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植物细胞。2006年6月；18(6): 1360–1372.
数字对象标识：10.1105/tpc.106.041178
预防性维修识别码：PMC1475502型
PMID：16648367

DNA甲基化的维持拟南芥生命周期对父母印记至关重要[西]

波琳·朱利安,一 基诺西塔,b条 尼尔·奥哈德,c（c）和弗雷德里克·伯杰a、，1
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补充资料

摘要

印迹基因主要由父系或母系等位基因表达。迄今为止，在植物中识别的所有印记基因都在胚乳中表达。在拟南芥，Polycomb组基因的母体印记已被明确证明MEDEA公司(测量)和用于鱼类和野生动物管理局.的上游直接重复鱼类和野生动物管理局受到DNA甲基化的影响。然而，尚不清楚在多大程度上类似顺式-作用元件可能是控制母体印迹基因的保守分子机制的一部分。在这项工作中，我们表明Polycomb组基因施肥独立种子2(FIS2型)已刻印。的维护FIS2型印迹依赖于DNA甲基化，而DNA甲基化的缺失并不影响测量印记。DNA甲基化作用于FIS2型不同于与鱼类和野生动物管理局。我们证明了这一点鱼类和野生动物管理局和FIS2型印迹需要在植物的整个生命周期中保持DNA甲基化，包括雄性配子发生和胚乳发育。因此，我们的数据表明，植物中的亲本基因组印记取决于顺式-依赖于或不依赖于DNA甲基化的元件和机制。我们认为，印记是在与植物繁殖进化相关的限制条件下进化的，而不是通过选择特定的分子机制。

简介

开花植物的繁殖以双重受精为特征，包括两个相同的精子细胞和两个雌性配子，即卵细胞和中央细胞。卵细胞的受精导致胚胎的发育，而第二个精子细胞独立地使中央细胞受精，形成胚乳(Guignard，1899年;马赫什瓦里，1950年;伯杰，2003). 胚乳控制着母体营养物质向发育中的胚胎的供应，不会为下一代提供遗传物质。在拟南芥和玉米(Zea mays公司)，仅在胚乳中检测到亲本印记表达，其中一些基因仅表达于父系或母系等位基因(伯杰，2004;Gehring等人，2004年;Köhler和Grossniklaus，2005年). 在拟南芥，利用等位基因特异性RT-PCR对父亲表达的基因进行印记PHERES1型(Köhler等人，2005年)和母体表达的基因鱼类和野生动物管理局(Kinoshita等人，2004年)和MEDEA公司(测量) (Kinoshita等人，1999年;Vielle-Calzada等人，1999年).鱼类和野生动物管理局和测量既不在营养发育期也不在雄性配子发生期表达。在雌性配子发生期间，鱼类和野生动物管理局和测量变得转录活性，这两个基因都在中央细胞中特异表达(Choi等人，2002年;Kinoshita等人，2004年). 受精后，只有鱼类和野生动物管理局和测量在胚乳发育期间表达，而父系等位基因保持沉默。

因此，基因印记是父亲等位基因沉默和母亲等位基因表达激活共同作用的结果。沉默鱼类和野生动物管理局父系等位基因可能与DNA甲基转移酶MET1介导的5′区直接重复序列中胞嘧啶残基的甲基化有关(Kinoshita等人，2004年). 转录活性鱼类和野生动物管理局胚乳中的母体等位基因以直接重复序列的去甲基化为特征。这种去甲基化可能发生在中心细胞中，可能是由DNA糖基化酶DEMETER（DME）的活性引起的。二甲醚会产生单链5′缺口，这种DNA断裂会被DNA修复机制识别，而DNA修复机制又会将甲基化的胞嘧啶残基替换为非甲基化的(Choi等人，2002年;Gehring等人，2006年). 基于以下方面的可用知识鱼类和野生动物管理局印记，可以为植物印记建立一个循环模型(伯杰，2004;Kinoshita等人，2004年). 根据模型，鱼类和野生动物管理局在营养期被MET1沉默。DME版本鱼类和野生动物管理局中央牢房里的沉默。受精后，激活的母亲鱼类和野生动物管理局等位基因由胚乳遗传并转录，而父系等位基因保持沉默，因为它是从雄配子中以非活性状态遗传的。MET1在雄性配子发生期间活跃(Saze等人，2003年)，但它参与了沉默鱼类和野生动物管理局雄性配子发生和胚乳发育过程中的父系等位基因尚未被证实。此外，尚不清楚鱼类和野生动物管理局印迹可以应用于其他印迹基因。

的规定测量压印已经过分析，但如下所述，机理控制测量印记尚不清楚。DME对于测量转录激活(Choi等人，2002年)和甲基化CpG残留物已在测量发起人(肖等人，2003;Gehring等人，2006年)，表明测量印迹是由DNA甲基化控制的，类似于鱼类和野生动物管理局DNA甲基化可以靶向假定的CpG岛和转座子测量基因座(肖等人，2003;Spillane等人，2004年). 然而，这些元素对于测量印记，正如相互矛盾的基因实验所表明的，这使人们对MET1在这一过程中的作用产生了怀疑(Vielle-Calzada等人，1999年;Luo等人，2000年;Vinkenoog等人，2000年;肖等人，2003). 虽然MET1可能在控制胚乳发育相关的几个基因的印迹中起调节作用(Adams等人，2000年)，直接参与控制测量印记仍有待测试。

除了DNA甲基化外，组蛋白甲基化最近被证明参与了测量压印(Gehring等人，2006年;Jullien等人，2006年)也可能控制PHERES1型，编码MADS盒转录因子(Köhler等人，2005年).测量印迹依赖于植物生命周期中活跃的多梳群复合物通过组蛋白3的Lys-27甲基化对其父系等位基因的转录抑制(Gehring等人，2006年;Jullien等人，2006年). 在胚乳中，PRC2复合物含有MEA(Grossniklaus等人，1998年;Kiyosue等人，1999年;Luo等人，1999年)VEFS域蛋白FERTILIZATION-INDEPENDENT SEED2（FIS2）是另外三种蛋白质的核心(Luo等人，1999年)WD40蛋白受精独立胚乳（FIE）(Luo等人，1999年;Ohad等人，1999年)和IRA1的WD40蛋白多拷贝抑制物（MSI1）(科勒等人，2003年;Guitton等人，2004年). 变种人我的意思是,五,msi1型、和财务报表2胚乳表现出类似的母体缺陷，因此，外商投资企业,MSI1系列、和FIS2型预计会受到一种或多种调节印记的遗传机制的影响，包括针对测量(Chaudhury等人，1997年;Grossniklaus等人，1998年;Kiyosue等人，1999年). 还支持印记的参与外商投资企业和FIS2型由母体单等位基因表达的转录报告子FIE–绿色荧光蛋白(GFP公司) (Yadegari等人，2000年)和FIS2–β-葡萄糖醛酸酶(GUS公司) (Luo等人，2000年)分别是。然而，这种转录控制可能只影响相应的转录报告者。胚乳中的沉默是指插入多个位点的报告基因结构的父本拷贝，这导致了受精后第一天父本基因组的整体沉默假说(Vielle-Calzada等人，2000年). 或者，与功能丧失突变相关的母体效应可能源于雌配子体的异常发育或剂量效应。因此FIS2型,外商投资企业、和MSI1系列目前尚不清楚。

在这项工作中，我们表明FIS2型受到父母基因组印记的影响。我们详细研究了DNA甲基化在基因转录控制中的作用FIS2型和测量并得出结论，它们是不同的。我们确定了一个顺式-的上游元件FIS2型这是MET1的目标。此元素可能与控制FIS2型印记。使用遗传方法，我们研究了MET1在整个生命周期中控制FIS2型和鱼类和野生动物管理局印记。为此，我们研究了MET1功能丧失对营养发育阶段的影响（使用MET1as公司MET1功能丧失的影响仅限于配子发生阶段（表1-3/+线路）。基于我们的结果，我们提出了一个修正的植物MET1依赖印迹周期模型。

结果

FIS2型表达受DNA甲基化依赖性印迹控制

调查FIS2型，我们在FIS2型不同野生型材料之间的编码序列，以区分每个亲本等位基因的转录物（等位基因特异性RT-PCR）(图1A). 我们对野生型材料C24和哥伦比亚（Columbia，Col）杂交产生的种子进行了等位基因特异性RT-PCR。人们会期望，如果FIS2型未压印，应检测到两份抄本。与这个假设相反，我们只观察到母体的表达FIS2型成绩单(图1A). 我们观察到FIS2型授粉后5天（DAP）（见在线补充图1）。产妇FIS2型在发育中的种子中可以检测到储存在胚珠中并在受精后遗传的转录物，并模拟印记状态。然而，这种储存的母体转录物不太可能在5 DAP时仍然存在。很可能我们检测到的转录物来自FIS2型胚乳中的母体等位基因。对于多达4个DAP的胚乳表达基因的报告者，已观察到假定的一般父亲沉默(Vielle-Calzada等人，2000年). 可以假设，这种一般机制也会影响胚乳中表达基因在基因组位点的表达。在研究的所有发育阶段，我们观察到迷你3(图1A)，该基因仅在前3个DAP期间在胚乳中表达(Luo等人，2005年). 这些结果和其他(伯杰，2003;Kinoshita等人，2004年)表明胚乳中表达的基因没有普遍的父系沉默FIS2型单等位基因表达是由特定的沉默机制引起的。与这些发现一致，Luo等人（2000）之前显示FIS2-GUS公司翻译报告基因只在胚乳中由母体等位基因表达。我们的结论是FIS2型基因被印记。

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FIS2型印记由DNA甲基化控制。

（A）在野生型Col和野生型C24之间进行杂交后，在0.5、1.5和3 DAP下获得从西力克中提取的RNA的等位基因特异性RT-PCR。在中删除180-bpFIS2型野生型登录Col的编码序列允许区分ColFIS2型来自FIS2型入世抄本C24。只有FIS2型母体等位基因在发育中的种子中表达。相比之下，迷你3由双亲等位基因表达。

（B）野生型胚珠和花粉杂交后在4 DAP获得的角果中提取的RNA的等位基因特异性RT-PCR金属1-3/金属1-3植物（Col）在整个生命周期中表现出维持DNA MET1的活性降低。与野生型杂交相比FIS2型父系等位基因在发育中的种子中表达，这些种子从金属1-3/金属1-3植物。

（C）野生型植物与野生型植物相互杂交后5 DAP获得的西力克RNA的等位基因特异性RT-PCRMET1as公司植物。这个FIS2型当花粉由MET1as公司植物，在营养发育阶段表现出维持DNA MET1活性降低(Finnegan等人，1996年).

（D）野生型植物与组蛋白甲基化或DNA甲基化受影响的不同突变体杂交后，在5 DAP时获得从西力克中提取的RNA的等位基因特异性RT-PCR。在中删除180-bpFIS2型野生型登录Col的编码序列允许区分ColFIS2型来自FIS2型材料中的转录本C24，Landsberg直立人（升呃)和Wassilewskija。C24表示为控件。只有母体等位基因FIS2型在野生型和纯合子突变体之间的相互杂交产生的种子中表达，用于控制DNA甲基化的其他途径拟南芥cmt3(Lindroth等人，2001年)和数字资源1和干重2(Cao和Jacobsen，2002年a). KYP甲基化组蛋白3 Lys-9残基(Jackson等人，2002年;塔里克等人，2003年)而含有FIE甲基化组分3 Lys-27残基的Polycomb基团复合物(Bastow等人，2004年).

指出了父系（p）和母系（m）等位基因。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH公司)用作加载控件。进行了No-RT对照分析，但未显示数据。

我们调查了MET1在FIS2型印记。为此，我们使用了功能丧失等位基因金属1-3在Col背景中(图1B). 避免近交系的非特异性累积效应满足1功能丧失线路(Saze等人，2003年;肖等人，2006年)，我们隔离了金属1-3/金属1-3来自自花繁殖隔离种群的植物金属1-3/+植物。MET1活性缺失导致的父系等位基因表达FIS2型野生型雌性胚珠和金属1-3花粉(图1B). 为了评估MET1活性在植物发育过程中的影响，我们使用了MET1as公司植物在营养组织中产生反义MET1 mRNA，导致对称CpG位点上70%的DNA甲基化缺失(Finnegan等人，1996年). 我们观察到，在营养发育过程中MET1活性的丧失导致了FIS2型野生型雌性胚珠和MET1as公司花粉(图1C). 我们得出结论FIS2型直接或间接依赖MET1。DNA甲基化通过复制以半保守的方式传播(Finnegan等人，2000年). 因为在MET1as公司线MET1型反义RNA仅在营养发育过程中产生，我们认为FIS2型在营养发育过程中，胚乳被带入胚乳，导致印记丢失。DNA甲基化可能与控制其他表观遗传标记的机制相互作用(塔里克等人，2003年;Chan等人，2005年;武田和帕斯科夫斯基，2006年;Vire等人，2006年)，以及金属1-3和MET1as公司可能是间接的。因此，我们测试了是否可能涉及其他表观遗传学机制，包括DNA甲基化和组蛋白甲基化。域重组甲基转移酶DRM1和DRM2控制从头甲基化(曹和雅各布森，2002a)和植物特有的色甲基化酶3（CMT3）在不对称位点保持甲基化(Lindroth等人，2001年;曹和雅各布森，2002b). 这些基因中的功能丧失突变体不影响FIS2型压印(图1D). 转录基因沉默也受组蛋白H3甲基化的调控。在拟南芥组蛋白H3的Lys残基Lys-9和Lys-27被KYPTONITE（KYP）甲基化(Jackson等人，2002年)和Polycomb群复合物(Bastow等人，2004年;Jullien等人，2006年)分别是。FIS2型野生型胚珠和功能丧失的突变体花粉之间的杂交没有改变印迹基普或来自外商投资企业共抑制植物(Katz等人，2004年) (图1D). 由于我们无法发现与DNA甲基化维持相关的表观遗传标记丢失的任何影响，我们得出结论，MET1直接沉默FIS2型.

DNA甲基化靶向CpG-富集区上游FIS2型基因

MET1活性丧失导致异位表达鱼类和野生动物管理局，如前所述(Saze等人，2003年;Kinoshita等人，2004年)但令人惊讶的是，它并没有导致FIS2型在营养组织中(图2A). 胚乳特异性转录激活物的缺失可以解释胚乳中异位表达的缺失FIS2型植物人的满足1组织。然而，我们假设MET1功能的丧失会导致FIS2型基因组序列。为了验证这个假设，我们分析了FIS2型在叶片组织中。使用甲基化敏感限制性内切酶麦克尔BC，我们确定了一个受DNA甲基化影响的区域(图2B). 此外，亚硫酸氢盐测序分析确定了FIS2型由200-bp结构域组成，其中大多数CpG位点被甲基化（30个，共38个）(图2C; 参见在线补充图2）。年，该地区CpG残基的甲基化严重减少金属1-3纯合子突变叶片（见在线补充图2）。我们得出结论，MET1靶向5′区的一个特定元素，该元素可能控制FIS2型叶片、花粉和胚乳中的沉默。

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MET1靶向位于FIS2型地点。

（A）RT-PCR分析表明印迹基因鱼类和野生动物管理局和FIS2型在野生型加入Col的营养组织中不表达金属1-3纯合子突变植物导致鱼类和野生动物管理局但不是的FIS2型在树叶中。金属1-3/+植物，没有显示鱼类和野生动物管理局，用于图5A.GAPDH公司用作加载控件。

（B）甲基化敏感限制性内切酶分析DNA甲基化麦克尔野生型Col叶片中的BC在FIS2型.对麦克尔BC在金属1/金属1背景，这表明MET1控制−3104到−1867区域的DNA甲基化。鱼类和野生动物管理局MET1甲基化的重复序列被用作对照(Kinoshita等人，2004年).

（C）亚硫酸氢盐测序FIS2型5′区，包含一个200 bp的结构域，该结构域富含主要在CpG上的甲基化胞嘧啶残基（完整序列见在线补充图2）。用玫瑰花叶的基因组DNA进行分析。的结构FIS2型描述了基因组序列，起始密码子用0表示。外显子用黑框表示，5′和3′非翻译区用白框表示。部分平移融合的程度FIS2-GUS公司在示意性基因组结构下方指示。

激活FIS2型中心细胞中二甲醚的母体等位基因

调查DME在以下方面的作用FIS2型我们测试了二甲醚功能丧失FIS2型表达式。为此，用从芽和花中提取的mRNA进行RT-PCR实验，其中二甲醚被证明是表达(Choi等人，2002年). 我们曾经鱼类和野生动物管理局作为操作的控件二甲醚-4等位基因，独立于其他二甲醚等位基因(Guitton等人，2004年).鱼类和野生动物管理局在受精前后以野生型表达(Kinoshita等人，2004年)，而在二甲醚-4，大幅减少鱼类和野生动物管理局观察到转录(图3A)，如前所示二甲醚-1(Kinoshita等人，2004年). 同样，二甲醚-4导致减少FIS2型表达式(图3A)，但水平FIS2型表达仅部分减少。有限的减少FIS2型表达式二甲醚-4通过分析FIS2-GUS公司其中包括大多数FIS2型基因座，仅在野生型胚乳中母体表达(图2C) (Luo等人，2000年). 自花授粉FIS2-GUS公司/FIS2-GUS公司,二甲醚-4/二甲醚植物，所有胚珠都会遗传FIS2-GUS公司50%的人继承了二甲醚-4突变。因此，我们观察到FIS2-GUS公司在50%的胚珠中表达二甲醚-4预计会出席(图3B至3D)与野生型胚珠相比(图3B和3E). 然而，一半二甲醚-4与野生型胚珠相比，胚珠中报告基因的表达水平仍然较低(图3B和3D). 受精后，我们观察到FIS2-GUS公司胚乳中的表达，继承了母体二甲醚-4(图3B). 纯合子二甲醚-4/二甲醚-4突变体是可行的(Guitton等人，2004年)，而dme-2/dme-2导致种子发育停滞(Choi等人，2002年). 因此，部分减少了FIS2型中的表达式二甲醚-4背景可能是由于二甲醚-4突变。然而FIS2-GUS公司用强等位基因获得表达二甲醚-2(Choi等人，2002年) (图3B). 我们的结论是二甲醚是表达式所必需的FIS2型在中央细胞和胚乳中。坚持FIS2型用分数表示二甲醚胚珠可以通过DME的冗余功能或足以克服DNA甲基化抑制作用的额外激活机制来解释。

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母体控制FIS2型DME表示。

（A）对芽（11和12期）和花（13期）的mRNA进行RT-PCR分析(Smyth等人，1990年)表现出缺乏鱼类和野生动物管理局表达和简化FIS2型中的表达式二甲醚-4纯合突变体与野生型C24的比较。GAPDH公司用作控件。

（B）到（E）的影响二甲醚在FIS2-GUS公司表达式。

（B）表达FIS2-GUS公司报告器构造二甲醚-2/+和二甲醚-4/+授粉前（BP）和授粉后2天。观察到三种不同的类型：无表达（白色）、少量表达（浅蓝色）和野生型表达（深蓝色）。误差条对应于标准偏差与每组测量值关联。

（C）到（E）显示三类FIS2-GUS公司中的表达式二甲醚-4/+突变背景：无表达（白色；[中])，表情少（浅蓝色；【D】)和野生型表达（深蓝色；[英]). 棒材=20μm。

的印记鱼类和野生动物管理局和FIS2型在雄性配子发生过程中，胚乳中需要MET1保持沉默

与雌性配子发生相反，雄性配子发生并不促进鱼类和野生动物管理局,FIS2型、和测量(Luo等人，2000年;Kinoshita等人，2004年). 我们已经调查了鱼类和野生动物管理局和FIS2型在雄性配子发生期间维持。的表达式MET1型通过转录组分析在花粉中检测到(Honys和Twell，2004年)有证据表明MET1在雄性配子发生期间沉默外源转录报告子(Saze等人，2003年). 因此，我们测试了MET1型函数影响了鱼类和野生动物管理局和FIS2型花粉和胚乳中的父系等位基因。为此，我们使用了杂合子金属1-3/+仅在配子发生期间表现出MET1活性降低的植物。在金属1-3/+植物，突变体满足1等位基因由一半小孢子遗传，小孢子在两次细胞分裂后在花粉粒中发育(麦考密克，2004年). 生殖细胞有望继承一个半甲基化的拷贝，并进一步分裂产生两个雄性配子，其中基因组DNA被去甲基化(图4A). 因此，我们观察到转录报告子的异位表达FWA-GFP公司将花粉与金属1-3/+,FWA-GFP/FWA-GFP公司植物(图4B)（含花粉量的47.4%FWA-GFP公司荧光，标准偏差= 6.7,n个= 1372). 的表达式FWA-GFP公司在精子中观察到，这表明满足1花粉粒能够提供转录活性FWA-GFP公司副本(图4B，插图）。

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的维护FIS2型和鱼类和野生动物管理局雄性配子发生时沉默。

（A）在花粉发育期间金属1-3/+植物减数分裂产生的一半单倍体小孢子继承了金属1-3突变，另一半继承野生型MET1型等位基因。所有小孢子都继承了基因组的甲基化副本（灰色矩形）。DNA复制金属1-3小孢子从甲基化模板（灰色/白色矩形）产生半甲基化DNA。半甲基化DNA在有丝分裂后由营养核（V）和生殖细胞核（G）遗传，生殖细胞核第二次分裂产生两个精子细胞（S）。分裂后，一个精子细胞继承了一个完全去甲基化的DNA拷贝（白色矩形），另一个精子继承了半甲基化DNA。营养核不参与受精。在精子成熟过程中，DNA复制(Durbarry等人，2005年)受精时，所有来自金属1-3小孢子预计至少含有一个半甲基化拷贝。

（B）从FWA-GFP/FWA-GFP公司,金属1-3/+植物（共聚焦截面）。插图是表达FWA-GFP公司在营养细胞（V）和两个精子细胞中。棒材=5μm。

（C）异位表达鱼类和野生动物管理局和FIS2型通过RT-PCR观察从雄蕊中纯化的RNA。GAPDH公司用作对照以评估相等量的RNA负载。DUO1型在花粉中特异性表达(Rotman等人，2005年)并用于花粉mRNA提取的质量控制。

我们的细胞学观察得到RT-PCR实验的支持，该实验显示鱼类和野生动物管理局从雄蕊中提取的mRNA群体金属1-3/+植物(图4C). 因此，我们使用金属1-3/+植物是否丧失功能MET1型在雄性配子发生期间鱼类和野生动物管理局胚乳中的父系等位基因。野生型胚珠和金属1-3/+花粉，鱼类和野生动物管理局从父系和母系等位基因中检测到转录物(图5A; 注意，Col的多态性由双带表示）。因此FWA-GFP公司在野生型胚珠和花粉杂交产生的种子胚乳中表达金属1-3/+,FWA-GFP/FWA-GFP公司植物(图5C) (46.7%,标准偏差= 5.2,n个= 358). 相反，当FWA-GFP公司来自父亲的野生型背景(图5B;n个= 126) (Kinoshita等人，2004年). 我们得出结论，在配子发生过程中，MET1维持鱼类和野生动物管理局沉默等等鱼类和野生动物管理局在雄性配子发生期间，胚乳中的印记需要MET1活性。这个测量父系等位基因印在胚乳中(Kinoshita等人，1999年;Vielle-Calzada等人，1999年)在授粉后的第一天主要由其母体等位基因表达(Jullien等人，2006年). 我们测试了MET1对测量胚乳中父系等位基因的表达。测量在野生型胚珠和金属1-3/+花粉。在这些杂交中，我们发现母性占优势测量等位基因表达，这与用野生型雄性材料进行杂交时获得的结果相似。我们的结论是测量雄性配子发生过程中DNA甲基化的丢失不会影响印记(图5D). 最近独立获得了类似的结果(Gehring等人，2006年). 因此，MET1似乎在测量与其在鱼类和野生动物管理局和FIS2型压印。

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的印记鱼类和野生动物管理局和FIS2型在雄性配子发生过程中，胚乳依赖于保持沉默。

的压印状态鱼类和野生动物管理局,测量、和FIS2型在野生型胚珠和金属1-3/+植物。

（A）等位基因特异性RT-PCR检测鱼类和野生动物管理局野生型胚珠（L呃附加物）和花粉金属1-3/+植物。（对于Col登录，由于限制性多态性的消化是部分的，因此获得了两条带；最低的带是Col特异性的[3 DAP]。）我们使用金属1-3/+植物，不表达鱼类和野生动物管理局在植物组织中（参见图2A). 尽管在野生型L之间杂交呃Col只表现出母体的表达鱼类和野生动物管理局等位基因鱼类和野生动物管理局父系等位基因在与金属1-3/+花粉。

（B）和（C）因此，在2 DAP时FWA-GFP公司报告者由来自金属1-3/+植物（C）但不是来自野生植物（B）.

（D）对野生型材料RLD和Col的杂交进行等位基因特异性RT-PCR检测到母体的表达测量等位基因，典型的测量压印（1 DAP）。测量如果金属1-3/+植物提供了测量父系等位基因。

（E）野生型材料C24和Col之间的杂交只在母体中表达FIS2型典型等位基因FIS2型野生型胚乳中的印记状态。相比之下，等位基因特异性RT-PCR显示FIS2型野生型C24胚珠和金属1-3/+植物（Col加入；3 DAP）。

（F）到（J）去除胚乳后胚乳发育的挽救FIS2型父系等位基因印迹金属1-3花粉。

（F）和（H）增强子陷阱标记KS117的GFP荧光在小麦胚乳中均匀增加财务报表2纯合突变体（F）与野生型相比（H）在5DAP时仅限于胚乳后极。

（G）授粉后fis2/fis2，KS117/KS117通过花粉从金属1-3/+在植株中，一半的种子表现出KS117的表达模式，类似于野生型胚乳中的KS117模式（星号）。这些种子还显示了细胞学改变在财务报表2胚乳([我]和[日本]).

（一）由财务报表2其特征是合胞体胚乳没有细胞化，与胚胎相对的后极增大(Guitton等人，2004年).

（J）19%的种子通过杂交获得了这种表型性状的挽救fis2/fis2植物和金属1-3/+花粉。

棒材=50μm(【B】,[中],[我]、和[日本])和200微米([女]到【H】).GAPDH公司用作RT-PCR分析的对照([答],【D】、和[英]).

同样，我们测试了满足1雄性配子发生过程中的功能丧失FIS2型花粉沉默，胚乳印迹。FIS2型在来自金属1-3/+植物(图4C). 野生型胚珠的授粉金属1-3/+植物引起了FIS2型胚乳中的父系等位基因(图5E)，这表明FIS2型雄性配子发生期间MET1沉默是必需的FIS2型印记。此前，研究表明财务报表2功能丧失等位基因导致胚乳发育的主要缺陷，包括KS117标记的过度表达(Sörensen等人，2001年). 此外，胚乳由财务报表2母亲在合胞阶段未能细胞化(Chaudhury等人，1997年). 在交叉点之间财务报表2胚珠和满足1花粉，野生型FIS2型父系等位基因被激活满足1并有望挽救产妇失去功能财务报表2等位基因。接下来我们测试了是否金属1-3/+植物的去甲基化表达的父系等位基因FIS2型足以拯救失活的突变体财务报表2等位基因是发育胚乳的母体。杂合的满足1-3/+工厂生产50%满足1花粉。通过与来自金属1-3/+植物和fis2/fis2，KS117/KS117植物用作雌性(标准偏差= 5.3,n个= 459) (图5G). 在这些杂交中，19%的种子表现出与野生型种子相似的细胞胚乳(标准偏差= 5.1,n个= 365) (图5J). 因此，满足1花粉发育过程中功能的丧失足以消除抑制性表观遗传标记FIS2型父系等位基因，在胚乳中保持活性。

我们得出结论，MET1活性对于维持FIS2型和鱼类和野生动物管理局在雄性配子发生期间。如果花粉发育过程中MET1活性缺失，精子细胞会将转录活性的父系等位基因传递给胚乳，并在胚乳上印记FIS2型和鱼类和野生动物管理局胚乳受损。的规定测量印记似乎依赖于独立于MET1的独特调节机制。相反，最近的证据支持这样一种观点：测量沉默依赖于Polycomb基团复合物的组蛋白甲基化(Gehring等人，2006年;Jullien等人，2006年).

沉默需要MET1鱼类和野生动物管理局胚乳中的父等位基因

我们已经证明了这一点FIS2型和鱼类和野生动物管理局胚乳中的印记状态要求受精前MET1活性。然而，受精后和胚乳发育期间对MET1的需求尚未见报道。虽然父亲FWA-GFP公司副本由提供满足1花粉在胚乳中表达，其表达在2-4DAP之间信号强度逐渐降低(图6A至6C)6 DAP后逐渐无法检测到（数据未显示）。我们假设这是由于父亲的沉默FWA-GFP公司母体提供的MET1活动副本满足1/+胚乳。根据这个假设MET1型在里面金属1/金属1胚乳有望维持父亲提供的FWA-GFP公司.传输金属1-3通过雄性和雌性配子遵循孟德尔比例（见在线补充表1），我们预计产量为25%金属1/金属1杂交中的种子满足1/+植物。我们在金属1-3/+植物和花粉满足1/+,FWA-GFP公司/FWA-GFP公司植物，占25%金属1/金属1种子和25%满足1/+带有父系FWA-GFP拷贝的种子满足1花粉。我们观察到两类不同的种子表达FWA-GFP公司中的任意一个金属1-3/+或在中金属1/金属1胚乳。四分之一的种子表现出较低的表达水平，与满足1/+胚乳(图6D和6E)，另外四分之一的种子显示高水平的FWA-GFP公司4 DAP时的表达(图6D和6F). 考虑到每个种子类的孟德尔比例，后一类可能对应于金属1/金属1胚乳无MET1活性，其中去甲基化的FWA-GFP公司父系复制没有发生。这些结果表明，MET1持续需要用于父亲沉默鱼类和野生动物管理局胚乳发育过程中保持等位基因鱼类和野生动物管理局刻印状态。

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的维护鱼类和野生动物管理局胚乳中的印记依赖于MET1。

（A）在2 DAP时，野生型胚珠与来自金属1-3/+,FWA-GFP/FWA-GFP公司植物，父系提供的等位基因的表达FWA-GFP公司在一半种子的胚乳中观察到。

（B）和（C）强度FWA-GFP公司在胚乳发育过程中，表达量从2 DAP开始下降（B）至4 DAP（C）.

（D）与之相反FWA-GFP公司父系表达金属1-3/+胚乳，四分之一的种子表达FWA-GFP公司胚珠间杂交的父系等位基因金属1-3/+植物和花粉携带金属1-3/+和FWA-GFP/FWA-GFP公司.

（E）和（F）四分之一的种子表达低水平的FWA-GFP公司 （E）并被认为是杂合子金属1-3。另外四分之一的种子表现出较高的持续表达FWA-GFP公司 （F）并且可能是纯合子金属1-3在胚乳中。

棒材=80μm(【B】,[中],[英]、和[女]). 每个杂交的种子数显示在每个横条的上方。标准偏差为每个测量显示。HO，纯合子。

讨论

的印记FIS2型和鱼类和野生动物管理局雄性配子发生过程中MET1活性的依赖

我们已经证明了这一点FIS2型在胚乳中经历单等位母体表达。当一个基因在受精后表达并且主要来自其两个亲本等位基因之一时，该基因被认为是印记的(Vielle-Calzada等人，1999年). 我们检测到FIS2型授粉后5天的母体转录本表明FIS2型父系等位基因可以在胚乳中表达满足1配子发生功能的丧失。因此，FIS2型在受精后积极转录，并且仅从其母体等位基因表达。我们的结论是FIS2型是母体表达的印记基因。MET1活性在胚乳发育过程中对于持续沉默父本鱼类和野生动物管理局。我们预计FIS2型胚乳中MET1活性的父系等位基因沉默。总之，当去除MET1活性时，如金属1-3突变体，MET1依赖性印迹基因的表达维持在两个亲本等位基因的野生型时间表之外。

在营养发育过程中，MET1在特定位点的连续DNA甲基化维持了双亲的沉默鱼类和野生动物管理局和FIS2型等位基因。印记基因在雌配子成熟期间表达，而在雄配子发生期间保持沉默。配子中基因表达的这种不平衡预示着受精后胚乳中的印记。在中心细胞中，通过糖基化酶DME介导的DNA去甲基化可以消除胚乳中表达的印记基因的沉默。这是为显示的鱼类和野生动物管理局(Kinoshita等人，2004年)，我们的数据表明DME也作用于FIS2型以及其他未知的激活物，因为FIS2型表达式在中仅被部分抑制二甲醚胚珠。我们已经证明，MET1在雄性配子发生过程中需要维持鱼类和野生动物管理局和FIS2型沉默。这为MET1在雄性配子发生过程中所起的作用提供了一个例子，最初是通过外源报告子结构来证明的(Saze等人，2003年). 此外，我们还发现精子细胞缺乏满足1提供激活的FIS2型父系等位基因，能够修复由母系提供的胚乳缺陷财务报表2无效等位基因。总之，印迹是精子细胞中DNA甲基化维持的结果，而女性配子中的DNA甲基化被去除了(图7). 因此，我们的模型扩展并补充了先前提出的模型(伯杰，2004;Kinoshita等人，2004年).

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植物DNA甲基化对亲本基因组印记的双重控制模型。

基因FIS2型和鱼类和野生动物管理局MET1的持续作用使其沉默，MET1将甲基化（粉红色圆圈）靶向每个基因特定启动子中的一个元素。MET1依赖性沉默FIS2型和鱼类和野生动物管理局在营养期、雄性配子发生和胚乳发育期间，当它保持父系（p）等位基因沉默时，需要。FIS2型和鱼类和野生动物管理局在雌性配子发生过程中，DNA糖苷酶DME激活了表达，导致受精后胚乳中的母体（m）等位基因表达。在胚乳中，父本通过MET1的持续作用保持沉默，而母本是活跃的，导致印记表达。

同样，在哺乳动物中，配子发生过程中DNA甲基化的功能丧失导致小鼠缺乏印记（负责沉默的表观遗传标记）(Monk，1990年;金田等人，2004年). 因此，在配子发生过程中，哺乳动物和植物的印记基因都需要关键步骤，但印记的建立是通过不同的DNA甲基化机制进行的。与植物相比，哺乳动物生殖系中发生了广泛的去甲基化，并擦除了亲本印记(Delaval和Feil，2004年). 印记是通过一种特异的从头DNA甲基转移酶在雄性和雌性生殖系中重建的(金田等人，2004年)而不是像在开花植物中那样通过维持DNA甲基转移酶。

MET1控制中的印记拟南芥通过Diverse顺式-元素

尽管在拟南芥，我们表明不同基因的印迹机制是不同的。我们的结果表明，MET1在FIS2型和鱼类和野生动物管理局印记，但在某些方面测量印迹似乎并不严重依赖于MET1。沉默测量父系等位基因不是由MET1介导的，而是取决于由Polycomb群复合物介导的组蛋白甲基化的持续作用(Gehring等人，2006年;Jullien等人，2006年). 然而，母体等位基因的激活测量取决于MET1依赖的DNA甲基化的去除(Gehring等人，2006年). 然而，尚不清楚二甲醚是否也会导致多梳组依赖性组蛋白甲基化标记的去除。关于测量印迹也可能涉及DDM1，一种SWI2/SNF2因子，它干扰测量功能(Vielle-Calzada等人，1999年)与DNA甲基结合蛋白相互作用(Zemach等人，2005年).

MET1被证明靶向鱼类和野生动物管理局并规范其印记(Kinoshita等人，2004年)尽管这两个事件之间的直接联系仍有待证明。其他消音机制涉及鱼类和野生动物管理局(Chan等人，2004年)，但尚不清楚他们是否控制鱼类和野生动物管理局印记。上游FIS2型编码序列，通过生物信息学分析，我们既不能检测到重复序列，也不能检测到转座子，这成功地检测到了测量发起人(Spillane等人，2004年). 相反，我们表明甲基化被定向到FIS2型编码序列。在一个玉米同源物的上游检测到一个假定的MET1靶向控制元件外商投资企业也印在胚乳中表达(Danilevskaya等人，2003年). 该元件由CpG富集序列组成顺式-中标识的元素拟南芥对于FIS2型。根据有限的可用数据，我们可以得出结论，开花植物的印迹依赖于几种类型的顺式-元件和几个消音机制。越来越清楚的是，哺乳动物的印迹并不依赖于单一类型的表观遗传转录调控。涉及DNA甲基转移酶的维持和从头开始，以及Polycomb组的活动。

DNA甲基化靶向印迹控制区中的几种类型的元素，这可能与改变的转座元件和CpG富集区有关(Constancia等人，2004年;Delaval和Feil，2004年). 多样性顺式控制元件和反式-在开花植物和哺乳动物中发现的印迹作用机制与某些印迹靶点的功能相对相似形成对比。在开花植物中鉴定的大多数印记基因在胚乳发育中起着重要作用，从而间接控制发育中种子的胚胎营养。在动物身上，一些印记基因被发现在繁殖中具有重要功能，并影响母亲与发育中的胚胎或婴儿之间的相互作用(Constancia等人，2004年). 因此，印记的进化很可能不依赖于分子表观遗传机制的选择，而更可能源于与生殖创新相关的生物限制。选择性机制可能使用了可用的消声机制和目标电位顺式-一些对生殖很重要的基因的位点上已经存在元素。这个进化过程最终导致了多样性的实际状态顺式和反式与压印相关的控制元件。

方法

植物材料和生长条件

这个MET1型反义线拟南芥由J.Finnegan提供(Finnegan等人，1996年). 该品系的特征是CpG甲基化缺失70%，并且MET1反义在营养二倍体组织中起主导作用。由于这条线是通过自交维持的，它可能积累了未知性质的表突变，这可能会干扰我们的实验。因此，对于大多数实验，我们使用金属1-3J.Paszkowski提供的（Col）线(Saze等人，2003年)并注意宣传金属1-3系为杂合子。纯合子突变体厘米t3,数字资源1,干重2、和基普（升呃)来自S.E.Jacobsen的实验室(Lindroth等人，2001年;Cao和Jacobsen，2002年a;Jackson等人，2002年). 突变体二甲醚-2（Col）由R.Fischer提供(Choi等人，2002年). 变种人二甲醚-4和图2-6（C24）之前在F.B.实验室进行了表征(Guitton等人，2004年). FIEcs（Col）植物之前以N.O.组为特征(Katz等人，2004年). 我们曾经金属1-3/+植物中没有FIS2型也不是鱼类和野生动物管理局在营养组织中可以检测到转录物(图2A)这表明，亲本植物在营养生长期不受突变的影响，而只在雄配子的产生过程中受到突变的影响。

在Jim Haseloff的增强子陷阱线收集中的一个屏幕上识别出KS117线(哈塞洛夫，1999). 转基因报告系FIS2-GUS公司由A.Chaudhury提供(Chaudhury等人，1997年;Luo等人，2000年). 这个FWA-GFP公司融合在前面已经描述过了(Kinoshita等人，2004年).

在黑暗中4°C下放置3d后，种子发芽并生长在土壤上。植物在生长室中短时间培养（20°C光照8小时，16°C暗照16小时；相对湿度60-70%），直到花环形成。将植物转移到20°C的长时间（14小时光照/10小时暗照）以诱导开花并生长，直到收获种子。杂交是通过摘除花朵并人工授粉进行的。Siliques在授粉后的不同时间收获，如图例和文本所示。

RT-PCR分析

样本组织来自拟南芥并立即在液氮中冷冻。将组织研磨，并使用RNeasy迷你试剂盒（Qiagen）制备总RNA。使用无DNA酶试剂盒（Ambion）对2μg总RNA进行DNA酶处理。

为了进行逆转录，将500 ng总RNA与200单位RevertAid Moloney小鼠白血病病毒逆转录酶（Fermentas）在42°C的20μL反应混合物中孵育1小时，该反应混合物包含4μM寡核苷酸（dT）12引物、适当的反应缓冲液、1 mM脱氧核苷酸三磷酸、，和40单位重组核糖核酸酶抑制剂（Promega）。通过在70°C下培养10分钟，停止反应。使用等量的RT产物进行后续PCR。用于扩增的引物FIS2型为Fis2-R5018（5′-CCTGCATTGTTTGGGAGTATAGAA-3′）和Fis2-F3412（5′-GGATGTAGAAATCCAATTGAGCCTTTG-3′）。等位基因特异性RT-PCR鱼类和野生动物管理局按说明执行(Kinoshita等人，2004年). 等位基因特异性RT-PCR测量按说明执行(Kinoshita等人，1999年). 用于扩增的引物鱼类和野生动物管理局分别为FWA-RTf2（5′-GTTCATGGATTGAACAAGCGG-3′）和FWA-RTr2（5′-ACCTTGAATGAGTGCAGCAGTTG-3′）。用于放大控制的引物，GAPDH公司RNA分别为GAPDH3′（5′-GTAGCCCCACTCGTGTCGTA-3′）和GAPDH5′（5’-AGGGTGCCAAGGTTG-3′）。每个RT-PCR实验均使用无RT的阴性对照。我们设计了跨越内含子的引物，这样基因组特异性和cDNA特异性PCR产物就可以通过大小差异轻松区分。

显微镜

FIS2-GUS公司按照描述分析表达Jullien等人（2006年）用体视显微镜（MZ16FA；徕卡）分析了5-DAP种子中的KS117 GFP荧光。用差分干涉对比光学观察GUS染色的发育中的种子或用Hoyer培养基的衍生物清除的雌蕊。在50%甘油溶液中培养种子的过程中，使用GFP专用滤光片组和×20平面物镜（DM6000 B；徕卡）分析FWA-GFP荧光。使用DXM1200F数码相机（尼康）采集图像，并使用变形（6.2版；通用成像）进行处理。保存观察设置并应用于所有观察到的种子，以便比较2和4 DAP下的荧光强度。花粉按说明制备(Rotman等人，2005年). 花粉中的FWA-GFP荧光用共聚焦显微镜（LSM 510）进行分析，并用Adobe Photoshop和Adobe Illustrator对图像进行进一步处理。

每次测量鱼类和野生动物管理局-GFP公司和FIS2型-GUS公司在种子发育过程中，对单个西力克进行计数。的测量鱼类和野生动物管理局-GFP公司将几个花药放在载玻片上进行花粉表达。观察了15个单独的区域，每个区域包含20到50个花粉粒，并对其进行了评分，从而建立了用于确定阳性表达花粉百分比的数据集。根据每个硅藻土或每个观察到的花粉粒区域获得的平均值，计算每个遗传背景的标准偏差。

麦克尔BC分析

DNA甲基化状态FIS2型通过PCR扩增经预处理的DNA来分析启动子麦克尔BC内切酶，消化甲基化DNA（新英格兰生物实验室）。百纳克的玫瑰花叶基因组DNA金属1-3Col-0植物用10单位的麦克尔BC，根据制造商的说明。然后用ExTaq聚合酶（Takara）用以下引物通过PCR扩增10纳克模板DNA：F3697Tf（5′-AAAGAGTTATGGGGYYGAAG-3′）和F3697Tr（5′-GGGCAGAACATGGTCCA-3′）、FIS2.-3104BisBf（5’-ACARTCACACAAACAAAACCTTAA-3′，FIS2.-3104BisBf和FIS2.-1867r（5′-ATGTGCGCCTTCACCACTT-3′），以及FIS2.-1218BisBf5′-TCCARTCCACTCTTACTCTTACCTT-3′和FIS2.16r（5’-GTAGTTGGAATCTTATTTCCCACCTGA-3′）。

亚硫酸氢盐测序

亚硫酸氢盐测序按所述进行(Paulin等人，1998年). 从玫瑰花叶中纯化DNA。亚硫酸氢盐化学反应后FIS2型用引物FIS2.-2185BisTf（5′-AGGTYYAATTYGYATTTATTAGGGTTYGGTT-3′）和FIS2.-1768BisTr（5′-TCCTACATTAAAAAATTATATATATRACTAARCA-3′）扩增了从−2185到−1768的启动子（相对于翻译起始点），用引物FIS2.-2110BisBf（5′-TACCAAACCARAAAAAAAATTTACAA-3′）和FIS2.-1670BisBr（5′-TGATGGYAGTAGAGATAAAAAAAGA-3′）扩增了−2110到−1670的底链。将扩增的PCR片段进行凝胶纯化并克隆到pT7Blue质粒（Novagen）中，然后对6到9个独立克隆进行测序。这个阿萨1基因被用作亚硫酸氢盐化学反应的阳性对照(Jeddeloh等人，1998年). 我们曾经金属1-3分离纯合突变体金属1-3/+杂合子，因为与MET1as公司自交植物。

登录号

本研究中所用基因的拟南芥基因组计划编号为At1g02580(测量)，地址：2g35670(FIS2型)，电话：4g25530(鱼类和野生动物管理局)和At5g04560(二甲醚).

补充数据

本文的在线版本中提供了以下资料。

  • 补充图1。分析FIS2型在3和5 DAP压印。
  • 补充图2。亚硫酸氢盐序列FIS2型5′区含有一个富含甲基化胞嘧啶残基的200-bp结构域，主要位于CpG上。
  • 补充表1。BASTA阻力与金属1-3.

补充材料

[补充数据]

致谢

我们感谢《方法》、诺丁汉拟南芥资源中心和ABRC中引用的所有材料的贡献者。P.E.J.和F.B.得到淡马锡生命科学实验室和新加坡国立大学的支持。N.O.得到了以色列科学基金会（574-04号拨款）和美国-以色列两国农业研究与发展基金（IS-3604-04c号拨款）的支持。

笔记

作者负责根据《作者须知》中所述的政策分发本文所述调查结果的完整材料(网址：www.plantcell.org)是：弗雷德里克·伯杰(gs.gro.llt@derf公司).

[西]联机版本包含纯网络数据。

文章、出版日期和引文信息可在www.plantcell.org/cgi/doi/10.1105/tpc.106.041178.

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文章来自植物细胞由以下人员提供牛津大学出版社