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基因发育。2006年6月15日；20(12): 1597–1608.
doi（操作界面）：10.1101/编号1402306
预防性维修识别码：项目经理1482480
PMID：16738405

威尔姆斯肿瘤1（WT1）基因（+KTS同种型）与CTE一起发挥作用，以增强具有保留内含子的未剪接RNA的翻译

Yeou Bor公司,1 詹妮弗·斯瓦茨,1 艾薇尔·莫里森,2 大卫·雷科什,1 迈克尔·拉多梅里,2和玛丽·路易斯·哈马舍尔德1,三
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

威尔姆斯肿瘤1（WT1）基因在哺乳动物泌尿生殖系统发育中起着重要作用，在许多人类癌症中观察到该基因的失调。WT1 RNA的选择性剪接导致两种主要蛋白质亚型的表达，WT1（+KTS）和WT1（−KTS）。虽然WT1（−KTS）起转录调节器的作用，但WT1（+KTS）没有明确的功能，尽管该蛋白对正常发育至关重要。在这里，我们表明WT1（+KTS）的功能是增强RNA的表达，RNA具有保留的内含子，并且包含细胞或病毒组成运输元件（CTE）。WT1（+KTS）的表达增加了含有CTE的未剪接RNA的水平，并特异性促进该RNA与多核糖体的结合。这些研究进一步支持了RNA代谢不同步骤之间的联系以及转录后操纵子的存在。

关键词：WT1、Wilms瘤、CTE、组成运输元件、RNA输出；转录后调节

基于与WAGR综合征（Wilms肿瘤、无尿症、泌尿生殖系统畸形和智力低下）相关的11号染色体缺失，首次鉴定并克隆了WT1抑癌基因(Call等人，1990年;Gessler等人，1990年).工作任务1编码已被证明在脊椎动物几个器官的正常发育中发挥关键作用的基因产物，尤其是泌尿生殖系统（有关综述，请参阅Discenza等人，2004年). 中的突变工作任务1该基因已在多种人类疾病中检测到，包括威尔姆斯瘤（肾母细胞瘤）、登革热综合征（以严重系膜硬化为典型）和弗雷泽综合征（局灶节段性肾小球硬化、假两性畸形和性腺母细胞瘤等）。我们最近使用siRNA表明，在体外小鼠肾脏发育系统中，WT1在肾脏发生的特定阶段是必需的工作任务1沉默与肾发生障碍、细胞增殖和凋亡水平异常有关(Davies等人，2004年). 除了在泌尿生殖器官发育中的作用外，工作任务1也参与造血，因其在急性髓细胞白血病中的错误表达而引起临床医生的极大兴趣(Rosenfeld等人，2003年).

这个工作任务1该基因编码四个Krüppel型半胱氨酸2-他的2锌指，与转录调节器的功能一致。WT1的锌指将其置于转录因子的早期生长反应（EGR）家族中，一些研究已经证明，WT1可以在这一能力中发挥作用，可以作为多种生长相关基因的激活剂、阻遏剂或辅激活剂（有关综述，请参阅Scharnhorst等人，2001年). 这个工作任务1该基因由10个外显子组成，并且是选择性剪接的。外显子5可以跳过；它的内含物在蛋白质的中心部分增加了17个氨基酸。第9外显子的另一剪接供体位点仅在第三和第四锌指之间插入三种氨基酸——赖氨酸、苏氨酸和丝氨酸（KTS）(Haber等人，1991年;Gessler等人，1992年). 最近描述了一类新的mRNA转录物(AWT1型)，源于内含子1中存在的另一个外显子1的使用。该外显子的使用导致使用替代的内部AUG起始密码子(Dallosso等人，2004年). 总之，选择性剪接与上游CUG选择性翻译起始密码子和RNA编辑相结合，导致多种基因的潜在表达工作任务1亚型。在这些亚型中，最保守的是产生于+/-KTS选择性剪接的亚型(Kent等人，1995年).

而WT1（−KTS）具有典型的DNA结合转录因子的特性(Rauscher等人，1990年;Bickmore等人，1992年)，还没有确定WT1（+KTS）蛋白的明确作用，它以降低的亲和力结合DNA(莱蒂等人，2000年;翟等，2001). +/-KTS亚型比率受到严格调节，并且该比率的破坏与人类和小鼠Frasier综合征的发病机制有关(Barbaux等人，1997年;Klamt等人，1998年;Hammes等人，2001年). 有趣的是，最近的一项研究通过证明WT1（+KTS）亚型是嗅觉系统正常发育所必需的，进一步强调了其重要性(Wagner等人，2005年).

一些研究表明，WT1（+KTS）可能主要在转录后水平发挥作用。+KTS亚型和RNA加工之间的潜在联系最初由Larsson等人（1995）他证明了WT1（+KTS）在核斑点中的优先定位。用RNase而非DNase处理，改变了WT1（+KTS）核定位，并用snRNPs免疫共沉淀蛋白质。后来的研究表明，WT1（+KTS）与关键剪接因子U2AF65特别相关(Davies等人，1998年)和WTAP，一种假定的剪接因子。这个果蝇属WTAP的同源物female-lethal（2）D参与选择性剪接性别决定途径(Ortega等人，2003年). 此外，WT1存在于poly（A）中+RNP在表达细胞系和胎肾提取物中的作用(Ladomery等人，1999年)能在细胞核和细胞质之间穿梭(Vajjhala等人，2003年). 研究表明，WT1锌指在体外和体内都能与RNA结合，其中锌指1在RNA结合中尤为重要(Caricasole等人，1996年;Ladomery等人，2003年). 尽管进行了大量研究，但WT1（+KTS）在转录后基因调控中的功能作用尚未确定，迄今为止还没有确定的体内RNA靶点(Bardeesy and Pelletier 1998年).

在以前的研究中，我们使用HIV和其他逆转录病毒系统作为模型，以阐明含有一个或多个保留内含子的mRNA的输出和表达的机制。逆转录病毒RNA含有特殊的顺式-能够输出含有未分裂内含子的病毒RNA的作用元件。在缺乏这些元素的情况下，这些RNA保留在细胞核中，在那里它们最终被降解。HIV中的Rev反应元件（RRE）是第一个确定的此类元件。RRE与HIV Rev蛋白协同作用(波拉德和马利姆1998).

另一种能够促进带有保留内含子的mRNA输出的特异性病毒元件来自D型逆转录病毒Mason-Pfizer Monkey Virus（MPMV），称为构成性转运元件（CTE）（审查见Hammarskjöld 2001）。该元素对于输出MPMV感染细胞中表达的基因组、未片段RNA至关重要。在HIV信使核糖核酸的输出中，CTE已被证明可以取代Rev和RRE，并促进具有保留内含子的细胞RNA的输出(Bray等人，1994年;Ernst等人，1997年). 与HIV RRE（与病毒Rev蛋白协同作用）相反，CTE仅与宿主细胞因子相互作用。研究表明，CTE与Tap（NXF1）特异性结合，认为其作为细胞mRNA输出受体发挥主要作用(Gruter等人，1998年;Izaurralde 2002年). Tap与细胞NXT1蛋白形成异二聚体(Fribourg等人，2001年)，Tap和NXT1对CTE功能都很重要(Katahira等人，1999年;Braun等人，2001年;Guzik等人，2001年). 虽然Tap和NXT1在mRNA输出途径中起作用，但我们最近证实，这些蛋白质也促进细胞质中CTE-mRNA的翻译，与多核糖体相关的是Tap，而不是NXT1(Jin等人，2003年).

宿主细胞蛋白直接与MPMV CTE相互作用以调节转录后基因表达，这一事实使我们假设人类转录组中存在细胞CTE。这些CTE可以使含有完整内含子的细胞RNA和其他选择性剪接的RNA离开细胞核并在细胞质中翻译。虽然内含子保留似乎是高等真核生物中最不常见的选择性剪接形式，但一些哺乳动物基因可能是以这种方式调控的(Galante等人，2004年). 为了识别细胞CTE，我们开发了一种基于HIV载体的CTE陷阱系统（将在别处详细描述）。该系统专门设计用于克隆可替代Rev/RRE的元件，以将未切割的HIV RNA输出到细胞质。

在这里，我们描述了一种细胞CTE的鉴定，该细胞CTE显示出与与表位标记的WT1（+KTS）蛋白共免疫沉淀的RNA的强同源性。我们证明，该元素可以在基于HIV的报告分析中作为CTE发挥作用。此外，我们证明了WT1（+KTS）可以增强由该元素介导的表达。我们的研究还表明，与WT1（−KTS）蛋白相比，WT1（+KTS）蛋白质能够强烈增强含有MPMV CTE的报告构建物的表达。我们表明，WT1（+KTS）的表达促进了CTE相关RNA的多聚体关联，表明该蛋白在目标mRNA的翻译调控中发挥作用。

这些结果首次明确表明，WT1（+KTS）可以在转录后水平促进基因表达。

结果

WT1（+KTS）蛋白增强含有细胞或病毒CTE的未切割RNA的表达

在使用HIV载体捕获系统从COS细胞cDNA文库中选择潜在的组成转运元件的过程中，我们分离出594-核苷酸（nt）元件（5A1）（Y.-c.Bor，D.Rekosh，和M.L.Hammarskjöld，unpubl.）。该元素的一部分与之前在一项旨在识别WT1蛋白在转录后水平调控的基因的方案中发现的RNA相同（M.Ladomery和N.Hastie，未解释）。该RNA命名为非蛋白编码T12 mRNA（GenBank登录号4375837），在COS细胞中表达表位标记的WT1（+KTS）蛋白的共免疫沉淀中分离得到。如图所示​图1A，1安培234-nt T12 mRNA在5A1序列的3′端208-nt延伸中与5A1 CTE显示出完美的同源性。

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(A类)细胞元件5A1与非蛋白编码T12 mRNA序列的核苷酸序列比对。相同的核苷酸用垂直线表示。(B类)本研究中使用的报告结构示意图。报告质粒含有HIV-1加格波尔由CMV启动子驱动表达的编码序列。由此产生的未切割转录本，包含一个完整的内含子，保留在细胞核中，不存在CTE。在CTE存在的情况下，未片断的mRNA被输出到细胞质，从而允许来自CTE的HIV p24的表达堵住基因。（SD）拼接供体；（SA）拼接受体；（pA）聚腺苷化信号。虚线在下面拼接的消息描述了删除的内含子。(C类)通过共转染表达Tap/NXT1或WT1（+KTS）的质粒，pCMVGagPol-5A1或pCMVGagPol-CTE中p24的表达增强。293T电池（3×106将15μg pCMVGagPol-5A1或5μg pCMCVGagPol-CTE质粒和0.25μg pCSEAP单独或与2μg pCMVTap和1μg pCDNA3FLAGNXT1或5μgWT1（+KTS）表达载体一起转染到10 cm培养皿中的细胞）。在转染后72小时，收集上清液并分析p24水平和SEAP活性。p24值被归一化为SEAP值，作为转染效率的控制。显示的值是重复转染的平均值。(D类)来自pCMVGagPol-SIRT7或pCMVGagPol-ACTN4的p24的表达通过共转染表达Tap/NXT1或WT1（+KTS）的质粒而增强。按照C、。

由于WT1（+KTS）被认为在转录后调控中起作用，我们决定测试转染细胞中WT1（+KTS）的表达是否对包含5A1序列或MPMV中特征良好的CTE的报告构建物的表达有任何影响。293T细胞被选作这些实验，因为已经很好地证明这些细胞不表达可检测到的WT1 RNA或蛋白质(Thäte等人，1998年;Lee和Pelletier 2001年;Vajjhala等人，2003年;Rae等人，2004年). 因此，这些细胞为分析WT1效应提供了一个极好的“互补”系统。此外，我们之前已经证明Sam68和Tap/NXT的表达可以增强这些细胞中CTE相关RNA的表达(Coyle等人，2003年;Jin等人，2003年).

在这些实验中，我们使用了基于HIV衍生质粒pCMVGagPol的报告分析。该质粒的重要特征如图所示​图1B：。1B年从该质粒表达GagPol蛋白需要导出和翻译保留完整内含子的未切割RNA。只有当未切割的RNA含有顺式-能够克服通常阻止其输出和表达的细胞限制的作用RNA元件。报告构建物中GagPol蛋白的表达导致含有HIV p24的颗粒的表达和分泌，可使用特定ELISA进行测量。作为对照，细胞也转染了表达分泌型碱性磷酸酶（SEAP；pHR1831）的CMV载体，该载体也分泌到转染细胞的培养基中。由于SEAP是由传统的剪接mRNA表达的，因此SEAP值的归一化校正了转染效率和对“正常”mRNA代谢的普遍影响。我们之前已经证明，将MPMV CTE插入pCMVGagPol质粒可以有效输出和表达未片段化RNA（Srinivasakumar等人，1997年；Coyle等人，2003年;Jin等人，2003年).

将含有5A1或MPMV CTE的pCMVGagPol报告质粒单独或与表达WT1（+KTS）蛋白的构建物一起转染293T细胞。同时，我们用表达Tap和NXT1（pHR2128和pHR2283）的质粒转染细胞。我们之前已经证明，适度过度表达Tap/NXT1能够增强293T细胞中pCMVGagPol-CTE质粒的表达(Guzik等人，2001年;Jin等人，2003年). 图​图1C1摄氏度证明Tap/NXT1和WT1（+KTS）都能够显著增强含有5A1的质粒以及含有MPMV CTE的质粒的表达。（在本实验中，SEAP值变化不超过两倍。）尽管含有5A1的质粒的表达量低得多（注意尺度变化），但这些实验清楚地支持了5A1构成CTE的细胞等效物的概念。

导致识别5A1序列的HIV载体陷阱系统也从额外的细胞基因中识别了其他几个CTE。其中包括肌动蛋白4（ACTN4）和SIRT7（关于这些元素的描述，见补充表S1）。ACTN4可能与WT1功能特别相关，因为使用三杂交系统的实验表明，来自相关家族成员的mRNA行动1是潜在的WT1绑定目标(Morrison等人，2006年). ACTN1和ACTN4（非肌肉特异性α-肌动蛋白）密切相关并协同表达。此外，已知ACTN4在肾功能中起重要作用，该基因的突变会导致局灶节段性肾小球硬化（FSGS）(Kaplan等人，2000年). FSGS是一种在Frasier综合征患者中发现的三联征的一部分，由WT1（+KTS）/WT1（−KTS）比值改变引起(Barbaux等人，1997年;Hammes等人，2001年). SIRT7的功能还不太清楚，但最近已确定该基因表达一个保留内含子的mRNA(Galante等人，2004年).

为了测试WT1（+KTS）表达对来自ACTN4和SIRT7的CTE的影响，我们创建了包含这些元素的pCMVGagPol报告质粒，并如上所述测量p24表达。数据（图。​（图1D）一维)明确证明WT1（+KTS）增强了这些质粒的六倍表达。因此，该蛋白能够增强至少三种不同细胞CTE的功能。

WT1（−KTS）蛋白以剂量依赖的方式抑制WT1（+KTS）功能

由于病毒CTE提供了更高的p24水平，并且是一个特征明确的转录后元件，我们继续使用GagPol-MPMVCTE报告结构分析WT1蛋白的功能。首先，我们想确定我们观察到的增强是否特定于WT1（+KTS）。为此，我们进行了实验，其中表达WT1（+KTS）或（−KTS）蛋白的质粒与pCMVGagPol-CTE（pHR1361）共转染的数量增加（图。2A–C型). 我们还使用表达EGR1蛋白的质粒进行了类似的实验（图。​（图2D）。二维). 与WT1一样，EGR1蛋白也含有Cys2-他的2C端的锌指。WT1的锌指2、3和4与EGR1的三个锌指具有60%的氨基酸同源性(Rauscher 1993年). 然而，与WT1蛋白相比，该蛋白与RNA没有显著结合。

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WT1（+KTS）、WT1（−KTS）或EGR1对293T细胞中pCMVGagPol-CTE报告基因构建物p24表达的影响。电池（3×106)与5μg pCMVGagPol-CTE、0.25μg pCMCSEAP共转染，并增加表达WT1（+KTS）或WT1（−KTS）的质粒数量(A类)或EGR1蛋白(D类). (B、 C类)中显示的同一组数据A类在不同的比例尺上绘制为“折叠增加”。在转染后72小时，收集上清液并分析p24水平和SEAP活性。显示的p24值已针对SEAP活动进行了规范化。数据表示两次独立转染的平均值。

如图所示2、A和B，WT1（+KTS）蛋白以剂量依赖的方式增强CTE功能，证实并扩展了先前的结果。在WT1（+KTS）的最高浓度下，标准化p24值增加了约45倍（图。​（图2B）。2B型). 相反，WT1（−KTS）只使p24表达增加了最小（约2.5倍）。然而，观察到的小幅度增加可以清楚地看出是剂量反应性的（见图。​图2C）2摄氏度)这可能很重要，因为它是在重复实验中观察到的（数据未显示）。相反，EGR1的表达没有导致p24表达的任何显著增加（图。​（图2D）。二维). 对表达的WT1（+KTS）、WT1（−KTS）和EGR1蛋白进行的Western blot分析表明，它们都以相似的水平表达（参见补充图S1）。

由于WT1（+KTS）和WT1（−KTS）亚型已被证明形成异二聚体，我们接下来研究了这些蛋白共表达对CTE表达的影响。为了做到这一点，我们进行了两个实验，其中固定数量的表达+KTS亚型的质粒或表达−KTS亚型态的质粒与增加数量的另一个质粒共同转染。这些实验的结果如图所示3、A和B表明WT1（−KTS）的表达以剂量依赖的方式抑制WT1（+KTS）效应。这表明WT1（−KTS）蛋白的表达表明反式+KTS亚型对增强的主要负面影响。该观察结果可能与已记录的WT1通过N末端二聚化的能力有关(Englert等人，1995年;Moffett等人，1995年;Reddy等人，1995年;Bruening等人，1996年).

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(A、 B类)过度表达WT1（−KTS）抑制转染293T细胞中WT1（+KTS）的增强作用。将细胞与5μg pCMVGagPol-CTE、0.25μg pCMVSEAP和增加量的WT1（−KTS）共转染(A类)或WT1（+KTS）(B类)而表达另一亚型的质粒的量保持在1μg不变。(C、 D类)外显子5和特定的KTS氨基酸序列对WT1的转录后功能都不重要。如图所示，用5μg pCMVGagPol-CTE、0.25μg pCMCVSEAP和增加数量的WT1构建物共同转染细胞。在所有情况下，使用空载体保持转染质粒的总量不变。按照图图例所述进行转染和分析​图22.

外显子5序列和WT1（+KTS）中三氨基酸插入的氨基酸序列对CTE功能的促进不是必需的

选择性剪接产生WT1的几种不同亚型。另一种剪接事件是外显子5的跳跃。我们进行的原始实验（如图。​图1C，1摄氏度,​、2A、，2安培,3A、B)所有人都使用包含该外显子的WT1蛋白。为了研究外显子5是否对CTE功能的增强至关重要，我们分析了缺少该外显子的WT1（+KTS）蛋白的作用。这些实验的结果如图所示​图3C，3C公司，明确表明第5外显子对观察到的效果并不重要。

我们还构建了一个表达WT1变体的质粒，其中编码KTS基序的序列被突变为编码三个丙氨酸（AAA）。对该质粒产生的蛋白质进行的Western blot分析表明，其表达水平与其他WT1蛋白类似（参见补充图S1）。使用该构建物的转染实验表明，该蛋白能够增强CTE功能以及+KTS蛋白（图。​（图3D）。三维). 这表明KTS插入的氨基酸序列对于CTE增强不是必需的。这支持了这样一种观点，即KTS插入仅在结构上破坏WT1蛋白的锌指区域，并且特定的氨基酸序列并不重要(Davies等人，2000年;莱蒂等人，2000年).

WT1（+KTS）和WT1（−KTS）增加了CTE相关RNA的总量和细胞质水平

为了分析观察到的WT1对CTE介导的表达的影响的潜在机制，我们对转染WT1（+KTS）或WT1（−KTS）表达质粒的细胞的细胞质和总RNA进行了Northern blot分析。为了控制分离，我们还对转染质粒pCMVGagPol-RRE（pHR0354）的细胞进行了分析，在没有或存在Rev（pHR30）的情况下。我们和其他人之前已经证明，在没有Rev的情况下，GagPol-RRE RNA保留在细胞核中，但在有Rev存在的情况下有效地输出到细胞质中(波拉德和马利姆1998;Guzik等人，2001年;Coyle等人，2003年;Jin等人，2003年).

实验结果如图所示​图4。4。对照实验表明，在Rev存在的情况下，细胞质中GagPol-RRE报告RNA的水平增加了24倍，这与我们之前发表的结果一致(Guzik等人，2001年;Coyle等人，2003年;Jin等人，2003年). 总RNA水平也有所增加，但仅增加了约五倍。这是以前观察到的，可能是由于RNA输出到细胞质并被翻译机器激活时，与保留在细胞核中时相比，RNA的稳定性增加。

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总蛋白的Northern印迹分析(A类)和细胞质(B类)mRNA和蛋白质合成水平(C类)Pr55Gag在转染细胞中的表达。(A、 B类)293T电池（1×107在没有或存在15μg WT1（+KTS）或WT1（−KTS）质粒的情况下，用15μg pCMVGagPol-CTE和5μg pCMCVSEAP转染。作为对照，在存在或不存在5μg pCMVRev的情况下，细胞也转染15μg pCMCVGagPol-RRE和5μg的pCMVSEAP。转染后65小时，全聚物和细胞质聚物(A类)+从转染细胞中分离出mRNA，如材料和方法所述。印迹含有5μg聚乙烯(A类)+mRNA，并与32P标记的GagPol和SEAP探针。上标记为RRE的面板中显示的值左边每个图的侧面表示无转染和有转染的GagPol RNA条带水平的折叠差异在下面CTE面板（正确的图的侧面）表示与单独使用pCMVGagPol-CTE转染相比，存在指示蛋白质时GagPol-CTE RNA水平的倍数差异。使用SEAP波段对所有值进行标准化。(C类)pCMVGagPol-CTE（myr）表达的Pr55Gag蛋白的脉冲追踪分析−赞成的意见−)转染293T细胞。电池（3×106)转染5μg pCMVGagPolCTE（myr−赞成的意见−)含或不含5μg WT1（+KTS）或5μg WT1（−KTS）。转染后36小时，用35S-转标记（蛋氨酸和半胱氨酸）20分钟并追踪10小时，35添加S标记的GST-p24作为回收对照，并使用抗p24单克隆抗体（183-H12-5C）进行免疫沉淀。使用荧光成像仪在15%SDS-PAGE上分析沉淀物。标记为P的通道包含来自脉冲的样本，标记为C的通道包含脉冲相位的样本。免疫沉淀的Pr55Gag带（及其衍生物）和对照GST-p24蛋白的位置已标明。Pr55Gag蛋白总条带的相对归一化像素强度显示在每个条带下。使用每个样本中恢复控制蛋白GST-p24的强度对数据进行标准化。

在使用CTE构建的转染中，总RNA水平与WT1（−KTS）一起增加了约两倍，而WT1（+KTS）的表达增加了四倍。这些结果再次很可能反映了RNA的稳定性，而不是转录效应，因为SEAP mRNA是从与CTE RNA相同的启动子表达的，并且数据是使用SEAP mRNA标准化的。当分析细胞质CTE包含的RNA时，WT1（−KTS）显示RNA水平增加了约三倍，而在WT1（+KTS）的存在下，观察到增加了五倍。这些增加与总RNA制备中观察到的仅略有不同，表明这两种蛋白质的RNA输出没有显著的特异性增加。显然，两种WT1亚型所观察到的RNA水平的轻微增加不能解释WT1（+KTS）与WT1（−KTS）相比p24蛋白水平的差异性增加。当使用本实验的细胞质RNA数据对图中所示的数据进行归一化时，这一点就变得很清楚了​图2。2在该图中，转染5μg WT1（+KTS）（与本实验中使用的量相同）使蛋白质水平增加了42倍，而转染WT1（−KTS）仅使p24值增加了2.6倍。因此，在RNA水平归一化后，WT1（+KTS）的蛋白质水平增加了7.7倍以上（42/5.4）。另一方面，对于WT1（−KTS），RNA的增加完全解释了蛋白质的增加（2.6/3.1）。

WT1（+KTS）增加了GagPol-CTE RNA翻译的蛋白质的合成速率，但WT1（−KTS）没有

为了确定转染pCMVGagPol-CTE和WT1（+KTS）与WT1（−KTS）的细胞之间p24积累水平的差异是否是蛋白质合成速率增加的直接结果，我们决定直接测量相对速率。pCMVGagPol-CTE构建物通常会产生多蛋白，这些多蛋白被HIV蛋白酶裂解，并以类病毒颗粒的形式从转染细胞中发芽。因此，很难直接看到转染细胞中的初级翻译产物。这就排除了通过直接检查积累的蛋白质来直接测量蛋白质合成速率的可能性。为了克服这个问题，我们构建了一个新的质粒pCMVGagPol（myr−赞成的意见−)-CTE（pHR2900）。该质粒在HIV蛋白酶活性部位有点突变，使蛋白酶不活动（pro−)在Gag的N末端破坏肉豆蔻酰化信号（myr−). 因此，预计这些载体只能产生非淀粉酰化的Pr55Gag和Pr160GagPol前体，以及可能由内部起始密码子衍生的次要衍生物（p41）(Smith等人，1993年). 由于病毒颗粒出芽需要肉豆蔻酰化，这些蛋白质预计会以未经纯化的形式保留在转染细胞内。这一点通过显示在培养基上清液中未检测到p24（数据未显示）以及只有未经纯化的Pr55Gag蛋白在转染细胞的细胞质中积累来验证。

为了直接分析蛋白质合成速率和/或合成蛋白质的稳定性，我们对转染了改性（myr）的细胞进行了脉冲期实验−，专业−)CTE构造。转染后36小时，用35S-转运标记（甲硫氨酸和半胱氨酸）20分钟。然后用PBS洗涤细胞两次并收获（脉冲），或用含有过量冷氨基酸的生长培养基重新处理，10小时后收获（追逐）。使用小鼠抗Gag（p24）抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀，并通过SDS-PAGE和放射自显影术分析Pr55Gag和p41。为了补偿样品之间免疫沉淀效率的潜在差异，在免疫沉淀之前将体外纯化的GST-p24蛋白添加到细胞裂解液中。在初始免疫沉淀后，对上清液进行第二次免疫沉淀，以判断第一次沉淀的效率。在第一次沉淀中，每种蛋白质都有95%以上被去除（数据未显示）。

脉冲相位实验的结果如图所示​图4C。4摄氏度。仅在GagPol-CTE质粒转染的细胞中观察到极少量的Pr55Gag。追踪10小时后，标记蛋白的数量没有显著减少，表明在此期间产生的蛋白是稳定的。在存在WT1（+KTS）的情况下，观察到Pr55Gag带的强度显著增加，但在存在WT2（−KTS）时，仅略有增加（如果有）。同样，所产生的蛋白质在10小时追逐期内是稳定的。当数据标准化为细胞质RNA水平时，使用图中所示的值​图4B，4B类转染WT1（+KTS）后Gag蛋白合成速率是未添加WT1蛋白时的两倍。然而，WT1（+KTS）和WT1（−KTS）的转染率差异约为五倍。这是一个更重要的比较，因为合成速率可能是在WT1蛋白的效果不是最佳的时候测量的。因此，该实验清楚地表明，WT1（+KTS）能够特异性地增强GagPol-CTE RNA的翻译，正如我们之前在Tap/NXT1中观察到的那样(Jin等人，2003年).

WT1（+KTS）增加含CTE RNA与多核糖体的关联

为了测试WT1（+KTS）的表达是否导致GagPol-CTE RNA的多核糖体结合增加，我们从单独转染报告质粒或报告质粒和WT1（+KTS）转染的细胞中提取细胞质。然后对提取物进行蔗糖梯度离心并分馏，并使用图中所示实验中使用的相同探针在Northern blot上分析每个部分​图4。4。此实验的结果如图所示​图5。5对于仅转染SEAP和GagPol-CTE质粒的细胞，值得注意的是，较重的多核糖体部分基本上没有GagPol-CTE RNA（图。​（图5A，5A级，左面板），尽管在整个梯度中都发现了SEAP mRNA。具体而言，观察到CTE-RNA的很大一部分定位于对应于单体和非常小的多核糖体的组分。这可能表明CTE-RNA的起始率很低，并且与我们之前的结果一致，即GagPol-CTE RNA在293T细胞中的翻译很差(Jin等人，2003年). 值得注意的是，图的右侧面板​图5A5A级表明WT1（+KTS）的添加导致大量GagPol-CTE RNA重新分布到较重的多核糖体。相反，SEAP mRNA的分布基本保持不变。图​图5B5亿直接比较具有或不具有WT1（+KTS）表达的CTE或SEAP RNA的分布。总之，这些结果表明，WT1（+KTS）的表达除了对mRNA水平有轻微影响外，还促进了含CTE的GagPol-RNA的多核糖体关联和翻译。相反，WT1（−KTS）对GagPol-RNA的多核糖体结合几乎没有影响，这与其对Gag蛋白合成速率没有影响一致（参见补充图S2）。

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蔗糖梯度离心法分析转染293T细胞中GagPol-CTE mRNA的多核糖体谱。(A类)293T细胞（8×106)在没有或存在15μg WT1（+KTS）质粒的情况下，用15μg pCMVGagPol-CTE转染。转染48小时后，收集细胞，并按照材料和方法中的描述对细胞质提取物进行蔗糖梯度离心。对梯度进行分级，并使用连续流动池测量OD 254。体外转录堵住RNA（IVT堵住)然后将其添加到每个组分中，作为从每个组分分离RNA之前RNA回收的对照。然后对分离的RNA进行GagPol-CTE、SEAP mRNA和IVT分析堵住RNA使用Northern blots。用荧光成像仪分析印迹来定量条带的强度。然后使用IVT校正每个GagPol-CTE和SEAP带的测量强度以进行恢复堵住每个片段中的RNA带。每个部分显示的值是在该部分中检测到的总GagPol-CTE或SEAP mRNA的百分比。(B类)图表显示了GagPol-CTE的分布(左边)和SEAP mRNA(正确的)在CTE（白色条）和CTE+WT1（+KTS）渐变（黑色条）中。

WT1（+KTS）与293T细胞中的多核糖体相关

最近的一篇论文表明，在几种不同的细胞类型中，WT1（+KTS）和WT1（−KTS）蛋白都在细胞核和细胞质之间穿梭。据报道，WT1亚型与转染COS-7细胞中的多核糖体翻译相关(Niksic等人，2004年).

为了研究WT1（+KTS）蛋白是否与293T细胞中的多核糖体相关，我们用pCMVGagPol-CTE和表达T7-标记WT1（+KTS）的质粒转染细胞并制备细胞质提取物。对提取物进行蔗糖梯度离心，并使用抗T7抗体在Western blot上分析每个部分。我们还对梯度组分进行了类似的分析，梯度组分采用15 mM EDTA处理的提取物，以在离心前特异性破坏多核糖体。

Western blot分析如图所示​图6A6A级证明WT1（+KTS）可以在整个梯度中找到，包括多核糖体部分。这与之前在COS-7细胞中报告的结果一致。EDTA处理（图。​（图6B）6亿)折叠多核糖体（参考未处理和处理提取物的剖面），并将所有WT1蛋白转移到含有核糖体亚单位的部分。这强烈表明WT1（+KTS）蛋白与真正的多核糖体复合体相关，并且可能与核糖体亚单位特异性相关。

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WT1（+KTS）与转染的293T细胞中的多核糖体相关。(A类)电池（8×106)共转染15μg pCMVGagPol-CTE、2.5μg pCMCVSEAP和15μg WT1（+KTS）质粒，并进行材料和方法中所述的多核糖体分析。对梯度进行分级，并测量每个馏分的外径254。通过SDS-PAGE解析每个组分的蛋白质，并使用抗T7抗体和125I-蛋白A。梯度级分的光密度分布显示在顶部。(B类)实验按如下方式进行A、，除了将15 mM EDTA添加到裂解液中，然后加载到含有15 mM乙二胺四乙酸的蔗糖梯度上。

讨论

WT1（−KTS）蛋白作为一种重要转录因子的作用已经得到了很好的证实。然而，尽管已经描述了嵌合尤因肉瘤基因（EWS）-WT1（+KTS）蛋白的转录作用(Reynolds等人，2003年)，尽管适当的+KTS/−KTS比率对几个器官的发育至关重要，但天然WT1（+KTS）蛋白没有明确的功能(Hammes等人，2001年;Davies等人，2004年;Wagner等人，2005年). 在这项研究中，我们首次表明WT1（+KTS）在转录后水平发挥作用，调节RNA表达，特别是，+KTS蛋白可以与顺式-代理CTE以促进带有保留内含子的未切割RNA的翻译。

WT1（+KTS）以前曾被提议参与转录后调控，因为+KTS亚型与核斑点和剪接因子有明显的优先关联(Larsson等人，1995年;Ladomery等人，1999年,2003). 这表明WT1（+KTS）最初可能与含CTE的RNA结合剪接机制相互作用。尽管MPMV CTE在转录后水平上具有特异性功能，能够输出和翻译未剪接或不完全剪接的RNA，但CTE不会使RNA从剪接机制中转移，而是使RNA能够绕过似乎需要在输出前去除内含子的细胞限制(Legrain等人，1988年;Chang and Sharp 1989年;哈马舍尔德1997). 事实上，已经有很好的文献证明，作为CTE介导的输出底物的RNA最初与剪接机制相互作用，即使它们完全没有被剪接(Lu等人，1990年;哈马舍尔德1997). 也有研究表明，U2AF65可以刺激保留内含子的未切割报告RNA的核输出和表达，外源表达的U2AF6可以招募Tap-to-mRNP复合物(Zolotukhin等人，2002年). 因此，这些结果表明剪接因子在含有出口活性CTE的mRNP复合物的形成中起作用。由于WT1（+KTS）已被证明直接绑定到U2AF65(Davies等人，1998年)，确定这种相互作用是否在WT1（+KTS）增强CTE功能的能力中发挥作用将是一个很有意义的问题。

WT1蛋白中的KTS插入极为保守。然而，我们的结果表明，一个以AAA取代KTS序列的蛋白质和原始WT1（+KTS）蛋白质都起作用，支持插入的唯一功能是破坏第三和第四锌指之间的连接物，从而破坏蛋白质的结构。它也支持先前提出的观点，即特定KTS序列的保守性可能是由于RNA水平上的必要保守性，以便正确剪接和维持两种亚型之间的比率(Davies等人，2000年).

与KTS插入的功能重要性相反，以前研究WT1的功能并未证明哺乳动物特异性替代外显子5的明确作用，该外显子包括或排除蛋白质中的17个氨基酸。此外，缺乏该外显子的成年小鼠是可以存活和繁殖的(Natoli等人，2002年). 该外显子对于WT1（+KTS）的某些转录后效应显然是不必要的，因为缺少该外显基因的蛋白质在我们的系统中完全起作用。

尽管WT1（+KTS）明显增强了含有CTE的RNA的多核糖体结合，但相对于从同一启动子转录的SEAP mRNA，该蛋白也略微增加了该RNA的总体水平。这表明WT1（+KTS）也可能直接影响RNA代谢的某些方面。WT1（+KTS）在多个水平上的作用并不奇怪，因为许多最近的研究强调了RNA加工不同步骤之间的联系（有关最近的综述，请参阅Huang和Steitz 2005). 此外，Sam68还起到促进含CTE RNA翻译的作用(Coyle等人，2003年)据报道，它还影响选择性剪接、RNA稳定性和多聚腺苷化(Matter等人，2002年;McLaren等人，2004年).

我们的实验表明，WT1（+KTS）可以促进带有保留内含子的RNA的表达。虽然在病毒中普遍观察到未切割和不完全剪接RNA的表达，但内含子保留似乎是植物中常见的选择性剪接形式(Ner-Gaon等人，2004年)，这种选择性剪接形式在高等生物中似乎相对罕见。事实上，关于哺乳动物mRNAs中保留内含子的蛋白质表达的验证报告很少。一个有明确记录的例子涉及螺旋-环-螺旋（HLH）转录因子Id家族的一些成员。具体来说，单个小内含子在识别码3血管损伤后的基因导致另一种蛋白质亚型的表达，这种亚型似乎是剪接RNA表达的蛋白质的调节剂(Matsumura等人，2001年;Forrest等人，2004年). 这可能特别相关，因为最近的一项研究表明，WT1（+KTS）亚型的缺失会影响MASH1的表达，MASH1是早期神经发生所需的HLH转录因子(Wagner等人，2005年). 然而，未观察到对MASH1转录的影响，导致Wagner等人（2005）假设转录后效应。自从MASH1号机组基因，比如身份证件包含单个小内含子的基因，确定+KTS蛋白对MASH1号机组表达与内含子保留有关。

WT1（−KTS）是WT1的“转录因子”亚型，在不存在WT1（+KTS）的情况下，WT1可以略微增加CTE相关RNA的RNA水平和蛋白质表达。相反，WT1（−KTS）的表达明显抑制了WT1（+KTS）对CTE功能的增强。这可能是由于先前证明的WT1蛋白通过其N末端结构域形成异二聚体的能力(Englert等人，1995年;Moffett等人，1995年;Reddy等人，1995年;Bruening等人，1996年). 为了支持这一假设，初步实验表明，虽然WT1（+KTS）的N末端缺失突变体仍然可以增强CTE功能，但WT1（−KTS）蛋白不再抑制其表达（Y.-c.Bor、D.Rekosh和M.L.Hammarskjöld，unpubl.）。与这一发现一致的是，在爪蟾卵母细胞取消了WT1（+KTS）在B-神经肽体中的定位，但前提是存在N末端(Ladomery等人，2003年).

WT1（+KTS）与转染293T细胞中的多核糖体相关，这与其增强mRNA翻译的能力一致。最近在猴COS细胞中也报道了这种亚型与多核糖体的关联(Niksic等人，2004年). 然而，Niksic等人（2004）还发现WT1（−KTS）亚型与多核糖体相关。这就提出了一个难题，因为我们的数据清楚地表明，只有WT1（+KTS）亚型才能增强CTE mRNA中GagPol的表达。需要进一步的实验来解决WT1（−KTS）蛋白在翻译调节中的潜在作用。这可能是因为WT1（−KTS）与WT1（+KTS）具有不同的靶点集，或者它作为翻译阻遏物发挥作用。在我们的实验中，用15 mM EDTA处理后，在含有核糖体亚基的组分中发现了+KTS蛋白，这表明WT1可能在翻译过程中与核糖体蛋白直接相关。或者，当多核糖体被破坏时，该蛋白可以简单地与mRNP复合物结合，沉积在这些组分中。

WT1（−KTS）是一种已被证明具有转录调节作用的蛋白质，其功能是抑制WT1（+KTS）的转录后效应，这一事实表明，WT1（+KTS）存在一种有趣的可能性，即选择性剪接工作任务1可能有助于协调转录和转录后事件的调控。一种可能性是，在转录水平上受WT1（−KTS）调控的基因在转录后也受到WT1（+KTS）的调控。另一种可能性是这两种蛋白质在转录和转录后水平上协调调节不同基因的表达。要解释这一点，需要确定WT1（+KTS）的基因靶点。虽然5A1序列明显起到细胞CTE的作用，并在与WT1（+KTS）的共免疫沉淀中被鉴定，但其生理相关性尚不清楚，因为尚未报道含有该序列的编码mRNA。更有趣的是，WT1（+KTS）也增强了最近在ACTN4中发现的CTE介导的表达。如上所述，已确定密切相关的ACTN1(Morrison等人，2006年)作为使用三混合系统的潜在WT1目标。这些结果，再加上ACTN4在肾功能中已确立的作用，表明WT1（+KTS）与CTEs可能调节肾细胞中的非肌肉α-肌动蛋白。

最近几年，越来越多的证据表明基因调控在转录后水平上的重要性，特别是在哺乳动物系统中。基因组项目表明，高等生物的复杂性很大程度上不是由于更多的基因，而是由于转录后水平上的选择性剪接和其他事件。Keene和Tenenbaum（2002）最初提出哺乳动物mRNA中的非翻译序列调控元件（USERcode）可以为转录后操纵子提供信号，使mRNA的某些亚群能够在发育和分化过程中协调表达以响应信号。事实上，WT1（+KTS）和Sam68（RNA结合蛋白）被认为在发育和分化中起着重要但不同的作用，两者都可以与含CTE的RNA相互作用，以增强转录后水平的表达，这进一步证明了这一假设的有效性。

材料和方法

质粒、细胞系和瞬时转染

本研究中使用的许多质粒以前都有描述(Jin等人，2003年). 表达全长小鼠WT1（+外显子5和+KTS；pHR3056）、WT1（+5和−KTS；p HR3057(Ladomery等人，1999年). WT1（+AAA）质粒（pHR3100），其中编码KTS基序的序列被突变为编码AAA，根据制造商的建议（Stratagene）通过进行QuikChange诱变来制备。测序证实了所需的突变。所有表达的WT1蛋白在N末端都含有T7标签。

维持并转染293T/17细胞，在转染后指定的时间收集转染细胞的上清液，并进行p24和SEAP分析，如前所述(Jin等人，2003年).

RNA分级和Northern印迹分析

之前描述了用于总RNA和细胞质RNA提取、poly（A）mRNA选择和Northern blot分析的方法(Jin等人，2003年)除了在一些实验中使用带正电荷的尼龙膜BrightStar-Plus（Ambion，Inc.）而不是NitroPlus 2000（Osmonics）。293T细胞在转染后65小时收获。HIV-1 BH10克隆的SacI–BglII片段（核苷酸682–2093）和人类SEAP cDNA的BamHI片段（核苷酸213–1698）被标记为[α-32P] dCTP使用Rediprime II Kit（GE Healthcare，Amersham Biosciences）。Northern印迹用分子动力学磷成像仪和ImageQuant分析软件定量。

35S标记和免疫沉淀

将转染的293T细胞用无蛋氨酸和半胱氨酸的Dulbecco改良Eagle培养基（Gibco/Invitrogen）洗涤两次，然后在37°C的含有200μCi的标记培养基中培养20分钟35S-转标记（ICN）和10%透析小牛血清。如前所述进行“Chase”实验和免疫沉淀(Jin等人，2003年).

多核糖体分析

聚核糖体分析基本上如前所述进行(Jin等人，2003年)除RNA实验外，转染细胞在转染后24小时分裂1/3。转染后48小时，细胞在37°C下暴露于50μg/mL环己酰亚胺30分钟。用含有50μg/mL环己酰亚胺的冷PBS洗涤细胞两次，并通过刮取收集。短暂离心后，将细胞颗粒重新悬浮在0.25 mL冷RSB缓冲液（pH 7.4、10 mM NaCl、3 mM MgCl下的10 mM Tris-HCl）中2)然后添加含有250 U RNasin（Promega）和额外0.25 mL RSB（含有1%Triton X-100、1%脱氧胆酸盐和2%吐温20）以溶解细胞。蔗糖梯度离心后，将10 ng 267 nt长的体外转录gag RNA片段添加到每个组分中，作为回收对照。然后在42°C下，用0.2 mg/mL蛋白酶K在0.5%十二烷基硫酸钠存在下培养30分钟，并用等量的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）萃取两次，用氯仿/异戊醇（49:1）萃取一次。通过添加30μL 3M醋酸钠（pH 5.2）和825μL 100%乙醇沉淀每个样品的RNA，并通过离心收集。用75%乙醇洗涤RNA颗粒，并用15.5μL RS缓冲液（2μL 10×MOPS，3.5μL 37%甲醛，10μL甲酰胺）在4μL水中重新悬浮。样品在55°C下孵育10分钟，在冰上冷却，然后装入含有甲醛的1%琼脂糖凝胶。

蛋白质印迹分析和抗体

如前所述进行Western blot分析(哈马舍尔德等人，1986年). 简言之，转染细胞的裂解物在15%SDS-PAGE中分离，并转移到Immobilon-P膜（Millipore）。为了检测T7标记的WT1蛋白，用1:5000稀释的小鼠抗T7单克隆抗体（Novagen）进行印迹。通常使用辣根过氧化物酶偶联第二抗体和增强化学发光系统（Amersham Biosciences）开发印迹。

致谢

我们感谢乔伊·莫格内格（Joy Morgenegg）提供的组织培养专家协助，以及亚历克斯·沃德（Alex Ward）对手稿的评论。这项工作得到了美国国立卫生研究院向M.-L.H提供的AI 34271和AI 054335，向D.R.提供的AI 47008，以及英国苏格兰国际癌症研究协会向M.R.L.提供的赠款02-025。弗吉尼亚大学的Charles H.Ross Jr.和Myles H.Thaler捐赠基金为M.L.H和D.R.提供了工资支持。

脚注

补充材料可在网址：http://www.genesdev.org.

文章在印刷前在线发布。文章和发布日期在线http://www.genesdev.org/cgi/doi/10.1101/gad.1402306

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来自的文章基因与发育由以下人员提供冷泉港实验室出版社