美国国家科学院院刊。2006年6月6日；103(23): 8703–8708.
来自封面
核层粘连蛋白A突变导致早衰表观遗传控制的渐进性改变
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戴尔·K·舒马克
*西北大学范伯格医学院细胞和分子生物学系，伊利诺伊州芝加哥市东芝加哥大道303号，邮编60611；
托马斯·德恰特
*西北大学范伯格医学院细胞和分子生物学系，伊利诺伊州芝加哥市东芝加哥大道303号，邮编60611；
亚历山大·科尔迈尔
‡奥地利维也纳A-1030 Bohrgasse 7博士分子病理研究所；
斯蒂芬·A·亚当
*西北大学范伯格医学院细胞和分子生物学系，伊利诺伊州芝加哥市东芝加哥大道303号，邮编60611；
马修·博佐夫斯基
*西北大学范伯格医学院细胞和分子生物学系，伊利诺伊州芝加哥市东芝加哥大道303号，邮编60611；
迈克尔·R·鄂尔多斯
§美国国立卫生研究院国家人类基因组研究所，马里兰州贝塞斯达，邮编：20892；和
玛丽亚·埃里克森
¶瑞典哈丁街14157号Hiss E区Halsovagen 7号诺富姆卡罗林斯卡研究所生物科学与营养系
安妮·E·戈德曼
*西北大学范伯格医学院细胞和分子生物学系，伊利诺伊州芝加哥市东芝加哥大道303号，邮编60611；
萨蒂亚·库翁
*西北大学范伯格医学院细胞和分子生物学系，伊利诺伊州芝加哥市东芝加哥大道303号，邮编60611；
弗朗西斯·柯林斯
§美国国立卫生研究院国家人类基因组研究所，马里兰州贝塞斯达，邮编：20892；和
托马斯·杰努韦恩
‡奥地利维也纳A-1030 Bohrgasse 7号分子病理学研究所；
罗伯特·D·戈德曼
*西北大学范伯格医学院细胞和分子生物学系，伊利诺伊州芝加哥市东芝加哥大道303号，邮编60611；
*西北大学范伯格医学院细胞和分子生物学系，伊利诺伊州芝加哥市东芝加哥大道303号，邮编60611；
‡奥地利维也纳A-1030 Bohrgasse 7博士分子病理研究所；
§美国国立卫生研究院国家人类基因组研究所，马里兰州贝塞斯达，邮编：20892；和
¶瑞典哈丁街14157号Hiss E区Halsovagen 7号诺富姆卡罗林斯卡研究所生物科学与营养系
Francis S.Collins供稿，2006年4月13日
.†D.K.S.、T.D.和A.K.为这项工作做出了同等贡献。
作者贡献：D.K.S.、T.D.、A.K.、T.J.和R.D.G.设计的研究；D.K.S.、T.D.、A.K.、M.R.B.、A.E.G.和S.K.进行了研究；S.A.A.、M.R.E.、M.E.、F.S.C.和T.J.提供了新的试剂/分析工具；D.K.S.、T.D.、A.K.、M.R.B.和A.E.G.分析数据；D.K.S.、T.D.、A.K.、S.A.A.、F.S.C.、T.J.和R.D.G.撰写了论文。
- 补充资料
支持信息
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摘要
早衰疾病Hutchinson–Gilford Progeria综合征（HGPS）是由突变的层粘连蛋白a（LAΔ50）引起的。表达LAΔ50的细胞细胞核形状异常，异染色质丢失。为了确定异染色质丢失的机制，我们检测了调控兼性或组成异染色素的表观遗传标记。在一名女性HGPS患者的细胞中，赖氨酸27（H3K27me3）上三甲基化的组蛋白H3（兼性异染色质标记）在非活性X染色体（Xi）上丢失。负责该标记的甲基转移酶EZH2也下调。这些改变在被认为是HGPS细胞病理特征的核形状改变之前可以检测到。结果还显示，中心周围构成的异染色质标记（赖氨酸9上三甲基化的组蛋白H3）下调，并且该标记与异染色素蛋白1α（Hp1α）和CREST抗原的关联发生改变。这种组成异染色质的丢失伴随着中心周围卫星III重复转录物的上调。与组蛋白H3甲基化状态的减少相反，组蛋白H4K20的三甲基化增加，这是构成异染色质的表观遗传标记。正常细胞中LAΔ50的表达诱导组蛋白甲基化模式的改变，类似于HGPS细胞中的改变。所描述的表观遗传学变化很可能代表了HGPS患者过早衰老快速进展的分子机制。
关键词：组蛋白甲基化、异染色质、早衰
Hutchinson–Gilford Progeria Syndrome（HGPS）是一种早衰疾病，通常在出生后的前12至18个月诊断出来(1). HGPS的特点是疾病快速发展，包括脱发、生长迟缓、皮下脂肪缺乏、皮肤老化、骨质疏松和动脉硬化(2,三). HGPS患者通常死于心脏病发作或中风约13岁(4). HGPS的常见形式是由人类核层粘连蛋白a（LA）基因中的保守杂合突变（1824 C>T）引起的(LMNA公司)，它引入了一个剪接位点，导致在其C末端附近缺失50个氨基酸的LA合成[突变LA（LAΔ50）](5,6).
核层压板分为A型和B型。层压板A和C（LA/C）源自LMNA公司通过选择性剪接，而层粘连蛋白B1和B2来自不同的基因。B型层粘连蛋白在每个细胞中都有表达，而A型层粘着蛋白的表达是受发育调控的。层压板有一个共同的三分结构，其两侧有一个α螺旋中心杆结构域和一个球状的N端和C端结构域(7). 层粘连蛋白的基本结构单位是一个二聚体，由两条平行的和在注册区内的蛋白质链组成，通过其杆结构域的结合形成一个螺旋(8). 层蛋白二聚体以头尾相连的方式组装，形成原丝，原丝横向相互作用，形成许多高阶结构(9).
层压板是核膜的主要组成部分，核膜是一个位于内核膜附近的蛋白质网络。纤层保持细胞核的机械性能和形状，有人提出它为外周异染色质提供了一个分子对接位点(7,10,11). 层粘连蛋白也分布在整个核质中，在那里它们似乎对DNA复制和RNA聚合酶II转录至关重要(7). 由于最近有报道称在细胞中约有200个突变，人们对层粘连蛋白的兴趣增加了LMNA公司导致超过15种不同的疾病，统称为“层粘连病”(12).
HGPS成纤维细胞在培养中积累LAΔ50，作为其年龄的函数，并同时显示核形状和结构的变化，最显著的是异染色质的丢失(1). 在这项研究中，我们检测了表观遗传组蛋白标记的变化，即兼性异染色质的H3K27me3，赖氨酸9上三甲基化的组蛋白H3（H3K9me3），以及组成异染色素的赖氨酸20上三甲基化的H4（H4K20me3）(13)HGPS细胞在培养过程中随着年龄增长而发生。数据定义了抑制性组蛋白赖氨酸甲基化的改变(14)作为疾病表现的早期事件，提示HGPS特异性LMNA公司突变导致染色质结构的表观遗传控制受到干扰。
结果
为了启动这些研究，我们检测了女性HGPS患者成纤维细胞和对照组的非活性X染色体（Xi）。Xi可识别为一个通常与核膜相关的异色结构域。组蛋白H3（H3K27me3）中赖氨酸27的三甲基化和X非活性特异性转录物调节Xi的沉默(XIST公司)核糖核酸(15–17). 来自HGPS患者年龄匹配的正常女性同胞的成纤维细胞作为对照。在早期传代[第9-13代（p9-13）]中，≈94%的对照细胞(n个=193）含有与叶片密切相关的Xi，通过抗H3K27me3的免疫荧光测定(A A–c和D类). 这个数字略微下降到≈80%(n个=103）在后面的段落（第20–25页）(D类). 此外，在所有传代的对照细胞的核质中都存在斑点状H3K27me3染色(一 a–c和数据未显示）。在早期传代的HGPS细胞中，≈57%(n个=200）的细胞具有与抗H3K27me3反应的Xi，p21降低至≈36%(n个= 186; 看见D类). 有趣的是，≈58%(n个=200）的H3K27me3-阳性Xi由p9-13细胞中分散的荧光颗粒松散排列组成(C类 b条和e（电子）). 这些松散的阵列表明在H3K27me3标记丢失期间存在过渡态(C类 a–f). 免疫印迹法证实，与对照组相比，晚传代HGPS细胞的整体染色减少( 一 d–f日和B类). 值得注意的是，这些观察结果表明，许多正常形状的早期传代HGPS细胞核在其Xi上失去了H3K27me3标记( 抄送（C）和（f）和D类). 为了量化这一点，我们将Xi上的H3K27me3标记与不同传代的对照细胞和HGPS细胞的核轮廓比率相关联。在对照组中，从早传代到晚传代，轮廓比保持在0.9±0.2，而在HGPS细胞中，从早期（0.9±0.2%）到晚期（0.5±0.2），轮廓比显著降低。在核轮廓比≈0.9，≈34%的早期传代HGPS细胞中，H3K27me3染色未检测到Xi(D类). 这些观察结果表明，染色质调节的显著改变先于被认为是HGPS细胞病理特征的核形状改变(1,18,19).
H3K27me3降低XIST公司在HGPS细胞的所有传代中，RNA都与Xi结合。(一)用LA/C抗体对细胞进行免疫荧光处理(一和d日)和H3K27me3(b条和e（电子）; 覆盖，c（c）和（f）). p9的对照细胞核显示出明显的LA/C核边缘(一)与紧凑的Xi相关(b条). 抗LA/C的p21使HGPS细胞的核形态发生改变(d日)抗H3K27me3未发现明显的Xi(e（电子）). （比例尺，5μm）(B类)通过HGPS的Western blot分析，在p20时H3K27me3与对照细胞总提取物相比降低。(C类)在用抗H3K27me3染色的早期传代HGPS细胞中，Xi表现为均匀染色的致密结构域(一和d日)或松散排列的密集颗粒(b条和e（电子）)或检测不到（白色方框中描绘了细胞核中没有Xi染色的典型薄层区域；c（c）和（f）).d–f日是白色方框中区域的放大倍数（×4）a–c（比例尺，5μm）(D类)核轮廓比（CR；另见参考。1)在早期和晚期传代时测定对照和HGPS细胞（CR≥0.7的细胞核被视为无瘤细胞核，CR＜0.7的核被视为分叶状细胞核）。在早期传代的HGPS细胞中，约43%的细胞核失去H3K27me3 Xi标记，约80%的细胞核形状正常。在晚期传递细胞中，≈63%的细胞核失去了这一标记，而≈20%的细胞核形状正常。在早期传代对照中，≈6%的细胞核不含明显的Xi，这与抗H3K27me3的作用不同。在后期，这一数字增加到≈20%。(电子)控制(a–d)和HGPS细胞(e–l型)准备好了现有的RNA FISH并用抗H3K27me3染色。(a–d)在早期和晚期的对照组（p13–20）中，XIST公司RNA与Xi相关，约93%(n个=102）也包含H3K27me3标记(e–l型)在HGPS细胞中，XIST公司FISH在所有传代中均显示Xi，而在p17-18时，Xi上的H3K27me3染色丢失（≈53%；n个= 82). (i–l)在Xi上缺少H3K27me3标记的分叶HGPS细胞核中XIST公司RNA染色更分散。d日,小时、和我是白色框中叠加区域的放大倍数（×5.6）(c（c）,克、和k个). （比例尺，10μm）(F类)Western blotting显示在p14时HGPS细胞中EZH2与对照组相比减少。肌动蛋白被用作加载控制。
我们还确定了XIST公司RNA和Xi。所有HGPS和对照细胞在早期和晚期的传代中都含有Xi，根据XIST公司RNA鱼类(电子). 当Xi也被抗H3K27me3染色时，信号共定位(电子 d日和小时). 当Xi未被抗H3K27me3染色时，FISH信号更分散(电子 i–l).
我们还检测了EZH2的表达水平，这是负责H3K27三甲基化的甲基转移酶(20). 免疫印迹显示，与p14的对照组相比，HGPS细胞中EZH2显著减少(F类). mRNA编码水平也降低EZH2型与对照细胞相比，在HGPS中，通过RT-PCR测定（参见支持文本和图6，作为支持信息发布在PNAS网站上）。这个EZH2型与p14对照细胞相比，p25 HGPS细胞的mRNA水平降低了10倍（见图6）。与FISH数据一致，RT-PCR显示XIST公司早期和晚期HGPS细胞与晚期对照之间的RNA（见图6，未显示数据）。
接下来，我们研究了LAΔ50在人胚胎肾293（HEK293）细胞中瞬时表达的影响。在未转染或GFP-LA表达的细胞核中，≈80%(n个=100）含有多个Xi，用抗H3K27me3染色。在叶片区域和少数核质病灶中也观察到与Xis无关的显著染色(一 a–c). 相比之下，≈20%(n个=100）表达GFP-LAΔ50的细胞中含有一个明显的Xi，在叶片区域H3K27me3染色显著减少(一 d–f日). H3K27me3染色仅限于核质中分布的小病灶(一 d–f日). 此外，在所有检测的未转染和转染HEK293细胞中，通过以下方法观察到XisXIST公司RNA FISH（数据未显示）。
GFP-LAΔ50在HEK293和HeLa细胞中的表达。(一)用抗H3K27me3染色瞬时表达GFP-LA或GFP-LAΔ50的HEK293细胞。对照组（GFP-LA）的薄层表现正常(一)和H3K27me3染色显示了几个Xi（箭头，b条)和外周异染色质阵列（*，b条)与椎板共定位(c（c）). 大多数表达GFP-LAΔ50的细胞在抗H3K27me3的Xi染色和外周异染色质染色中表现出明显的缺失，即使在那些核形状正常的细胞中也是如此(d日–（f）). (B类)表达GFP-LA的HeLa细胞(a–d)或GFP-LAΔ50(e–h)用抗H3K27me3染色。GFP-LA-表达细胞的细胞核形状正常(一)整个细胞核呈点状H3K27me3染色，核周边有明显排列（*，b条)与叶片重叠处(c（c）和d日). GFP-LAΔ50的表达导致大多数HeLa细胞核膜分叶状(e（电子）)H3K27me3染色完全消失，尤其是在叶片区域(f–h). 用白框表示的叠加区域的放大（×7.4）(c（c）和克)显示了(d日和小时). (C类)用免疫印迹法分析表达GFP-LA或GFP-LAΔ50的HeLa细胞24-48小时的全细胞提取物。注意表达突变蛋白的细胞中H3K27me3和EZH2的减少。肌动蛋白被用作负载对照。（比例尺，5μm）
利用诱导表达GFP-LA或GFP-LAΔ50的HeLa细胞系，进一步研究了与LAΔ5 0表达相关的H3K27me3阳性染色质结构域的减少。在非诱导对照细胞和GFP-LA-表达细胞中，核质中存在大小不同的病灶，并且LA和染色质区域之间存在显著的共定位，标记为H3K27me3(B类 a–d). 表达GFP-LAΔ50的大多数细胞核是卷曲的，约83%的细胞H3K27me3荧光总体减少(n个= 100;Bf公司). 此外，未检测到大的核质病灶，且叶片区域H3K27me3染色显著减少(B类 e–h). 免疫印迹显示表达LAΔ50的细胞中H3K27me3和EZH2均减少(C类).
上述数据表明HGPS细胞的兼性异染色质存在主要畸变，如抗H3K27me3所检测到的。为了扩展我们的分析，我们通过检测H3K9me3（已知的着丝粒周围异染色质标记）来研究组成异染色素的可能变化(21). 在早期和晚期传播控制细胞中，染色模式主要由小病灶组成，在核质和板层区域散布着一些较大的病灶(一 a–d和数据未显示）。在早期传代的HGPS细胞中观察到相同的模式（数据未显示）。在晚期传代HGPS细胞中，H3K9me3阳性病灶在高度分叶状核中总体减少，而在板区显著减少(一 e–h). 免疫印迹法还观察到晚期传代HGPS细胞中H3K9me3的总体减少(B类).
LAΔ50的表达导致组成异染色质的变化。(一)使用针对LA/C和H3K9me3的抗体对HGPS和对照细胞进行染色。(a–d)早传递和晚传递控制细胞核均正常。H3K9me3染色模式由分散在核质和叶片区域的小病灶组成。(e–h)在晚传递（p21）HGPS细胞中，分叶细胞核中的H3K9me3免疫荧光模式发生改变。这些细胞核的H3K9me3染色量总体下降，在叶片区域最明显。用白框表示的叠加区域的放大（×4.5）(c（c）和克)显示了(d日和小时). (B类)Western blotting显示，HGPS细胞（p23）中H3K9me3的数量与对照细胞（p24）相比有所减少。(C类)表达GFP-LA或GFP-LAΔ50的HeLa细胞用抗H3K9me3染色。(a–c)在对照组中，H3K9me3染色模式由几个大病灶组成，这些大病灶散布在整个核质的较小病灶之间，并且靠近椎板。当GFP-LAΔ50表达时，大多数HeLa细胞核分叶(d–f日)核质和椎板中H3K9me3病灶较少(d–f日). (D类)用H3K9me3和Hp1α抗体对传代中期（p16）对照细胞和HGPS细胞进行染色。这两种抗体都染色了整个核质的大小病灶。(a–d)在对照组中，许多大病灶均被两种抗体染色，如覆盖图所示。(e–h)在HGPS细胞中，这种共定位减少。用白框表示的叠加区域的放大（×4）(c（c）和克)显示(d日和小时). (电子)对照组和HGPS细胞也用CREST抗血清和抗H3K9me3（p16）进行双重标记。(a–d)在对照组中，CREST显示了典型的动粒模式，其中大多数与H3K9me3相关。(e–h)在HGPS细胞中，许多动粒与H3K9me3无关。白色方框表示的重叠区域的放大（×4.4）(c（c）和克)显示了(d日和小时). （比例尺，5μm）
我们通过分析表达GFP-LAΔ50的HeLa细胞系中H3K9me3的模式，进一步研究了组成异染色质与LAΔ5 0表达之间的关系(C类 d–f日). 表达GFP-LA的对照细胞中的细胞核显示H3K9me3病灶分布在整个核质和椎板区的线性阵列中(C类 a–c). GFP-LAΔ50的表达导致核质和层相关病灶数量减少，特别是在高度分叶状核中(C类 d–f日).
根据H3K9me3的变化，我们检测了它的一个结合伙伴异染色质蛋白1α（Hp1α；参见参考文献。22). 在对照细胞核中，免疫荧光观察显示许多明亮的病灶同时含有Hp1α和H3K9me3(D类 a–d). 在中层HGPS细胞（p16）中，除了Hp1α和H3K9me3的荧光强度总体降低外，它们的相关性也降低了。在广泛的细胞核分叶之前，许多细胞核出现了这种关联缺失(D类 e–h). 我们还使用CREST自身免疫血清检测了H3K9me3和动粒细胞之间的关系(23). 在对照组中，H3K9me3染色的病灶与动粒密切相关(电子 a–d)而在中层HGPS细胞中，这种联系的数量减少(电子 e–h). 然而，与p22相比，HGPS细胞的整体H3K9me3模式在该传代数下未出现显著改变（与p22比较 A b类和（f）具有E b公司和（f）). 此外，SUV39H1和SUV39H2的成绩单水平(24)组蛋白甲基转移酶产生H3K9me3，通过RT-PCR在晚传递HGPS和对照细胞中减少（数据未显示）。
HGPS细胞中与着丝粒周围异染色质相关的H3K9me3的丢失表明，着丝粒附近区域的转录活性可能存在上调。通过检测两个主要的中心周围DNA序列，即卫星III（sat III）和α卫星重复序列的表达水平来研究这种可能性(25,26). 如RT-PCR所示，HGPS细胞中的α卫星转录物即使在传代后期也没有变化（数据未显示）。相反，RT-PCR检测到中晚期HGPS细胞中9号染色体sat III转录物水平显著增加（参见支持文本和图7，作为支持信息发布在PNAS网站上）。FISH使用9号染色体sat III RNA探针证实了这一点(c（c）和d日). 在控制装置中未检测到sat III信号(一)除非他们在42°C下热休克1小时，否则这种处理会在核应激体中诱导9号染色体sat III转录(b条; 参见参考。25). 这些数据表明，HGPS细胞中与着丝粒周围异染色质相关的DNA重复序列的正常表观遗传沉默发生了改变。
HGPS细胞中sat III转录物的上调。对照和HGPS细胞通过sat III RNA FISH进行分析。(一)在37°C下生长的对照细胞中未观察到信号。(b条)热休克后，观察到显著的应力体（绿色）。(c（c）和d日)在37°C下生长的HGPS细胞中，无论其分叶的程度如何，均在细胞核中观察到应力体。（比例尺，5μm）
中心周围异染色质的第二个主要表观遗传学标记是H4K20me3的存在(27). 在用抗H4K20me3抗体制备免疫荧光的后传递HGPS细胞中，与对照细胞相比，明亮染色的核病灶的数量和大小增加(一). 表达LAΔ50的HeLa细胞也获得了类似的结果(B类). 晚期早衰细胞的免疫印迹支持H4K20me3标记的上调(C类). 这些数据为LA在调节着丝粒周围异染色质中的作用提供了额外的证据。
晚期HGPS细胞中H4K20me3染色增加。(一)用针对LA/LC和H4K20me3的抗体对晚传代HGPS和对照细胞进行染色。早期和晚期的荧光模式相似(一; 数据未显示）。(a–c)p22处对照细胞的细胞核显示H4K20me3的病灶遍及经常与层粘连病灶相邻的核质。在晚期HGPS细胞（p21）中，H4K20me3染色模式由更大的强染色结构组成。(d–f日)也失去了与椎板层病灶的联系。(乙a和d日)使用抗H4K20me3制备表达GFP-LA或GFP-LAΔ50的HeLa细胞进行免疫荧光。(b条和c（c）)H4K20me3染色模式主要由核质内的小病灶组成。(d–f日)当GFP-LAΔ50在HeLa细胞中表达时，其大多数细胞核被分叶，H4K20me3抗体在整个核质中显示出大而明亮的病灶。(C类)对照组（p23）和HGPS细胞（p24）的H4K20me3免疫印迹显示HGPS的细胞显著增加。（比例尺，5μm）
讨论
我们证明，HGPS患者细胞中的兼性和结构性异染色质的表观遗传控制发生了显著变化。这些变化是HGPS层粘连突变体LAΔ50表达的直接结果，该突变体改变组蛋白甲基化状态。在培养的雌性HGPS细胞早期传代时，我们观察到兼性异染色质的H3K27me3标记丢失(13)尤其是与习近平有关(17). 该标记的丢失发生在细胞核形状发生明显变化之前，并伴随着EZH2的9到10倍下调。这些结果表明，HGPS细胞早期传代中存在的低水平LAΔ50足以在核形态和结构发生极端变化之前改变染色质组织，这是晚传代HGPS的典型特征(1,28). 这些形状变化与叶片区域LAΔ50浓度增加一致(1)，这可能与该突变蛋白与内核膜的异常结合有关，可能是由于其法尼基化的永久状态(29).
为了确定除H3K27me3标记调节Xi外的其他因素是否也丢失，我们检查了XIST公司RNA。的转录XIST公司RNA在发育早期就被启动，当它覆盖在Xi上时。该涂层是将Eed/EZH2甲基转移酶复合物靶向Xi所必需的，从而导致H3K27的三甲基化(30). 两者都有XIST公司RNA和H3K27me3是Xi转录沉默所必需的(15–17). 此外，XIST公司RNA已被证明是维持Xi上H3K27me3及其沉默所必需的(17). 我们的结果表明，H3K27me3的损失并不伴随着XIST公司HGPS细胞或表达LAΔ50的雌性细胞中Xi的RNA。然而，XIST公司当H3K27me3标记从Xi中丢失时，RNA看起来不是浓缩的，也不是与核膜紧密相关的。这表明HGPS细胞中的兼性异色区具有转录活性。
为了支持这一观点，我们发现在HGPS细胞中存在正常沉默的中心周围结构异染色质的转录激活。具体来说，当H3K9me3标记下调时，9号染色体的sat III DNA重复序列在患者细胞中转录。正常情况下，sat III DNA重复序列仅在应对热休克等环境压力时上调(25,31). 与HGPS细胞中H3K27me3标记丢失所反映的兼性异染色质变化相比，在传代后期检测到了组成异染色素的这些变化。
我们的数据表明，HGPS突变蛋白LAΔ50改变了已知调节异染色质的组蛋白甲基化位点。这意味着，在正常情况下，LA与异染色质调节有关。将LA与组蛋白甲基化复合物相关因子联系起来的确切机制尚不清楚。可以想象，这些联系可能由层粘连网络促进，该网络在整个细胞核内提供3D分子支架。据推测，这种支架可以连接、协调复杂的分子机器，并充当其组装平台，这些机器涉及广泛的功能，包括染色质组织(7,10).
这项研究还提供了证据，证明HGPS的快速老化表型在分子水平上反映了正常老化的各个方面。例如，在老年大鼠的组织中也可以观察到H4K20me3在晚传代HGPS细胞中的上调(32). p21控制细胞中Xi标记H3K27me3的丢失≈20%也支持这种可能性。因此，很明显，染色质正常表观遗传控制和基因调控的特定变化为这一毁灭性疾病的最可能原因以及LA在正常细胞衰老过程中的作用提供了新的线索。
材料和方法
细胞培养。
如前所述，从一名女性HGPS患者（AG11513）和一名年龄匹配的未受影响女性（AG08470）（新泽西州卡姆登Coriell Cell Repositories）中培养细胞(1). HEK293细胞在含有10%FBS的MEM（Invitrogen）中生长。HeLa-Tet-On细胞系在DMEM高糖/10%FBS（无Tet）/青霉素/链霉素/200μg/ml G418（Clontech）中维持。
免疫荧光。
将盖玻片上生长的细胞在−20°C的甲醇中固定10分钟，或在PBS中的3%多聚甲醛（PFA）中固定，并进行免疫荧光处理(1). 兔抗H3K27me3、H3K9me3和H4K20me3抗体（均为1:500；参考文献。17); 小鼠抗LA/C抗体（1:30）（JoL2；Chemicon）和Hp1α抗体（1:1000）（Euromedex，Souffelwyershein，法国）；大鼠抗LA/C（1:200；见参考。1); 使用CREST人抗血清（1:50；来自休斯顿贝勒医学院的B.Brinkley）。山羊的二级抗体为抗兔IgG–Alexa Fluor 568或488、抗鼠IgG-Alexa Fluor 566和抗鼠Ig G–Alexa Fluoro 568（分子探针）。用蔡司LSM 510 META（Zeiss）观察细胞，计算细胞核轮廓比(1).
免疫印迹法。
细胞在Laemmli缓冲液中溶解(33)使用抗H3K27me3、H3K9me3、H4K20me3、肌动蛋白（西格玛）和EZH2（1:200；来自分子病理学研究所M.Busslinger）的原代兔抗体（1:1000）通过Western blotting分析等细胞数。二级抗体是与辣根过氧化物酶缀合的驴抗兔和抗小鼠IgG（1:5000；Kirkegaard和Perry实验室）。
鱼类。
XIST公司核糖核酸.
在Lab-Tek载玻片（Nunc）上生长的细胞在22°C的PBS中用4%PFA固定，在4°C的0.1%柠檬酸钠（pH 6.0）/0.5%Triton X-100中渗透5分钟，在PBS中洗涤，在PBS/0.1%吐温-20（PBST）中洗涤两次，在封闭溶液中培养（PBST/2.5%BSA/0.4单位RNasin每微升），并在22°C的封闭溶液中覆盖抗H3K27me3 1.5小时。载玻片在PBST中洗涤两次，在含有0.25%BSA的PBST中洗涤两次，在22°C的封闭溶液中用山羊抗兔IgG–Alexa 488覆盖1小时，在PBST和PBS中洗涤两次，并在PBS中的4%PFA中后固定。将载玻片置于细胞缓冲液（100 mM NaCl/300 mM蔗糖/3mM MgCl2/10 mM管道，pH 6.8）30秒，用0.5%Triton X-100在细胞缓冲液中冲洗5分钟，在细胞缓冲溶液中冲洗30秒，并在PBS中的4%PFA中固定10分钟。细胞在70%、80%、95%和100%乙醇中脱水；空气驱动；并在37°C下与XIST公司杂交缓冲液中的RNA探针[2×柠檬酸盐水（SSC）/0.3 M NaCl/30 mM柠檬酸钠（pH 7.0）/50%甲酰胺]。将载玻片在40°C的杂交缓冲液中清洗三次，每次5 min，在40°C的2×SSC中清洗10 min，在22°C的4×SSC内清洗三次5 min。
sat III RNA。
盖玻片上生长的细胞基本上按照说明制备(34). 在某些情况下，细胞在42°C下热休克1小时，然后在37°C下恢复3小时。细胞在PBS中清洗（除非另有规定，否则所有步骤均在22°C下进行），在4%PFA中固定10分钟，在PBS/100 mM Tris（pH 7.4）中清洗，在PBS/0.5%Triton X-100中的冰上清洗两次，分别用冰冷的乙醇（70%、80%、90%和100%）分步脱水5分钟，然后风干。sat III探测器(25)在37°C下杂交过夜。在杂交缓冲液中清洗细胞三次，每次5分钟，在2×SSC中清洗细胞3次，每次5min，在4×SSC/0.1%吐温-20中清洗细胞15分钟；在PBS中20μg/ml FITC–亲和素（载体实验室）中培养60分钟；在PBST中清洗三次，每次3分钟，然后在PBS中清洗；在PBS中的10μg/ml生物素化抗亲和素D（载体实验室）中培养60分钟；在PBST中清洗三次，每次3分钟；然后在PBS中清洗3分钟。在20μg/ml FITC-亲和素（Vector Laboratories）的PBS中培养60分钟，然后在PBST中清洗两次3分钟，然后再在PBS，细胞在含有10%FCS的PBST中封闭30分钟。细胞用抗LA/C（JoL2；Chemicon；1:200）染色60分钟，在PBST中洗涤2次，每次3分钟，在PBS中洗涤3分钟，然后用山羊抗鼠IgG–Alexa 633（1:300）（分子探针）培养60分钟，并在PBS中洗涤。用共聚焦显微镜检查细胞。
FISH探头的制备。
DNA探针XIST公司RNA FISH通过PCR从含有XIST公司使用引物对1aF（acccgttctttttggacag）/1aR（ctcccaaagtgctgagatta）、1bF（aagacaattggaatc）/1bR（gcacataacagcaaaaaa）和12F（ctctcagacctttgag）/12R（ggcctttgaacatt）进行定位。XIST公司RNA FISH探针被Cy3标记（参见参考文献。17)，并按照所述进行杂交(16). 已经描述了用于sat III的探针(25). FISH探针由Integrated DNA Technologies（IA Coralville）提供。
GFP-LA和GFP-LAΔ50的表达。
使用GenePulser Xcell（Bio-Rad）在200 V和950μF下电穿孔，使用≈1×10进行转染7细胞和10-20μg DNA在400μl DMEM中的4 mm间隙比色皿中，使用pEGFP-myc-LMNA公司或pEGFP-myc-hLMNA公司Δ150(1). 将细胞贴在盖玻片上，24–48小时后进行免疫荧光处理。
制备了表达EGFP-myc-LA或EGFP-mcy-LAΔ50的稳定HeLa-Tet-On细胞系。pEGFP-myc的编码区-hLMNA公司或-hLMNA公司Δ150用NheI和XbaI切割，并用XbaI连接到pTRE载体（Clontech）。产生的质粒（pTRE-EGFP-myc-hLMNA公司和-hLMNA公司Δ50)用选择载体pTKHyg（Clontech）以20:1的比率双重转染HeLa-Tet-On细胞。将转染的细胞接种到两个10厘米的培养皿中，孵育48小时，通过胰蛋白酶解释放，并将每个细胞分配到10个10厘米的培养皿中，培养皿保持在含有200μg/ml G418和潮霉素的培养基中，直到出现可见的菌落。将单个菌落转移到24孔板的单个孔中。在每个菌落扩增后，用2 mg/ml多西环素诱导细胞24 h，并用荧光显微镜分析GFP融合蛋白的表达。
致谢
我们感谢A.Wutz和D.Pullirsch（维也纳分子病理学研究所）XIST公司细菌人工染色体克隆和RNA FISH建议。R.D.G.得到了国家癌症研究所、国家老龄研究所、埃里森基金会和Progeria研究基金会的支持。T.D.由奥地利科学基金会的Schroedinger奖学金资助。T.J.得到了博林格·英格尔海姆分子病理学研究所、欧盟（FP6卓越网络，“表观基因组”）和奥地利GEN-AU倡议的支持。
缩写
| Xi（希） | 非活性X染色体 |
| H3K27me3型 | 组蛋白H3在赖氨酸27上三甲基化 |
| H3K9米3 | 组蛋白H3在赖氨酸9上三甲基化 |
| H4K20me3型 | 组蛋白H4在赖氨酸20上三甲基化 |
| HGPS公司 | Hutchinson–Gilford Progeria综合征 |
| 洛杉矶/哥伦比亚 | 层粘连蛋白A/C |
| LAΔ50 | HGPS细胞中的突变LA |
| PFA公司 | 多聚甲醛 |
| 第三阶段 | 卫星III |
| 第页n个 | 通道n个 |
| 高铁293 | 人类胚胎肾293。 |
工具书类
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