情况下，病毒感染是否会导致生产性病毒感染。

方法

人单克隆抗体

从半合成单链可变抗体片段（scFv）噬菌体展示文库中分离出单抗CR3014，表达为人IgG1分子，并按照前面所述进行纯化[22,27]. 从新加坡SARS恢复期患者的淋巴细胞构建免疫单链抗体噬菌体展示库[28]. 从该文库中，选择CR3022单链抗体与紫外线激活的SARS-CoV结合，基本上如所述[22]. 如所述制备SARS-CoV（法兰克福1株[FM1]），并紫外线照射15分钟（UVB辐射，280-350 nm；λ最大值，306 nm）。将CR3022单链抗体转化为人IgG1格式，并按所述进行表达和纯化。抗抗体CRJA作为阴性对照。

病毒中和试验和抗体效价的测定

涉及SARS-CoV病毒的研究是在生物安全3级控制下进行的。SARS-CoV株HKU-39849，2×10三TCID公司50/将100μl中的ml与等量连续稀释的单克隆抗体在维持培养基（MM，MEM补充1%v/v FCS）中混合，并在37°C下培养1h。随后，将混合物一式八份接种到含有80%的恒河猴胎肾细胞融合培养物的96周培养板上（FRhK-4；美国弗吉尼亚州马纳萨斯美国型培养物收集中心；#CRL-1688）。FRhK-4细胞在37℃培养，3-4天后观察CPE的发展。根据Spearman-Karber公式，通过两倍稀释系列计算50%和100%中和所需的单抗浓度。为了定量比较CR3014/CR3022组合的中和效力与单克隆抗体的个别效力，将它们以等摩尔比混合，并测定一系列稀释混合物的100%和50%中和效力。如前所述，组合指数（CI）和剂量减少指数（DRI）的概念用于量化协同效应[29,30].

中和逃逸变异体的产生和表征

从10开始的系列稀释−1到10−8将SARS-CoV株HKU-39849在恒定量的CR3014（20μg/ml）或CR3022（60μg/ml2添加到含有FRhK-4细胞的微孔之前。将病毒抗体混合物与细胞在37°C和5%CO下孵育1小时2然后去除病毒，用培养基清洗细胞两次。最后，将细胞在上述浓度的单克隆抗体存在于0.5 ml培养基中培养2 d。用最高病毒稀释度培养的细胞上清液（显示CPE含有潜在逃逸病毒）收集并保存在4°C下，直至再次使用。将病毒样本冻融一次，在培养基中制备系列稀释液并添加到含有FRhK-4细胞的微孔中，稀释液在37°C和5%CO下培养1h2在单克隆抗体存在下。然后用上述浓度的含有琼脂糖的单克隆抗体覆盖孔，并在37°C和5%CO下孵育3-5天2用巴斯德移液管采集单个逃逸病毒斑块并冻融一次，逃逸病毒在FRhK-4细胞上扩增。为了确定每种逃逸病毒的SARS-CoV尖峰蛋白的可能突变，测定了SARS-CoV-S开放阅读框（ORF）的核苷酸序列。分离逃逸病毒和野生型严重急性呼吸系统综合征冠状病毒的病毒RNA，并通过标准RT-PCR转化为cDNA。随后，该cDNA用于SARS-CoV S ORF的核苷酸序列测定，以确定突变。其次，测定每种逃逸病毒的中和指数。因此，每个逃逸病毒和野生型SARS-CoV（100 TCID50)在37°C和5%CO下培养1小时2在加入FRhK-4细胞之前，使用上述浓度的单克隆抗体。在37°C和5%CO的条件下，允许病毒附着在细胞上1小时2然后取出接种物，用培养基冲洗细胞两次，然后用含有单克隆抗体的培养基补充。在37°C和5%CO下孵育2天后2采集培养基，TCID50/测定每种病毒的ml。中和指数通过减去感染性病毒颗粒的数量（以对数TCID表示50/ml）感染病毒的FRhK-4细胞培养物中产生的感染性病毒颗粒数量（对数TCID50/ml）在仅感染病毒的FRhK-4细胞培养物中产生。低于2.5的指数被认为是逃跑的证据。

重组SARS-CoV糖蛋白尖峰片段

编码人SARS-CoV毒株FM1、GZ02、Sin3408、上海LY、GZ-C、Sino1-11、BJ302克隆2、GD03T0013、GD01和棕榈果子狸衍生毒株SZ3的318–510残基的重组穗（S）片段的质粒的产生(AY304486型)以及重组蛋白的表达和纯化[22].

利用ELISA进行表位定位

使用包含氨基酸318–510（S318–510）的重组表达S片段与所述单克隆抗体进行直接ELISA[22]. 竞争ELISA检测如下。在存在或不存在竞争性IgG的情况下，用非饱和量的生物素化IgG孵育法兰克福1株的抗霉素捕获S318-510片段。用链霉亲和素结合-HRP（BD Pharmingen，San Diego，California，United States）检测结合生物素化IgG。或者，S318–510由CR3014或CR3022捕获，使用生物素化的CR3014和CR3022检测，并如上所述进行开发。

BIA岩芯分析

在25°C下对BIAcore3000（Biacore AB，乌普萨拉，瑞典）进行了表面等离子共振分析。CM5传感器芯片和运行缓冲液HBS-EP来自Biacore AB。使用胺偶联程序将重组S318-510固定在CM5芯片上，产生约1000个共振单位的响应水平。进行动力学分析以确定关联速率常数(k个 一)，离解速率常数(k个 d日)和亲和力(K（K） 天)单克隆抗体。因此，在HBS-EP中使用两倍稀释液制备0.4–250 nM IgG浓度系列。以30μl/min的流速分两次注入样品（注入时间为2 min；解离时间为5 min）。用5μl脉冲5mM NaOH使传感器芯片表面再生。使用Biacore评估软件（BIAevaluation，3.2版）拟合所有注入浓度的关联和解离曲线。

SARS-CoV在人原代巨噬细胞中复制的免疫增强试验

原代人单核细胞/巨噬细胞的制备及其对严重急性呼吸系统综合征冠状病毒的感染如前所述[26]. 为了研究亚中和剂量的抗SARS抗体对巨噬细胞病毒感染的影响，将300μl连续稀释的单克隆抗体在MM培养基中、SARS-CoV暴露个体的恢复期血清或健康个体的血清与300μl SARS-CoV混合。MM培养基与SARS-CoV混合作为病毒对照。将病毒/mAb混合物和病毒/血清混合物在37°C下培养1小时。然后，将250μl混合物添加到含有巨噬细胞的重复微孔中。在37°C下吸附病毒1h后，取出病毒接种物，用巨噬细胞SFM培养基清洗感染细胞，并在补充有0.6μg/ml青霉素和60μg/ml链霉素的巨噬细胞SFM介质中培养。在感染后第0天、第1天、第2天、第3天、第5天和第7天收集培养上清液样本，并将其储存在−70°C下进行病毒滴定实验。对SARS-CoV进行滴定，TCID50基本上如所述确定。根据制造商的说明，在感染后6小时和24小时，使用RNeasy Mini试剂盒（美国加利福尼亚州巴伦西亚齐根市）从感染的巨噬细胞中分离出RNA。通过实时定量RT-PCR对阳性和阴性链病毒RNA进行定量ORF1b型基因，如前所述[31]. SARS-CoV RNA水平标准化为β-肌动蛋白信使核糖核酸。

结果

SARS-CoV的所有CR3014中和逃逸变异体在尖峰糖蛋白中显示P462L突变

野生型SARS-CoV和一种带有CR3014和CR3022的CR3014中和逃逸病毒的完全中和曲线如所示图1。所有五种中和逃逸变体对CR3014中和完全不起作用。从两种不同的病毒培养物中分离出的这些变异体的完整棘突基因的序列测定(n个=5）显示，所有基因都在氨基酸462位（脯氨酸到亮氨酸，P462L）携带单点突变，从而消除了CR3014与显示该突变的重组表达受体结合域（RBD）片段（S318–510）的结合(图2). 迄今为止，在人类患者SARS-CoV分离株和果子狸体内发现的SARS-CoV-like冠状病毒中均未观察到这种突变。在两个独立的实验中，SARS-CoV在高达60μg/ml CR3022的情况下反复传代并没有导致产生中和逃逸变异体（未公布的数据）。

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野生型SARS-CoV和CR3014中和逃逸变异体（E6）与单克隆抗体CR3014和CR3022单独或联合中和

100 TCID的中和50每种病毒共检测8次。数据也显示在表1.

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ELISA分析单克隆抗体CR3014和CR3022与重组野生型和P462L取代S318-510片段的结合

条形代表平均值±标准偏差。

人单抗CR3022通过与尖峰糖蛋白RBD非竞争性结合中和SARS-CoV的CR3014逃逸变异体

从新加坡SARS恢复期患者淋巴细胞中分离的RNA构建了抗体噬菌体展示库。分离出的抗体CR3022可在23.5μg/ml的浓度下完全中和SARS-CoV株HKU-39849和CR3014逃逸变异体(表1). ELISA显示CR022与CR3014非竞争性地结合到野生型SARS-CoV（Frankfurt 1株）S糖蛋白的重组表达RBD和逃逸变异体的突变RBD（P462L）上(图2和​和3），三)，被16μg/ml的这种mAb完全中和。与CR3014相比，CR3022没有阻止由1–565氨基酸组成的重组S片段与Vero细胞的结合（未公布的数据）。CR3022重链和轻链可变区序列存放在GenBank。

表1

CR3014和CR3022对SARS-CoV中和的协同作用以及CR3022对CR3014逃逸病毒的覆盖

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固定化S318–510的竞争ELISA

在竞争对手CR3014（开环）、CR3022（闭环）和对照单克隆抗体（开方阵）存在的情况下，分析生物素化CR3014和CR3022的结合。绑定表示为没有竞争对手的绑定百分比。

CR3022对不同SARS-CoV菌株重组表达的S片段表现出扩展反应性

除了CR3014识别的片段外，CR3022还与从果子狸和人类SARS-CoV分离的SARS-CoV-like分离物SZ3的RBD结合，其天冬酰胺在氨基酸479（N479S）处突变为丝氨酸，而CR3014分别未识别或仅部分识别(图4).

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ELISA中人单克隆抗体与S318-510片段的结合

根据已发表的SARS-CoV株序列合成野生型和变异片段。来自Frankfurt 1菌株的野生型S318–510，来自菌株GZ02（K344R）、Sin3408（S353F）、Shanghai LY（R426G和N437D）、GZ-C（Y436H）、Sino1–11（Y442S）、BJ302 cl.2（N479S）、SZ3（K344 R、F360S、N479K和T487S）、GD03T0013（K34 4R、F360、L472P、D480G和T487）和GD01（K344mR和F501Y）的变异片段。条形代表平均值±标准偏差。

CR3014和CR3022协同中和严重急性呼吸系统综合征冠状病毒

为了评估CR3014和CR3022是否会以添加剂或协同方式中和SARS-CoV，我们使用了经典的方法，即滴定抗体等摩尔混合物的中和效力，并将剂量反应与使用单个抗体进行的中和试验的剂量反应进行比较(图1). 数据分析采用了周和塔拉莱提出的中值效应原理[29]. 在野生型SARS-CoV 50%和100%中和的三个独立实验中，观察到组合指数（CI）小于1，表明协同中和(表1). 从DRI中可以明显看出，抗体混合物大大降低了所需的抗体剂量，尤其是CR3022（DRI=20.4）。有趣的是，CR3014还略微增强了CR3022对逃逸病毒的中和作用(图1).

单克隆抗体CR3014和CR3022与重组S318-510片段的同时结合不会改变其亲和力

为了研究亲和力的变化作为协同作用的可能机制K（K） 天研究了CR3014和CR3022与重组RBD的顺序或同时结合。个人K（K） 天CR3014和CR3022的值分别为16.3nM和0.125nM；同时结合的抗体为5.71nM；CR3014与CR3022结合的饱和S318–510为14.8 nM。与CR3014和CR3022的剂量减少指数分别为4.5和20.5相比，单克隆抗体的同时或顺序结合均未导致K（K） 天这可以解释它们通过合作结合发挥协同中和作用。

在存在单克隆抗体CR3014或恢复期血清的情况下，SARS-CoV在人巨噬细胞中不复制

在没有或存在mAb CR3014、对照mAb或恢复期患者血清的系列稀释液的情况下，SARS-CoV在第2天的巨噬细胞上没有复制到可测量的滴度（未公布数据）。图5显示在同一分析中通过RT-PCR检测SARS-CoV阳性（P）或阴性（N）链RNA（复制中间产物）。感染后6和24小时可检测到阳性链RNA，表明巨噬细胞对病毒的摄取。在2.8×10的情况下−5至2.8×10−3μg/ml CR3014阳性RNA拷贝数的增加表明巨噬细胞对病毒的摄取略有增加(图5). 相反，表明病毒复制的负链RNA在低得多的水平下可检测到，并且随着时间的推移呈恒定状态，与CR3014孵育的病毒或对照抗体之间没有差异。总之，这些结果表明，无论有没有单克隆或多克隆抗体，巨噬细胞都会吸收严重急性呼吸系统综合征冠状病毒，但这种吸收不会导致病毒的生产性复制和感染性病毒的释放。

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CR3014或对照单克隆抗体存在下SARS-CoV（HKU-39849）感染分化的人巨噬细胞

给出了三个独立实验中的一个代表性实验。在感染后6小时和24小时提取总RNA，并检测SARS-CoV阳性（P）和阴性（N）链RNA的拷贝数ORF1b型通过实时定量RT-PCR测定，并对β-肌动蛋白mRNA。条形图表示重复病毒载量滴定的平均值。在对照实验中，*表示结果异常。

讨论

我们的结果表明，靶向病毒受体结合域的人单克隆抗体可以协同中和SARS-CoV。两种单克隆抗体的结合扩大了保护范围并控制了潜在的免疫逃逸变体，同时降低了中和病毒所需的总抗体浓度。鉴于在使用单克隆抗体的动物模型中被动预防SARS-CoV感染的有效性，我们的数据为研制用于人类SARS预防的单克隆抗体鸡尾酒提供了理论依据。

虽然2003年的SARS疫情得到了成功控制，但其再次爆发的风险仍然来自其天然动物库、活动物市场中的果子狸等中间宿主，或实验室相关感染。2004年2月，SARS在北京再次爆发和社区传播，需要隔离大量接触者；这些措施的社会和经济后果是巨大的。针对SARS-CoV的预防和治疗措施的可用性将极大地有助于控制该病毒未来的再次出现，因此其开发仍然是一个高度优先事项[32].

在疫苗开发方面，在了解对病毒的免疫反应和确定保护的相关因素方面取得了相当大的进展。病毒载量高且SARS-CoV在咽分泌物中脱落的患者死亡率较高[33]. 相应地，中和抗体滴度的发展与血清、尿液、粪便和鼻咽分泌物中病毒滴度的降低相关[15]. 通过免疫全灭活SARS-CoV和表达S糖蛋白和其他结构蛋白的重组载体，在了解中和免疫反应的靶点方面也取得了进展[11–13]. 中和抗体似乎主要针对由氨基酸318–510定义的尖峰蛋白S1亚基的一个结构域，该结构域负责病毒与其细胞受体ACE2的相互作用[34–37]. 使用一组小鼠单克隆抗体对RBD进行定位，已鉴定出六种不同的中和表位，它们都是构象依赖性的[38]. 单克隆抗体的中和效力与它们在重组检测中阻断RBD-ACE2相互作用的能力直接相关；然而，也鉴定出一些中和单克隆抗体与RBD的两个不同表位结合，但不抑制与ACE2的相互作用。

使用具有中和SARS-CoV活性的多克隆或单克隆抗体进行被动免疫以控制严重疾病的发展和病毒在人与人之间的传播的概念是基于几项观察结果。据报道，在SARS患者中使用康复血清与可能的益处相关，但无论如何与不良反应无关[14,16].因此，中国已经开始从人类捐赠者那里商业化生产SARS抗血清[39]. 被动转移通过用全灭活病毒或载体表达的全长S或S片段免疫动物而产生的免疫血清可减少SARS-CoV感染小鼠模型中的病毒复制[11,18]. 人类单克隆抗体是通过噬菌体展示、SARS患者的人类B细胞永生化或转基因小鼠免疫产生的，并在小鼠模型中显示出保护作用[17,19,20]. 此外，人类单克隆抗体CR3014减少了SARS-CoV在受感染雪貂肺部的复制，完全阻止了肺部病变的发展，并消除了动物咽部分泌物中病毒的脱落[21]. 由于SARS-CoV是通过呼吸道和粪-口途径传播的，被动免疫在控制甲型肝炎病毒暴发和预防水痘带状疱疹病毒和呼吸道合胞病毒感染方面取得了成功，这一观察结果证明了在SARS暴发期间紧急免疫预防的可行性[23,24,40].

SARS单克隆抗体预防必须符合某些标准才能有效。单个单克隆抗体的保护范围可能不足以对抗所有与临床相关的病毒株，有人建议，在新爆发的情况下，可能需要对SARS-CoV进行基因分型，以选择最佳中和单克隆抗体[19]. 对2002年至2004年间从人类患者和果子狸中获得的大约100个SARS-CoV分离物全长基因组的变异性进行的综合分析表明，S糖蛋白，尤其是RBD，在从动物传播到人与人传播的过渡过程中，处于强正选择压力下，因为果子狸猫和人的ACE2受体不同[7]. 在从动物身上分离的SARS冠状病毒样病毒组中观察到RBD的最高变异性，目前还没有关于新发现的蝙蝠冠状病毒受体特异性的数据[10]. 有趣的是，感染SARS-CoV-like病毒的患者病程较轻，并且没有将病毒传播给其他人，可能是因为果子狸病毒RBD对人类ACE2的适应性不足，而人类细胞系的生产性感染需要ACE2[19,41,42]. 因此，下一次SARS疫情中SARS-CoV分离株的RBD很可能与2003年的分离株非常相似。人类严重急性呼吸系统综合征冠状病毒分离株的RBD是高度保守的，对GenBank上发表的114个序列的比对显示，只有8个不同的S序列与FM1毒株不相同[22]. 在2003年从患者身上获得的所有人类分离物SARS-CoV-like分离物GD03T0013中，RBD差异最大，与果子狸毒株关系最密切[7]. 人单克隆抗体CR3014与重组表达的RBD结合良好，RBD代表7种RBD变体，包括GD03T0013，但与人类分离物BJ302 cl.2中发现的N479S突变的变体结合较少，与从果子狸SARS-CoV-like分离物SZ3衍生的RBD完全不结合。通过噬菌体展示从恢复期SARS患者中获得的抗体CR3022与后两种变体以及其他变体结合良好。因此，CR3014和CR3022的组合不仅可以对SARS-CoV株提供足够的保护，还可以对源自果子狸的SARS-CoV-like病毒提供足够的防护。

单克隆抗体存在下的病毒复制，特别是在亚中和浓度下，具有选择中和逃逸变体的风险。因此，我们分析了在选择性压力CR3014或CR3022下产生的SARS-CoV株HKU-39849的逃逸变异体，后者没有成功。所有CR3014逃逸变异体在RBD（P462L）中具有相同的单一氨基酸交换，这在迄今为止任何SARS-CoV或SARS-CoV-like病毒中都没有报道过。该变体被CR3022成功中和，将该抗体组合的保护范围从自然发生的变体扩展到可能的CR3014免疫逃逸。此前也采取了类似的策略，开发用于暴露后狂犬病预防的单克隆抗体产品[43]. 由于体外中和逃逸可能无法准确反映体内情况，因此需要在SARS-CoV感染动物模型中以亚中和浓度测试CR3014/CR3022组合。

对CR3014/CR3022组合的进一步研究表明，抗体在体外协同中和野生型SARS-CoV，两种单抗的DRIs分别约为4和20。SARS-CoV中和单克隆抗体的协同作用尚未报道，但在针对HIV-1包膜糖蛋白上不同表位的两个、三个或四个单克隆抗体组合中观察到了协同作用，导致中和滴度增加了两到十倍[30,44,45]. 从机械上讲，单克隆抗体的协同结合可能导致抗原的构象变化，从而改变亲和力（变构效应），导致二价抗体的分子间相互作用，或导致密切接触的抗体的Fc区相互作用[46]. 通过ELISA测定，CR3014和CR3022同时与严重急性呼吸系统综合征冠状病毒糖蛋白S的S1亚基的RBD结合。然而，测量Biacore中单克隆抗体的单独、顺序和同时结合并没有显示抗体混合物相对于单个亲和力的亲和力增强，尤其是对于CR3022。协同作用的另一个可能解释是，对病毒分离物不同准种的保护范围增加了[30]. 通过对从单个患者样本中回收的SARS-CoV RNA进行直接测序，检测到了异质序列，并报道了重复细胞培养传代诱导的适应性突变[47–49]. 因此，应正式调查细胞培养中SARS-CoV准种的形成是否会影响病毒中和试验的结果。最后，CR3022可以干扰S1亚单位与已知或未知病毒共受体的结合[50]. 因此，两种单克隆抗体协同中和SARS-CoV的机制目前尚不清楚。

以前的研究表明，CR3014通过完全防止肺部病理并消除病毒的脱落，保护雪貂免受10 mg/kg剂量SARS-CoV的攻击[21]. 该抗体剂量与所需的帕利维祖马剂量（15 mg/kg）相当，该剂量可保护高危婴儿免受呼吸道合胞病毒感染，是目前唯一获得许可的抗病毒单克隆抗体[40]. 然而，保护标准70公斤成年人所需的CR3014量相对较高，出于经济原因，最好使用较低剂量。此外，CR3022的效力更低，无法作为单独的预防药物使用。因此，观察到CR3014/CR3022混合物中单个单克隆抗体的剂量减少了四到二十四倍，这可能是一个有吸引力的选择，可以减少体内中和病毒所需的总抗体剂量，同时扩大保护范围。

在这项研究中，我们还解决了抗体依赖性增强（ADE）的潜在问题，这是一种在感染另一种冠状病毒（猫传染性腹膜炎病毒）时观察到的公认现象。免疫和抗体的被动转移均能介导这种现象，单克隆抗体已被用于定位猫传染性腹膜炎病毒棘突糖蛋白的中和和增强表位[25,51]. 迄今为止，还没有直接证据表明ADE与人类SARS-CoV感染有关，人类巨噬细胞感染SARS-CoV之前被证明是流产的[25]. 然而，最近在一项表达SARS-CoV-like病毒全长棘突糖蛋白的病毒假型试验中显示，这些蛋白不能用同源或异源小鼠免疫血清中和，血清和中和SARS-CoV的人单克隆抗体增强了假型对用作指示系统的人腺癌细胞的感染性[34]. 鉴于猫感染性腹膜炎病毒感染中的ADE是通过在存在中和抗体的情况下增加巨噬细胞对病毒的摄取来介导的，我们在存在CR3014和人类恢复期血清的情况下进行了人类巨噬细胞感染性测定。在这种类型的检测中，之前已经证实登革热和罗斯河病毒感染的ADE[52]. 向SARS-CoV中添加不同浓度的CR3014或恢复期SARS血清并没有将流产感染转化为生产性感染，从而降低了被动免疫后在体内观察到ADE的可能性。

总之，我们认为以SARS-CoV RBD为靶点的中和单克隆抗体组合具有控制SARS-CoV感染的潜力，具有较高的疗效和安全性，并且可能降低经济成本。事实证明，隔离疑似严重急性呼吸系统综合征病例和隔离接触者对控制流行病是有效的。然而，检疫措施所涉及的直接和间接成本非常巨大[4]. 在SARS爆发的情况下，单克隆抗体预防（环形疫苗接种）可能更具成本效益。

致谢

作者贡献。JtM、ENvdB、JdK和JG设计了这项研究。AQB构建了免疫库，ENvdB和FC分离出单克隆抗体CR3022。WP和HWD设计并执行了病毒中和实验。JAB设计并分析了协同实验，这些实验由CSWL、CYC和WP执行。ENvdB和FC构建了重组尖峰片段，并测试了它们与单克隆抗体的结合。EvD设计并执行了Biacore实验。LLMP、WEM、CSWL、CYC和JSMP设计并执行了中和逃逸病毒的拯救和巨噬细胞感染分析。VTC招募淋巴细胞用于文库构建的患者产生单克隆抗体CR3022。JtM、ENvdB、LLMP、WEM、CYC、AQB、JAB、EvD、WP、HWD、VTC、JdK、JSMP和JG对数据进行了分析和解释，并为撰写论文做出了贡献。

缩写

ADE公司抗体依赖性增强
CI公司组合指数
直接还原铁剂量减少指数
单克隆抗体单克隆抗体
ORF公司开放式阅读框
RBD公司接收器绑定域
S公司尖峰
非典严重急性呼吸综合征
SARS-CoV公司SARS 冠状病毒
标准立方英尺单链可变抗体片段

脚注

引文：ter Meulen J、van den Brink EN、Poon LLM、Marissen WE、Leung CSW等（2006）《SARS冠状病毒人类单克隆抗体组合：协同作用和逃逸突变体的覆盖》。《公共科学图书馆·医学》3（7）：e237。内政部：10.1371/journal.pmed.0030237

基金：这项工作得到了欧盟STREP拨款SP22-CT2004–511064、SenterNovem拨款TSGE2006和国家过敏和传染病研究所拨款AI95357的部分支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、出版决定或手稿准备方面没有任何作用。

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