突变体POLG2型破坏DNA聚合酶γ亚基导致进行性外眼肌麻痹

线粒体研究与线粒体DNA分子遗传学

使用扩展长模板PCR系统（Roche）对从指数病例的肌肉匀浆中提取的DNA进行线粒体DNA的Southern blot和长程PCR，并使用已建立的协议扩增主弧上的～9.9-kb片段。¹³细胞色素c（c）在左侧股四头肌活检的冷冻切片上进行氧化酶（COX）-琥珀酸脱氢酶（SDH）组织化学。个人呼吸链复合物的活性与柠檬酸合成酶活性相关。冷冻器肌肉切片也被切割并在膜载玻片上染色，以进行激光显微切割（徕卡ASLMD）。使用BioRad ICycler上的iQ Sybr Green对每个细胞进行裂解，并通过实时PCR对每个纤维中mtDNA的总量和未缺失mtDNA的量进行量化。¹⁴从跨越mtDNA 3459–3569核苷酸的靶模板中，在单个细胞上三次测定总mtDNAMTND1型基因。在单个细胞上，从跨越mtDNA核苷酸11145–11251的靶模板上，三次测定未缺失的mtDNAMTND4型基因。按照惯例，结果表示为删除mtDNA的百分比。¹⁵

分子遗传学

通过标准方法从100名散发性或家族性PEO患者的肌肉或血液中提取总DNA，这些患者具有线粒体疾病的组织化学证据（即COX缺陷的肌肉纤维和/或粗糙的红纤维，其比例高于年龄匹配的健康对照的预期比例，¹⁶至少使用以下两种方法证明骨骼肌中存在多重缺失：Southern blot、长程PCR和实时PCR）。¹⁵ POLG2型使用包含正向和反向M13标记的已发布引物序列、荧光链终止测序试剂盒（Beckman Coulter Quickstart）和Beckman Coolter CEQ 8000荧光DNA分析仪进行测序。使用Bioedit（v.5.09）序列比对编辑器对照参考序列分析序列。对144名健康对照受试者（288条控制染色体）进行1352G→由测序引物产生的外显子8 PCR产物的变性高效液相色谱（DHPLC）突变（退火温度57°C，使用标准溶剂梯度的Transgenomic 3500HT WAVE系统，熔融温度60.6°C，缓冲液B 59.8%）。

蛋白质

人polγ的催化亚单位在杆状病毒感染的Sf9细胞中过度表达，并纯化至同质性，如其他地方所述。^17,18对含有重组副亚单位的质粒进行了几处修改。编码序列从pQESL-Hp55转移到基于pET的表达载体，^三和N端His₆地缘标记已删除。新的N端氨基酸序列是Met₁-天冬氨酸₂₆-阿拉₂₇-格莱₂₈，删除构成线粒体靶向序列的25个N端氨基酸。^三氨基酸Ser-His₆添加到C末端以包含新的亲和标记。此外，QuikChange定点突变试剂盒（Stratagene）用于改变7个稀有密码子（Arg₃₆从AGG到CGT，专业₃₉从CCC到CCG，Gly₄₁从GGA到GGT，Arg₇₅从AGA到CGT，Arg₇₆从AGG到CGT，Leu₇₉从CTA到CTG，以及Gly₈₁从GGA到GGT）优化翻译大肠杆菌。结果质粒（pET-p55CHIS）经DNA测序证实。以pET-p55CHIS为模板，以突变引物5′-CTACTTTGGAGAATTAATTAATATATATACTGA-3′和5′-TCAGATGTATAATTCCAAAGTAGAGAGAGTAG-3′（寡核苷酸等）为诱变引物，通过定点突变构建p55的G451E衍生物。DNA测序证实了G451E替换，并发现突变结构中Leu密码子347处的同义CTG→TTG突变，预计不会影响重组蛋白。大肠杆菌用表达野生型（WT）p55或G451E p55的质粒转化的BL21（DE3）在37°C的1.5升含有100μg/ml氨苄西林的Luria-Bertani培养基中生长至OD₅₉₅（光密度）为1.0，然后将培养物冷却至30°C并用1 mM异丙基硫代半乳糖苷诱导13 h。通过离心收集细胞，用10 mM HEPES（pH 7.1）和50 mM NaCl清洗一次，用液氮冷冻，并在−80°C下保存。如其他地方所述，WT p55和G451E p55均从冷冻细胞颗粒中纯化至均质，^三除了Ni-NTA琼脂糖色谱第三洗涤缓冲液中的Triton X-100被0.01%NP-40取代。而N端His₆-标记的p55蛋白在～0.54 M NaCl下从MonoS柱洗脱，^三WT和G451E C端子His₆-标记衍生物在0.34 M NaCl下从MonoS洗脱。相对于原始构建体，密码子优化将蛋白质产量提高了4至10倍，这允许从每升培养基中纯化高达1.5 mg p55（组分IV）。在当前研究中，两种形式的p55（第四组分）在用液氮冷冻并储存在−80°C之前，通过5-ml HiTrap脱盐柱（Amersham Biosciences），转移到含有10 mM HEPES（pH 7.4）、0.15 M NaCl、3 mM EDTA和0.005%表面活性剂P20（聚山梨酸酯20）的缓冲液中。

酶分析

DNA聚合酶活性测定如别处所述^三和使用的poly（rA）-oligo（dT）_12–18（Amersham Biosciences）作为底物。polγ的双亚单位形式如其他地方所述进行了重组，^三反应中含有指定数量的NaCl和/或抑制剂NEM。如其他地方所述，通过监测与M13mp18 DNA杂交的5′末端标记的寡核苷酸引物的延伸来确定polγ的加工性。¹⁹通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和碱性琼脂糖凝胶电泳解析反应产物^三并使用台风9400荧光成像仪（分子动力学）和NIH Image 1.63软件进行可视化。

分析DNA-纤维素色谱法

在4℃下，在0.025 M Tris-Cl（pH 7.5）、10%甘油、1 mM 2-巯基乙醇和0.1 mM EDTA（缓冲液A）（也含有0.025 M NaCl）中平衡1 ml单链DNA纤维素（Sigma）柱。纯化的重组p140、WT p55和G451E p55样品通过稀释调整至该缓冲液的离子强度，并应用于柱上，柱用9.5 ml平衡缓冲液清洗，并在缓冲液a中以15 ml NaCl（0.025–0.6 M）线性梯度展开。使用Tris-甘氨酸缓冲系统，通过SDS-PAGE在4%-20%梯度凝胶（Invitrogen）上分析每个梯度级分的样品，并用考马斯亮蓝对蛋白质进行染色。

免疫沉淀分析

兔抗重组polγ多克隆抗体（DPg）¹⁷将其固定在蛋白G Sepharose微球（Amersham Biosciences）上，然后在磷酸缓冲盐NP-40（PBSN）–BSA缓冲液中进行平衡，该缓冲液由0.05 M KPO组成₄（pH 7.5）、0.15 M NaCl、0.1%NP-40和0.1 mg/ml BSA。如图所示，将制备的DPg蛋白G Sepharose珠（10μl）与纯化的WT polγ（3μG）、A467T突变polγ和/或p55辅助亚基（3μG）混合在1.5 ml聚丙烯微滤管中，并用PBSN-BSA将其最终体积增加到0.4 ml。将试管在4°C下端对端旋转45分钟，并在4°C下以5000 rpm的速度微离心2分钟，收集珠子。去除上清液，用PBSN-BSA洗涤珠子两次，用缺乏BSA的PBSN洗涤珠子一次。珠子重新悬浮在25μl 2×十二烷基硫酸锂（LDS）负载缓冲液中（4×LDS负载缓冲液来自Invitrogen，用缺少BSA的PBSN制成2×），样品在70°C下加热10分钟，然后使用4%–12%NuPage Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶（Invitrogen）进行分析。电泳后，将蛋白质电转移到Immobilon-P PVDF（聚偏氟乙烯）膜（Millipore）上。然后在TNT（50 mM Tris-HCl[pH7.5]、0.5 M NaCl和0.1%Triton X-100）中清洗膜15分钟，并在室温下用5%的TN奶粉（50 mM-Tris-HCl[pH7.5]和0.5 M NaCl）封闭膜。将印迹与0.2μg/ml抗Penta-His单克隆抗体（Qiagen）在含有0.1mg/ml BSA的TN中孵育2小时，用TN洗涤三次10分钟，并在1/3000稀释的山羊抗小鼠碱性磷酸酶偶联的二级抗体（Bio-Rad）中孵育1小时。在TNT中进行三次10分钟洗脱和三次10 min洗脱后，用西兰试剂（Promega）观察条带。

一种杂合突变的鉴定POLG2型

序列分析显示ANT1、C10或f2，或波兰。考虑到p55亚基在体外polγ功能中的关键作用，我们对其八个编码外显子和相邻内含子区域进行了测序POLG2型这名患者，以及100名骨骼肌中PEO和多个mtDNA缺失的其他患者，这些患者已知在ANT1、， C10或f2，或波兰。在上述患者中发现了一个单一的杂合转变（1352G→A），而她的两个未受影响的姐妹没有携带突变(图2A类和​和2B类).2B类). DHPLC分析在同一地理区域的288条控制染色体中未检测到突变(图2C类). 1352G→A突变被预测在密码子451（G451E）处将高度保守的甘氨酸转变为谷氨酸(图2D类).

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图2

一种新的突变POLG2.A、，先证者的谱系（II-2，箭头)和她未受影响的兄弟姐妹。B、，在先证者中显示杂合碱基取代的序列痕迹，而在她未受影响的姐妹中却没有。C、，DHPLC追踪先证者的第8外显子扩增子(上面的)和控制个人(降低).D、，基因外显子8跨物种的氨基酸保护POLG2、，密码子451为红色。

G451E p55减少p140的刺激

鉴于p55在mtDNA复制中的核心作用，我们测试了G451E取代引起的表型变化是否也会导致可测量的生化缺陷。为了比较WT p55和G451E p55的生化特性，缺少线粒体靶向序列的两种形式的蛋白质在大肠杆菌并提纯至表观均一性，如“主题和方法“第节。生理浓度的盐抑制了分离的p140对天然DNA底物的催化活性，p140与WT p55的结合既刺激了聚合酶活性，又显著提高了最佳polγ活性的离子强度。^三,17在不同盐浓度下评估G451E p55影响p140在poly（rA）-oligo（dT）上聚合酶活性的能力(图3). 然而，WT p55刺激p140活性几乎是原来的三倍，并将最佳盐浓度从～75 mM提高到～150 mM NaCl（比较图3)G451E形式的p55只使聚合酶活性提高了约两倍，而最适盐浓度仅增加了25 mM（圆圈图3). 在没有补充盐的情况下，两种蛋白质都不能刺激p140。因为p55通过p140-p55复合物增强DNA结合的机制刺激和恢复耐盐性，^三我们假设，G451E p55表现出的不完全刺激和有限的耐盐恢复是由G451E p55的DNA结合改变和/或与p140催化亚单位的相互作用受损引起的。

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图3

WT p55和G451E p55对polγ活性的影响。在poly（rA）-oligo（dT）上测量DNA聚合酶活性，如“主题和方法”部分。反应中单独含有12 ng（88 fmol）p140(正方形)或9.6 ng（178 fmol）WT p55(三角形)或G451E p55(圈子)以及指示的NaCl量。值是两个独立测量值的平均值。

G451E p55结合DNA

WT辅助亚单位结合双链DNA和折叠单链DNA。^三,21使用单牌DNA–纤维素色谱法测量WT p55和G451E p55与DNA结合的固有强度(图4A类). 如预期，WT p55在0.22 M NaCl（虚线图4A类). 在另一项测试中，G451E p55也在0.22 M NaCl下洗脱，证明突变蛋白保留了与WT p55结合DNA的能力（实线图4A类). 图中还显示了隔离p140在～0.20 M NaCl下的洗脱（图中的虚线图4A类). 由于G451E p55纯化过程中的DNA结合特性和色谱行为与WT p55无法区分，因此扩展分析以寻找亚基相互作用中的潜在缺陷。当纯化的p140和WT p55短暂混合并应用于DNA-纤维素柱时(图4B类)，混合物中一半以上的蛋白质与树脂结合更紧密，并在～0.32 M NaCl下洗脱（中的虚线图4B类)分数19和20(图4C类). 这种耐盐polγ复合物增强的DNA结合特性已在其他地方记录。^三相比之下，G451E p55和p140未能形成更紧密的结合复合物（图4B类). 相反，混合物中的每种蛋白质都单独进行色谱分析，两种蛋白质在0.22 M NaCl的条件下在组分17和18中洗脱峰(图4D类). G451E p55和p140亚基明显无法组装成polγ全酶复合物，这促使进行了额外的实验来评估亚基的功能和物理相互作用。

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图4

通过分析单链DNA–纤维素色谱分析polγ亚基。纯化后的重组p140、WT p55和G451E p55通过单链DNA-纤维素色谱进行解析，如“主题和方法“第节。通过280 nm的吸光度监测柱中蛋白质的洗脱。A、，重量p55(虚线)，G451E第55页(实线)，或p140(虚线)分别施用，并用NaCl梯度洗脱。B、，将p140催化亚单位（29μg）与31μg WT p55混合(虚线)或27μg G451E p55(实线)并像以前一样洗脱。p140-WT p55剖面指示部分的样本(C类)和p140-G451E p55配置文件(D类)通过SDS-PAGE进行解析，并用考马斯亮蓝染色，如“主题和方法“第节。箭头指示p140和p55的单个迁移位置(C类和D类).

G451E p55显示NEM对p140失活的保护降低

NEM通过共价修饰溶剂可及的半胱氨酸残基来抑制某些酶，包括人polγ。由于半胱氨酸尚未被确定为任何DNA聚合酶中的催化残基，我们推测NEM通过干扰酶、引物模板和进入的二核苷酸三磷酸底物之间形成三元复合物来抑制polγ。p55与p140的结合可保护催化亚单位免受NEM的灭活，^三,22这种保护作用已被用作一种化学探针来评估polγ亚基的相关性。¹⁹在标准聚合酶分析中，重新建立了不同浓度NEM对polγ的抑制作用，其中1.0 mM NEM将分离的p140的聚合酶活性抑制了～95%(图5). p140与两倍摩尔过量的WT p55进行短暂的预培养，在所有测试的NEM浓度下保护了>80%的聚合酶活性。在与突变型p55的预培养中观察到保护水平降低，在NEM浓度>0.1 mM时，G451E p55的保护效果仅为WT p55的65%–80%。p140对NEM攻击的这种中间保护进一步支持了p55中的G451E替换破坏了与p140亚单位的关联这一观点。

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图5

G451E p55仅部分保护p140免受NEM灭活。DNA聚合酶活性按照“主题和方法”部分，但不包括2-巯基乙醇。反应中单独含有75 mM NaCl、8.0 ng（58 fmol）p140(正方形)或在6.3ng（116fmol）WT p55存在下(三角形)或G451E p55(圈子)-以及NEM的指示量。值是至少两个独立测量值的平均值。

免疫沉淀G451E亚单位失败导致亚单位相互作用受损

通过免疫沉淀法进一步评估亚基的物理联系。将纯化重组p140的多克隆抗体装入蛋白G Sepharose微球，彻底清洗，并用于测试固定化p140捕获WT和突变型p55的能力。WT p55与p140的免疫共沉淀很简单，p55的捕获明显依赖于p140的存在(图6，车道1和2）。然而，p140不能捕获相当数量的G451E p55(图6，泳道3和4）。在单独的对照实验中，将有效G451E p55增加到5μg，并将小球数量增加250%，不允许检测免疫沉淀物中的G451E p55（数据未显示）。未能共同免疫沉淀G451E p55进一步表明G451E型p55和p140亚单位之间的相互作用减弱。

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图6

G451E p55不能与p140共免疫沉淀。用固定化抗p140兔抗体测定WT p55或G451E p55的p140依赖性联合免疫沉淀，如“主题和方法“第节。仅含WT p55的样品(车道1)，p140催化亚单位和WT p55(车道2)，G451E突变体p55(车道3)、p140和G451E突变型p55(车道4)，或直接加载的p140和p55各0.2μg作为蛋白质印迹的阳性对照(车道5). p140和p55标准的位置用箭头表示。

我们感谢Rachelle Bienstock博士从蛋白质数据库文件中生成p55结构图。我们还感谢L.Worth博士和M.DellaVecchia博士对这份手稿进行了批判性审查，并感谢Emma Blakely和Langping He对mtDNA进行了诊断分析。P.F.C.是Wellcome Trust临床科学高级研究员。这项研究得到了惠康信托基金会、法国防治肌病协会、联合线粒体疾病基金会、欧盟框架计划EUMitocracy和Mitocrace（向P.F.C.）以及国家环境健康科学研究所的室内研究计划的支持，美国国立卫生研究院。