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美国国家科学院院刊。2006年6月13日；103(24): 9136–9141.
2006年6月5日在线发布。 数字对象标识：10.1073/pnas.0508889103
预防性维修识别码：项目经理1474008
PMID：16754881

microRNA在人类癌症中表现出高频基因组改变

林章（Lin Zhang）,*†‡ 贾煌,‡§ 诺扬,‡ 乔尔·格雷肖克,‡§ 莫莉·S·梅格劳,‖ 安东尼斯·吉安娜卡基斯,*,** 顺良,* 塔拉·L·奈勒,§ 安德烈亚·巴切蒂,* 米歇尔·沃德,§ 乔治·姚,* 当归麦地那,§ 安·奥布莱恩·詹金斯,* 迪奥尼索斯·卡萨罗斯,†† 阿耳特米斯·哈特齐戈里奥（Artemis Hatzigeorgiou）,‖ 菲利斯·吉莫蒂,‡‡ 芭芭拉·韦伯,§和乔治·库科斯*†§§§
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补充资料

摘要

MicroRNAs（miRNAs）是内源性非编码RNA，对基因表达具有负调控作用。为了确定癌症的全基因组miRNA DNA拷贝数异常，通过基于高分辨率阵列的比较基因组杂交对227例人类卵巢癌、乳腺癌和黑色素瘤标本中的283个已知人类miRNA基因进行了分析。在卵巢癌（37.1%）、乳腺癌（72.8%）和黑色素瘤（85.9%）中，含有miRNA基因的基因组位点中有很大比例的DNA拷贝数发生了变化，其中在>15%的肿瘤中观察到的拷贝数变化对于每个miRNA基因来说都是显著的。我们鉴定了41个具有基因拷贝数变化的miRNA基因，这些基因在三种癌症类型中是共享的（26个有增加，15个有损失），以及具有拷贝数变化的miRNA基因，这些基因对每种肿瘤类型都是独特的。重要的是，我们表明miRNA拷贝变化与miRNA表达相关。最后，我们确定了骰子1,Argonaute2公司以及乳腺癌、卵巢癌和黑色素瘤中的其他miRNA相关基因。这些发现支持这样一种观点，即miRNA及其调控基因的拷贝数改变在癌症中非常普遍，这可能部分解释了在几种肿瘤类型中报告的miRNA基因频繁放松调控的原因。

关键词：基因组，非编码RNA，比较基因组杂交

微RNA（miRNAs）是内源性≈22-nt非编码小RNA，以序列特异的方式调节基因表达(1–8). 由于已经确定了300多个，人类基因组可能包含多达1000个miRNAs(8). 脊椎动物的miRNA靶点数量众多(9–13). 据预测，多达三分之一的人类mRNA是miRNA的靶点(12). 每个miRNA可以直接或间接靶向≈200个转录物(14,15)，而多个miRNA可以聚合到单个蛋白编码基因靶点(9–13). 因此，miRNA提供的潜在调控电路是巨大的。越来越多的证据表明，miRNAs实际上可能是各种基本生物过程的关键调节器(1–8).

miRNAs的表达对组织和发育阶段具有高度特异性(5–7)最近允许对肿瘤进行分子分类(16,17). 关于miRNA表达是如何调节的，目前知之甚少。初级miRNA转录物由聚合酶II生成(18). 这些转录本是有盖的，聚腺苷化的，通常有数千个碱基长(19). 一部分miRNAs位于前mRNAs的内含子内，可能与同源蛋白编码基因一起转录(2,10). 一些miRNAs聚集并转录为多顺反子初级转录物，但大多数人类miRNAss不聚集并独立转录(5–7).

miRNAs的生物发生和功能需要一组共同的蛋白质。Drosha是一种RNase III内切酶，负责处理细胞核中的初级miRNA并释放≈70-nt前体miRNA(20). Drosha与人类dsRNA-结合蛋白DGCR8相关(21)或苍蝇中的帕夏(22)形成微处理器复合体。前体miRNAs通过exportin-5转运到细胞质(23,24)并被RNase III内切酶Dicer切割，释放≈22-nt成熟dsmiRNA(25). miRNA双链的一条随后被并入效应复合物RNA诱导沉默复合物（RISC），该复合物介导靶基因表达。精氨酸2是RISC的关键成分，可能作为一种内切酶，裂解靶mRNA(26,27).

越来越多的证据表明，miRNA基因在人类癌症中的表达被解除了调控(28–31). 特异性过表达或低表达已被证明与特定的肿瘤类型相关（16，17，32-34）。miRNA过表达可能导致抑癌基因的下调，而其表达不足可能导致癌基因的上调(28–31). 例如，let-7，在肺癌中下调(35–37)，禁止显示Ras公司(36)；mir-15型和米-16白血病中缺失或下调(38)，禁止显示BCL2级(39)；mir-17-5p和mir-20a控制原癌基因驱动的细胞死亡和增殖的平衡c-Myc公司(40). 明确的证据表明miRNA多顺反子mir-17型-92作为淋巴瘤的致癌基因(33)和肺癌(41)；mir-372型和mir-373型睾丸生殖细胞肿瘤中新的癌基因是通过阻断p53通路(42). 最重要的是，miRNA表达特征可以预测结果(35,37,43). 这些数据强烈表明，miRNAs在人类癌症中起着重要作用。

癌症中miRNA基因解除调控的机制尚不清楚。尽管基因组改变在肿瘤发生中至关重要(44,45)到目前为止，研究主要集中在蛋白质编码基因上。因为超过一半的miRNAs已经与基因组脆性位点或与癌症相关的区域对齐(30)，基因组拷贝异常可能与miRNA基因有关。在过去的几年里，阵列比较基因组杂交（aCGH）已经证明其在分析DNA拷贝数变异方面的价值(46). 在本研究中，我们使用最近描述的高分辨率aCGH研究了227例人类癌症样本中含有283个已知人类miRNA基因的基因组区域的全基因组DNA拷贝数异常(47). 该方法是通过使用BAC克隆产生的，具有：(我)跨基因组构建的明确映射数据主要基于范围定义序列锚；(二)可重复、敏感拷贝数测定的能力；和(三)基因组之间的间隔均匀，因此收集的间隔不大于2 Mb，平均间隔小于1 Mb(47). 具有这种分辨率的aCGH平台是筛查癌症基因变化的强大工具，并提供了与人类基因组序列的直接链接，以便在出现拷贝数变化的区域立即识别基因。

在这里，我们提供了上皮性癌中涉及miRNA基因的DNA拷贝改变的实验性全基因组文档。我们发现乳腺癌、卵巢癌和黑色素瘤中含有miRNA及其相关基因的区域拷贝数异常的频率很高。重要的是，我们表明miRNA基因拷贝变化与miRNA基因转录表达一致。鉴于miRNA基因可能靶向对肿瘤发生至关重要的基因，目前的数据支持这样的观点，即miRNA及其相关基因的基因组改变在一定程度上是导致癌症中miRNA放松调控的原因，并可能构成癌症发展的关键步骤。

结果

高分辨率aCGH(47)用于测定227份癌症标本中含有已知miRNA基因的基因组区域的DNA拷贝数异常，包括109份卵巢癌标本（93份原发肿瘤和16份细胞系）、73份乳腺癌标本（55份原发癌和18份细胞系，以及45份原代培养的黑色素瘤细胞系。肿瘤DNA和参考DNA分别用Cy3和Cy5标记（图5A类，作为支持信息发布在PNAS网站上）。进行了反向染色实验，以验证所有样品的结果。肿瘤与参考DNA的荧光强度比<0.8被认为是拷贝数损失，而>1.2则是增加。一种循环二进制分割算法(48)已应用于原始日志2比率数据。该算法递归地识别断点，并基于最大值将染色体分割成子段t吨统计的。置换生成的参考分布用于定义估计分裂的统计显著性，并决定是否在每个阶段分裂(48). 这一过程消除了克隆依赖性，并允许准确估计整个基因组的拷贝数。图5B描述了生物信息学方法，在二倍体DNA内容和增益或损失区域的循环二进制分割调用之间进行转换。位于常染色体上的283个已知人类miRNA基因的基因组位点在miRNA注册库中进行了鉴定(49)（图5C类和D类). 在>15%的肿瘤中观察到的拷贝数变化对于每个miRNA基因来说都是显著的。总之，37.1%（283个miRNA基因中的105个）位于卵巢癌DNA拷贝数异常的区域(图1; 另见表1-3，作为支持信息发布在PNAS网站上），72.8%（206/283）的乳腺癌（图6和表4和表5，作为支持信息发布在PNAS网站上；另见表1），85.9%（243/283）黑色素瘤（图7和表6和表7，作为支持信息发布在PNAS网站上；另见表1）。

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卵巢癌中miRNA基因拷贝数的高频改变。显示卵巢癌标本的aCGH频率图。绿色代表收益，红色代表损失。星星表示miRNA基因。

总的来说，涉及miRNA基因的基因组改变在不同的肿瘤类型中是不同的，通过聚类分析开发的热图状态树证明了这一点(图2). 尽管有不同的特征，但三种癌症类型都有一些新的miRNA基因组改变(图3). 卵巢癌和乳腺癌共有41个miRNA基因位于拷贝数增加的区域，19个位于拷贝数减少的区域。此外，这三种癌症共有26个miRNA基因位于拷贝数增加和15个缺失的区域。对这三种癌症类型共有基因组改变的41个miRNAs的生物信息学靶点预测表明，它们在肿瘤发生中起着重要作用（表8和表9，作为支持信息发布在PNAS网站上）。例如，mir-9-1最近有报道称其成熟miRNA在乳腺癌中过度表达(50)位于所有三种肿瘤类型的扩增位点。它的目标，毛茸茸的分裂1增强子(HES1型)，预测者米兰达,目标扫描，以及皮卡星，是一种潜在的抑制乳腺癌细胞增殖的抑癌基因(51). 此外，mir-320型位于所有三种癌症中DNA拷贝数丢失的区域。一位著名的mir-320型两个独立程序预测的目标是甲基CpG结合蛋白2(MECP2型)在乳腺癌中过度表达，并作为促进细胞增殖的癌基因(52).

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人类癌症中miRNAs的遗传变异。使用开发的热图条件树基因簇2.0显示了卵巢癌、乳腺癌和黑色素瘤标本中包含miRNAs的所有基因组位点的CGH数据。绿色和红色分别表示DNA拷贝数的增加和减少。

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两种或三种上皮癌共有的miRNA基因拷贝数增加和减少的文氏图。

这项研究揭示了上皮性癌中涉及miRNA基因的新的基因组改变，这与以前的血液恶性肿瘤研究不同。例如17岁以下儿童-92多顺反子在B细胞淋巴瘤中经常扩增(33). 相反，我们发现含有该多顺反子的区域在16.5%的卵巢癌、21.9%的乳腺癌和20.0%的黑色素瘤中被删除。这一结果表明，特异性miRNA基因改变是特异性恶性肿瘤的基础。另一方面，上皮性和血液性恶性肿瘤之间可以共享选择性miRNA改变。例如，mir-15a和mir-16-1位于13q14的一个簇内，在>50%的慢性B细胞淋巴细胞白血病中被删除或下调(38). 我们的数据显示，包含mir-15a和mir-16-1卵巢癌占23.9%，乳腺癌占24.7%。最近研究表明，这些miRNAs在转录后水平上负调控BCL2蛋白，并且其过度表达可诱导白血病细胞凋亡(39).

在分析的283个miRNA基因中，至少有47个miRNA位于蛋白编码基因的内含子内，这些内含子可能与同源蛋白编码基因一起转录(2,10). 在这些基因中，21个位于卵巢癌中拷贝数显著改变的区域，23个位于乳腺癌中，38个位于黑色素瘤中（表10，作为PNAS网站上的支持信息发布）。这一结果表明，在这些癌症中，miRNA和宿主蛋白编码基因的拷贝数可能同时发生变化（5–7，10）。例如，mir-218型-1位于肿瘤抑制基因内幻灯片2（人类同源果蝇属 狭缝2)，由于等位基因缺失，在乳腺癌、肺癌和结直肠癌中经常失活(53). 我们发现包含mir-218型-1和幻灯片2在15.5%的卵巢癌、35.6%的乳腺癌和33.3%的黑色素瘤细胞系中。因此，miRNA基因可能与癌症中的相应致癌基因或抑癌基因同时获得或失去拷贝数。

我们还研究了基因组改变所涉及的miRNA基因是否在癌症中表达，以及它们的转录表达是否与DNA拷贝数相关。首先，我们检测了有aCGH数据的卵巢癌样本中成熟miRNA转录物的表达。因为浸润卵巢癌的宿主细胞可能导致miRNA基因表达改变，而不会导致基因组改变，所以我们首先选择将我们的分析局限于16个细胞系。我们使用TaqMan miRNA阵列，其中包含140个先前由aCGH分析的miRNA基因。多数(n个其中121）个基因可以在miRNA水平上检测到，在所有卵巢癌细胞系中只有19个miRNA基因无法检测到。用miRNA微阵列分析的五个卵巢癌细胞系也获得了类似的数据，其中包括由aCGH分析的167个miRNA基因。

为了研究DNA拷贝数的异常是否导致miRNA的异常表达，我们检测了miRNA转录水平和miRNA基因拷贝数之间的一致性水平。从由TaqMan miRNA阵列和aCGH同时分析的140个基因中，我们选择了78个基因进行一致性分析，排除了以下基因之一：(我)从未发现与基因组改变有关（因此其转录表达不能归因于基因组改变；n个= 21); (二)从未在任何卵巢癌系中检测到成熟的miRNA（因此基因组改变不能在转录水平上解释；n个= 19); 或(三)不同的基因组位点存在多个拷贝（因此转录变化不能与一个特定位点的基因组变化联系起来；n个= 22). 对于每个miRNA，我们将成熟miRNA细胞的表达水平与正常或异常的DNA拷贝数进行比较。我们发现73.1%（78个miRNA基因中的57个）的成熟miRNA水平与DNA拷贝数一致；即，相对于那些miRNA没有拷贝数增加的株系，DNA拷贝数增加株系中成熟miRNA的平均水平更高。同样，对于大部分被删除的miRNA，与没有拷贝数丢失的线相比，拷贝数丢失线的平均成熟miRNA水平更低(图4B).

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DNA拷贝数变化与miRNA表达的相关性分析。(A类–C类)16个卵巢癌细胞系中成熟miRNA转录物的表达（通过TaqMan miRNA分析）和包含特定miRNA的位点的DNA拷贝数（通过aCGH）。(A类)放大倍率更高mir-15a和mir-15b型地图。每个点代表一条细胞线。成熟miRNA转录物的表达水平显示在16个细胞系的热图上方。DNA状态显示在较低的通道中（红色表示DNA拷贝数丢失；绿色表示DNA拷贝数量增加）。细胞系根据DNA状态（最左边，扩增；中间，正常；最右边，删除基因拷贝）进行排序。(B)miRNA基因(n个=57）显示DNA拷贝数变化和miRNA转录表达之间的一致性。(C类)miRNA基因(n个=21）无一致性。(D类)Iorio报告的现有肿瘤组的miRNA aCGH数据与不同乳腺癌组中28个过度表达的miRNA的表达数据的比较等。(50). DNA拷贝数正常的miRNA基因标记为灰色；增益标记为绿色，损失标记为红色。miRNA转录过度表达（相对于正常乳房）标记为粉红色；表达不足（相对于正常乳房）为蓝色(50).

接下来，我们研究了miRNA基因组改变是否与原发性肿瘤中的转录表达相关。作为原理证明，我们使用实时定量PCR来分析let-7a3号,let-7f2,米-9-1和mir-213型有aCGH数据的57例卵巢癌中前体miRNA的表达。我们发现四种前体miRNAs中有三种表达(let-7a3号,mir-9-1型和mir-213型)与相应的基因组改变一致（图8，作为支持信息发表在PNAS网站上）。最后，我们将我们的乳腺癌aCGH数据与之前通过miRNA微阵列分析miRNA表达的无关肿瘤集进行了比较(50). 据Iorio最近报道等。(50)，28个miRNA在乳腺癌和正常乳腺组织中差异表达(图4D类). 在这28个miRNA基因中，有11个在我们的研究中表现出拷贝数增加；其中9个（81.8%）miRNAs已被Iorio证实等。(50)转录物丰度显著上调。同样，在我们的研究中，其中五个重要的miRNAs表现出拷贝数丢失；Iorio已经证明这五种miRNAs中有三种（60.0%）的转录丰度显著下调等。(50). 总之，这些数据表明DNA拷贝数的改变可能是影响癌症中miRNAs表达的关键因素。

对于一些miRNA，在没有基因组改变的情况下，其他因素可能会影响miRNA的表达。为了测试参与miRNA生物发生和功能的蛋白编码基因在癌症基因组改变中的参与频率，我们分析了含有miRNA相关基因的位点的DNA拷贝数变化。我们确定了包含这些基因的区域的基因组显著频繁的改变（图9，作为PNAS网站上的支持信息发布）。例如，骰子1和Argonaute 2号机组卵巢肿瘤的DNA拷贝数分别增加了24.8%和51.5%。这些数据表明，miRNA相关基因的DNA拷贝数改变也可能是影响人类癌症中miRNA表达的另一种机制。

讨论

总之，我们的数据表明，在一系列人类上皮癌的基因组中，miRNA包含区域发生了高频拷贝数异常。我们在卵巢癌、乳腺癌和黑色素瘤中发现了含有miRNA的基因组位点的共同异常。我们还发现上皮性癌症和先前描述的血液恶性肿瘤之间含有miRNA的基因组位点的基因组改变存在明显差异。此外，我们发现含有miRNA基因的位点的DNA拷贝发生了变化，这些基因对特定的上皮性癌来说是独特的。重要的是，对于许多miRNA，DNA拷贝变化与miRNA转录表达相关。这些发现支持这样一种观点，即miRNA的拷贝数改变可能部分解释了在几种肿瘤类型中报告的miRNA基因频繁放松调控。显然，其他因素参与了癌症中miRNA的解除调控，因为我们无法确定许多miRNA的拷贝数和转录水平之间的一致性。我们的数据表明，参与miRNA生物生成的蛋白编码基因包括骰子1和阿尔戈2号也可能参与调节肿瘤中miRNA表达的复杂相互作用，以及可能在表观遗传、转录、转录后和翻译水平调节miRNA的其他机制。我们通过使用现有工具进行生物信息学分析，预测本研究中出现的重要miRNAs的靶点，例如在所有肿瘤类型中共享的miRNA。我们发现了与肿瘤发生有关的已知蛋白编码基因的预测靶点。这一观点与之前研究癌症中miRNAs的报告相一致，在这些报告中，预测了重要的miRNA靶向参与恶性转化的蛋白编码基因。目前，在癌症基因组中观察到的miRNA基因高频变化的机制尚不清楚。根据之前的一份报告，miRNAs经常位于与癌症有关的脆弱位点和基因组区域(30)一种可能的解释是，基因组畸变优先涉及高密度miRNA基因的区域。或者，选择具有miRNA扩增或缺失的克隆是因为这些miRNA表达变化具有生物优势。

总之，目前的工作表明(我)涉及miRNA的基因组改变在上皮性癌中非常常见；(二)它们似乎在部分上皮性癌和部分肿瘤特异性癌中共享；和(三)它们导致成熟miRNA表达的变化。由于我们预测的参与DNA拷贝数变化的miRNA基因的一些靶点是已知参与肿瘤发生的蛋白编码基因，因此我们的工作表明miRNA基因基因组的改变可能构成癌症发展的关键步骤。因此，miRNAs的遗传改变可能促进和/或增强癌症中蛋白编码基因表达的改变，加速恶性转化和/或肿瘤生长(28–31). 下调或功能缺陷的miRNA的恢复表达和/或抑制过度表达的miRNA可能有助于重新平衡与肿瘤发生和进展相关的大基因簇的表达。因此，我们的研究结果可能有助于更好地了解人类癌症的发病机制以及识别生物标记物和靶点。靶向miRNAs可能为人类癌症提供重要的治疗策略。

材料和方法

患者和标本。

我们评估了93例三期和四期上皮性卵巢癌标本，这些标本来自于接受去鳞癌手术的未治疗患者。D.Katsaros（都灵大学）提供了62个标本。其他卵巢癌(n个=31）和乳腺导管癌(n个=55）标本由B.L.W.提供。所有卵巢和乳腺肿瘤均来自原发部位。立即将样品进行snap冷冻，并将其储存在−80°C的温度下。原发性黑色素瘤细胞系(n个=45）从M.Herlyn（费城威斯塔研究所）获得。卵巢(n个=16）和乳房(n个=18）癌细胞系由G.C.和B.L.W.提供。

BAC阵列平台。

参考文献中描述了“1 Mb阵列”平台中包含的BAC克隆。47。有关详细信息，请参阅支持方法，作为支持信息发布在PNAS网站上。

aCGH和循环二进制分割。

通过过夜消化、酚氯仿提取和乙醇沉淀从冷冻肿瘤或培养细胞中分离基因组DNA。使用BioPrime随机荧光标记试剂盒（Invitrogen）分别用Cy3或Cy5标记1微克肿瘤和参考DNA（Amersham Pharmacia，Piscataway，NJ）。在平行实验中，用相反的染料标记肿瘤DNA和参考DNA，以解释染料掺入的差异，并为分析提供额外数据。将标记的肿瘤和参考DNA与人Cot-1 DNA结合并沉淀，以减少非特异性结合。DNA在37°C的旋转平台上再次悬浮并与阵列杂交72小时。使用Axon 4500微阵列扫描仪（Axon Instruments，Union City，CA）扫描图像，并用genepix公司（Axon Instruments）。肿瘤/参考DNA荧光强度比<0.8或>1.2被认为是改变。对于每个样本，拷贝数估计是通过循环二进制分割方法进行的，DNAcopy包位于第页程序设计语言(48). 通过使用cganalyzer公司参考文献中描述的套件。54.

miRNA数据库。

人类miRNA基因的基因组基因座已在miRNA注册表中进行了鉴定（The microRNA registry，release 7.12005 October）(49).

低分子量RNA分离和miRNA微阵列。

详细信息见支持方法.

总RNA分离和定量实时RT-PCR。

详细信息见支持方法.

TaqMan miRNA分析。

从1×10中分离出总RNA6用三唑试剂培养细胞。在供应商规定的条件下，通过TaqMan miRNA分析（Applied Biosystems）分析了16个人类卵巢癌细胞系中155个成熟miRNA的表达。详细信息见支持方法.

生物信息分析。

通过使用四个众所周知的miRNA靶点预测程序，预测了41个相关miRNA的mRNA靶点：双微量,目标扫描,米兰达，以及皮卡星。有关详细信息，请参阅支持方法.

蛋白质分离和Western Blot。

详细信息见支持方法.

补充材料

支持信息：

致谢

我们感谢M.Herlyn博士提供的黑色素瘤细胞株。这项工作得到了卵巢癌研究基金（OCRF）、艾布拉姆森家族癌症研究所、宾夕法尼亚州卫生部、乳腺癌研究基金会和皮肤癌卓越研究专项计划（SPORE）P50-CA093372的支持。L.Z.得到了SPORE P50-CA08638和OCRF的支持。D.K.得到了意大利联合会（Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro）的支持。A.H.和M.S.M.获得了国家科学基金资助DBI-0238295。

缩写

aCGH公司阵列比较基因组杂交
微小RNA微小RNA。

脚注

利益冲突声明：未声明冲突。

本文直接（第二轨道）提交给PNAS办公室。

工具书类

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文章来自美国国家科学院院刊由以下人员提供美国国家科学院