人体由至少200种不同类型的细胞组成。这些细胞对胞外信号或胞内信号的反应取决于其特定的谱系“身份”。换句话说,尽管具有相同的基因组,但细胞对相同刺激的反应方式却截然不同。因此,一个强大的“编程”系统必须能够保持并指定每个单元类型的标识。近年来,越来越清楚的是,细胞特性的维持以及在一定程度上细胞特性的规范是由表观遗传事件控制的(费希尔2002;Jaenisch和Bird 2003;谢和盖奇2004;Valk-Lingbeek等人,2004年)。这些表观遗传学事件,包括DNA甲基化和组蛋白的翻译后修饰,通过调节染色质结构来控制每个细胞的转录程序。组蛋白修饰被认为构成了一种索引机制,称为“组蛋白密码”(Jenuwein和Allis 2001),包含过去和现在的基因活性以及细胞的生理状态等信息。这个密码是由其他蛋白质复合物破译的,这些蛋白质复合物专门识别并结合修饰的组蛋白,进而引发印记的生物效应。多梳阻遏物和三胸激活物被认为是这些表观遗传编程事件的核心参与者(奥兰多2003;Molofsky等人,2004年;Valk-Lingbeek等人,2004年).
多梳组基因(PcG)通常被认为是转录抑制物,在发育过程中维持同源异型基因的正确时空表达,最初是根据研究证明PcG基因的缺失导致果蝇的同源异型转化而确定的(奥兰多2003;Ringrose和Paro 2004;Pirrotta和Gross 2005)。脊椎动物同源生物HOX公司基因位于四个不同的簇(A、B、C、D)中,它们被组织成13个同源(或平行)群(Pearson等人,2005年)。每个基因的染色体组织HOX公司簇反映了其在人体平面图中的前后表达。“尾巴”HOX公司5′端的基因HOXA公司轨迹(即。,HOXA7–13型)主要在发育中胚胎的后部表达。在PcG基因敲除小鼠中,对这些“尾巴”的抑制HOX公司胚胎中部和头部的基因受损,导致前后转化缺陷(Levine等人,2004年;Lund和van Lohuizen 2004).
最近的生物化学方法已经证实,PcG蛋白形成多蛋白复合物,称为多梳抑制复合物(PRCs)。PRC2包含EZH2、EED、SUZ12和RbAp48,而PRC1复合物包含10个以上的亚单位,包括癌蛋白BMI-1和HPC蛋白(CBX2、CBX4、CBX7、CBX8)、HPH1-3、RING1-2和SCML(Levine等人,2004年; N.Dietrich、K.Helin和K.H.Hansen,未解释)。在功能上,EZH2是PRC2的催化活性成分,作为组蛋白H3的Lys 27(K27)和组蛋白H1的K26的组蛋白甲基转移酶(曹和张2004;Kuzmichev等人,2004年)。有趣的是,PRC1复合物的HPC蛋白可以与三甲基化的H3K27(H3K27me3)特异性结合(曹和张2004;Kuzmichev等人,2004年; N.Dietrich、K.Helin和K.H.Hansen,未解释)。因为PRC1与染色质结合需要PRC2(Rastelli等人,1993年;Hernandez-Munoz等人,2005年)有人提出,这主要是通过HPC蛋白与H3K27me3结合来实现的。最近,PRC1复合物被证明具有H2A-K119泛素E3连接酶活性,与H3K27me3活性一样,与抑制HOX公司基因(Cao等人,2005年).
除了作为胚胎发育的重要调节器外,PcG还成为维持成人干细胞群的关键角色(Molofsky等人,2004年;Valk-Lingbeek等人,2004年)。例如,BMI-1是造血干细胞和神经干细胞自我更新所必需的(Lessard和Sauvageau 2003年;Molofsky等人,2003年)而EZH2的过度表达能够阻止肌成肌细胞的分化(Caretti等人,2004年)防止造血干细胞衰竭(Kamminga等人,2005年)。与它们在发育、分化和干细胞更新中的关键作用一致,一些PcG是致癌基因,在实体癌和造血癌中过度表达(Pasini等人2004年a;Valk-Lingbeek等人,2004年;Raaphorst 2005年).
尽管在理解PcG蛋白的生物和生化功能方面取得了实质性进展,但我们对其控制发育和细胞命运的精确程度仍知之甚少。由于人们认为它们主要作为转录的表观遗传调节器发挥作用,我们使用平铺阵列进行染色质免疫沉淀(ChIP)和全基因组筛查,以确定人类细胞中的PcG靶基因。令人惊讶的是,我们观察到对控制发育和细胞命运的基因有非常强烈的偏见。我们研究了人类胚胎成纤维细胞和神经元分化模型中PcG调节的功能相关性。此外,我们发现PcG靶向一些肿瘤抑制基因和已知在癌症中下调的基因。基于这些数据,我们提出了PcG如何控制转录的模型。
结果
PRC1和PRC2成员缺失细胞基因表达变化的鉴定
为了了解PcG如何控制发育和细胞命运决定,我们选择鉴定其靶基因。为此,我们想使用特定的PcG抗体进行ChIP实验,然后用富集材料(ChIP-on-ChIP)探测微阵列(芯片)。作为初始筛选,我们通过对PcG缺失细胞进行表达阵列分析来确定候选基因。然后,通过生成平铺阵列来映射这些潜在靶基因的完整位点,并用富集的材料进行探测,我们旨在识别功能相关的直接靶点。
我们用对PRC2组分(EZH2、EED和SUZ12)或PRC1组分BMI-1特异性的小干扰RNA(siRNA)寡核苷酸转染增殖的人类胚胎二倍体成纤维细胞(TIG3)。转染后44小时制备的裂解物的蛋白质印迹分析证实,siRNA有效地抑制了其特定靶标的蛋白质合成(图。)。如前所述,PRC2成员的蛋白质水平部分取决于复合物中其他伙伴的存在(Pasini等人,2004b)。此时提取RNA,标记并杂交到Affymetrix基因表达阵列(HG-U133)。siRNA寡核苷酸的短潜伏期在数百个基因中产生了微小但可重复的表达变化。我们观察到,在抑制BMI-1和PRC2复合物的三种蛋白的表达后,基因表达变化有很大重叠(图。)。为了避免在随后的ChIP-on-ChIP分析中遗漏任何相关基因,我们总共选择了341个基因作为潜在的PcG靶基因,在我们的实验中分析的四个PcG蛋白中,至少有三个蛋白下调后,其表达会发生显著变化(图。; 补充表1)。通过对18个基因进行定量实时PCR分析(qPCR),确认了表达阵列数据的可靠性(图。; 数据未显示)。
全基因组表达筛查,以确定Polycomb缺失细胞中的基因变化。(A类)用siRNA寡核苷酸转染TIG3成纤维细胞44 h后制备的裂解物进行Western blot分析,siRNA寡糖旨在抑制EZH2、EED、SUZ12或BMI-1的表达。Tubulin被用作负荷控制。(B类)描述基因重叠的维恩图在PRC2(EZH2、EED和SUZ12组合)和PRC1(BMI-1)缺失中增加了1.2倍以上。(C类)Affymetrix表达数据的三视图表示,描述了多梳缺失细胞中的基因表达变化。(D类)通过qPCR对基因选择的基因表达变化进行验证(如图所示B类)。mRNA由转染Mock(M)、EZH2(Z)、EED(E)、SUZ12(S)或BMI-1(B)siRNA的TIG3细胞制备。实验独立于基因表达阵列实验进行。
PcG结合和重叠H3K27三甲基化HOX公司基因簇
为了通过ChIP分析识别目标基因,我们首先筛选了一些对PRC1和PRC2蛋白以及三甲基化H3K27特异的候选抗体,以了解它们在ChIP条件下有效地结合免疫沉淀组蛋白H3的能力(数据未显示)。从该分析中,我们选择了针对SUZ12(PRC2)、CBX8(PRC1)和H3K27me3的特异性抗体。为了在ChIP-on-ChIP分析中验证这些抗体的特异性,我们代表了HOXA、HOXB、HOXC、,和HOXD公司平铺芯片上的基因座。我们用连接介导PCR扩增的chips DNA来探测这些芯片,这些chips使用H3K27me3、SUZ12和CBX8特异性抗体,HA抗体作为阴性对照,E2F3抗体作为ChIP技术的阳性对照。在图中,在整个HOXA公司轨迹在Log中以高分辨率描述2和正常范围。SUZ12、CBX8和H3K27me3在霍克斯9基因并向上游延伸HOXA13型基因,延伸约45kb。有趣的是,在HOXA9–13型基因“覆盖”其完整的基因位点,并且不局限于其启动子区域。在HOXB、HOXC、,和HOXD公司位点(补充图S1)。作为抗体特异性的进一步确认,我们没有观察到PcGs或H3K27me3在大量控制基因上有任何显著富集,包括E2F靶基因CDC6型和CCNA2型(补充图S2)。
PcG蛋白和H3K27me3在HOXA公司基因簇。(A类)ChIP-on-ChIP平铺阵列分析HOXA公司从第7染色体上的26880000位开始,跨越140 kb DNA的位点。通过表示2840个50 bp的探针,实现了140 kb的高分辨率映射,探针之间的平均间距为3 bp。这个Y(Y)-轴表示日志2所示抗体的信号比率(结合/输入)。启动子ChIP-on-ChIP实验的结果也显示了HOXA公司发起人。在该分析中,使用包含24275个人类启动子的芯片,从TSS上游1300 bp到下游200 bp,使用15个50 bp探针,探针之间的平均间距为100 bp。(C) 自定义ChIP-on-ChIP数据;(P) 启动子ChIP-on-ChIP数据。(B类)XY公司中描述的数据的散点图表示A、,通过绘制5-kb间隔的平均富集度来创建。(C类)启动子的正常ChIP分析HOXA公司基因簇。在所有的启动子区域内设计引物(用红色条表示)HOXA公司基因如顶部面板的。富集度显示为百分比输入。
为了验证在拼接芯片上观察到的富集情况,我们使用在所有启动子区域设计的引物,通过qPCR对一个独立的ChIP实验的免疫沉淀DNA富集进行量化HOXA公司基因(图。)。这表明EZH2沿着HOXA公司与SUZ12、CBX8和H3K27me3具有几乎相同轮廓的位点。值得注意的是,聚合酶II仅在HOXA4型和HOXA5型基因是唯一在胚胎成纤维细胞中表达的同源基因,这与这些细胞起源于中胚层的事实一致。
PcG调控表达的靶基因的鉴定
接下来,我们在定制设计的平铺芯片上表示了在表达阵列分析中鉴定的341个基因位点,从转录起始位点(TSS)上游15kb开始,到最后一个已知外显子3′端下游5kb结束(补充表1)。我们将这些芯片与用于分析HOX公司基因座。CBX8、SUZ12和H3K27me3的特定富集在启动子或43个基因的基因位点内的其他地方检测到,如图中的树状图所示补充表2中给出了这些基因上确切的PcG-结合位置的详细描述。我们观察到两种类型的富集,一种是以特定点为中心的封闭“钟形曲线”,另一种是“毯子”型,可能由多个峰融合在一起组成。例如,SUZ12、H3K27me3和CBX8在TSS内形成钟形曲线富集ATF3、BMP2、,和丹麦克朗基因(图。; 补充图S3),而在OTX2、CCND2、,和MT1G型基因(图。; 补充图S3;补充表2)。这个MT1G型基因是金属硫蛋白多基因簇的一部分(MT1E、MT1J、MT1A、MT1B、MT1F、MT1G、,和MT1H公司)具有类似于HOX公司基因座(补充图S3;补充表3)。
43个PcG靶基因的鉴定,这些基因在多梳缺失细胞中的表达发生了变化。(A类)对43个直接PcG靶基因的多梳缺失细胞表达变化的三视图描述。(B类)XY公司SUZ12、H3K27me3和CBX8基因座富集的散点图表示BMP2、ATF3、BMI-1、,和CCND2。描述了染色体数目和覆盖区域在上面每个面板。(C类)使用先前确定的标准ChIP分析新确定的Polycomb靶基因第一个多年电价靶基因作为阳性对照。这个CCNA2号机组和HOXA1型基因表现为阴性对照。
有趣的是,SUZ12和CBX8也出现在BMI-1型和CBX8系列基因位点和与H3K27me3富集相关(图。; 补充图S3)。的表达式BMI-1型和CBX8系列在siRNA介导的其他PRC1或PRC2成员耗竭后增加(图。,)。因此,这些数据表明PcG蛋白能够自动调节自身的合成。这在进化过程中是保守的,因为PcG蛋白与多同源异型(Ph)位点结合果蝇属(Fauvarque等人,1995年;Bloyer等人,2003年).
接下来,我们在独立实验中验证了这些新确定的靶基因的选择,以用于EZH2、SUZ12、CBX8和H3K27me3的富集(图。)。先前确定的SUZ12靶基因第一个多年电价(Kirmizis等人,2004年)作为阳性对照HOXA1型和CCNA2号机组基因作为阴性对照。最后,几个靶基因的表达(MT1G、CCND2、SERPINB2、,和密码b1)测试并显示在BMI-1-过表达TIG3细胞中减少(数据未显示),进一步证实它们是该细胞系统中的PcG靶基因。我们的结论是,我们已经确定了43个PcG蛋白的靶基因,其在缺乏PcG的细胞中的表达发生了变化。
也许令人惊讶的是,先前表征的SUZ12靶基因的mRNA转录本第一个多年电价以及HOXA7–13型在缺乏PcG的细胞中仍无法检测到这些基因(数据未显示)。尽管事实上,我们观察到PcG在其发起人身上大量富集(图。,)。因此,为了鉴定人类胚胎成纤维细胞中的所有PcG靶基因,我们决定对独立于其表达的PcG结合启动子进行全局无偏见鉴定。
PcG结合人类启动子的全基因组鉴定
我们查询了含有24275个人类启动子探针的芯片,该探针位于TSS上游1300个碱基对(bp)到下游200 bp的特定区域内。值得注意的是,PcG在图中描述的70%的靶基因中结合在这个有限的启动子区域内(见补充表2)。如图所示并且在补充表3中列出,SUZ12、CBX8和H3K27me3存在于大量启动子上。CBX8(PRC1)在2487个启动子上显著富集(占总数的10.2%),H3K27me3在2206个启动子(9.0%),SUZ12(PRC2)在1042个启动子中显著富集(4.3%)。PRC1和PRC2结合的启动子之间存在非常显著的重叠,它们也在H3K27上三甲基化,这与PRC1依赖于PRC2介导的K27三甲基化来结合染色质的能力一致(Hernandez-Munoz等人,2005年;Pirrotta和Gross 2005)。一些H3K27me3富集的基因似乎没有相关的CBX8,这表明该标记可能独立于PRC1复合物执行不同的功能。或者,PRC1可能通过两个含染色域的CBX8同源物CBX4或CBX7与这些基因结合。已鉴定的大量基因仅与CBX8显著结合,不太可能成为CBX8的特异靶点。事实上,当随后在定量ChIP分析中进行测试时,发现属于这一类别的基因也具有显著的H3K27me3和SUZ12结合,例如,CYP1B1型和丹麦克朗(参见图。和补充表3)。因此,大量仅与CBX8结合的基因可能是CBX8抗体对其表位更高亲和力的结果,而不是PRC2依赖性招募的反映。总之,我们使用启动子阵列的结果将PcG靶基因的储备扩展到了>1000(图。; 补充表3)。
PcG靶基因启动子的全基因组定位。(A类)维恩图描述了启动子上SUZ12、CBX8和H3K27me3的存在之间的显著重叠。(B类)Polycomb靶基因在进化过程中的显著保守性果蝇属对人类而言。几个已确认或预测果蝇属PcG靶基因显示在左边列。在我们的分析中,我们确定其人类同源物为人类PcG靶点(见补充表3)。(C类)本研究中确定的一系列PcG靶基因,重点关注那些已知参与控制发育、分化、干细胞生物学和细胞命运决定的关键途径的基因。
接下来我们问:确定的目标基因的性质是什么?值得注意的是,我们发现,大多数先前确定或预测为PcG靶基因的基因果蝇属将人类同源物识别为该屏幕中的PcG靶点(图。;林格罗斯和帕罗2004;Ringrose等人,2004年)。除了HOX公司基因,我们发现雕刻、刺猬、毛茸茸的,和尾部都有人类PcG靶同源物。有趣的是,另一个目标果蝇属是多形同源基因位点。如上所述,我们发现人类PcG也与BMI-1型和CBX8系列基因位点,现在扩展到包括CBX4系列和CBX7系列基因座。
PcG靶向干细胞和分化特异性基因
我们希望在生物学相关的分化模型中研究靶基因的PcG动力学。全球定位分析表明,PcG结合了许多在不同类型分化中特异诱导的基因(表)。例如,骨形态发生蛋白6(Kugimiya等人,2005年),homebox基因PAX4型(Wang等人,2004年),MYOG公司(Rohwedel等人,1994年),DMBT1型(Al-Awqati 2003年)、和ZIC1公司(Sato等人,2005年)分别是在成骨、内分泌分化、肌发生、上皮细胞分化和神经发生中诱导的特异性分化因子。最近的结果表明EZH2抑制肌肉肌酸激酶基因CKM公司在非分化成肌细胞中,当基因被激活时,在肌肉分化时从基因启动子中移出(Caretti等人,2004年)。我们的结果表明,PcG靶向大量组织特异性分化基因,如CKM公司(见表),这表明在终末分化期间,PcG从分化特异基因中移位是一种普遍现象(如图。,面板i)。
PcG与神经元分化过程中被抑制或诱导的基因结合。(A类)PcG如何在终末分化期间调节基因表达的模型。(B类)两个PcG靶基因的qPCR和ChIP分析(ZIC1公司和中小企业2)用1μM RA处理NT2/D1细胞的神经元分化过程中诱导。(C类)两个基因的qPCR和ChIP分析(神经病学2和OLIG2公司)用1μM RA处理NT2/D1细胞的神经元分化过程中受到抑制。
表1
PcG-ChIP-on-ChIP鉴定的分化基因示例
为了验证这一点,我们选择关注神经元分化,原因如下。大量神经元分化基因与PcG结合(表)。PcG是神经元发育和神经干细胞自我更新所必需的(Leung等人,2004年;Molofsky等人,2004年)。此外,有几种成熟的神经元分化过程模型系统。作为模型系统,我们选择了人类胚胎畸胎瘤细胞株NT2/D1,该细胞具有神经前体细胞特性,经维甲酸(RA)处理后沿神经谱系不可逆分化(Lee和Andrews 1986年).
我们根据它们在神经元分化中的作用选择了四个基因:锌指域转录因子基因ZIC1公司正常神经元分化所必需的(格林伯格和米伦2005); 同源盒转录因子美2; RA受体β,风险调整资产基础; 神经丝轻链基因,NEFL公司(Zhu等人,1997年)。这些基因的表达是在分化过程中诱导的(Zhu等人,1997年;Niederreither等人,2000年)以及在RA诱导NT2/D1细胞分化期间(图。; 数据未显示)。与分化期间这些基因的表达增加一致,我们观察到PcG结合和H3K27me3在这些基因上的富集逐渐减少(图。; 数据未显示)。这些数据与图中描述的模型一致由于PcG与分化细胞中的大量组织特异性基因相关,这表明激活组织特异基因的分化特异性信号导致PcG从基因中移位。
随后,我们决定研究在分化过程中沉默的PcG靶基因。图中描述了这将如何发生的潜在模型在第二组中,我们推测PcG会在分化过程中被招募。为了验证这个假设,我们选择了三个在神经元祖细胞中高度表达但在分化过程中沉默的基因(图。)。这些包括基本螺旋-环-螺旋(bHLH)原神经转录因子的基因OLIG2公司(Lee等人,2005年)和神经病学2(Ma等人,1996年)和金属硫蛋白1G基因,MT1G。与我们的预期相反,ChIP实验表明,在未分化细胞中,PcG与这些基因的启动子上存在H3K27me3的强烈而显著的结合(图。)分化过程中仅略有增加。这些结果表明,未分化细胞中PcG与靶基因的结合与转录沉默没有严格相关。
为了了解这个有趣的结果是否可以推广到其他基因,我们分析了PcG与HOXA公司NT2/D1细胞分化前后的位点。以前的数据表明HOX公司RA诱导NT2/D1细胞分化后,基因表现出忠实的调控模式(Simeone等人,1990年;Houldsworth等人,2002年)。如图所示如图所示,(后)5′末端基因(HOXA7–13型)在未分化细胞中表达,但在RA治疗后显著抑制。相反,位于位点(前部)3′端的基因(HOXA1–5型)变得非常活跃。我们确定了EZH2和CBX8的结合以及H3K27me3在完整HOXA公司诱导前后的位点进行区分。与图中分析的基因一致,PcG从激活的HOXA1–5型分化过程中的基因位点,虽然它们已经与HOXA7–13型未分化NT2/D1细胞中的基因(图。)并在整个分化过程中保持结合,随后mRNA表达下降。这些结果在HOXA公司该簇扩展了基因集,这些基因在未分化细胞中转录活跃,但在分化细胞中受PcG抑制之前被PcG结合。
多梳处于活动状态HOX公司非分化细胞中的基因。(A类)基因表达沿HOXA公司RA-介导的神经元分化诱导位点。(B类)mRNA表达变化的量化HOXA公司qPCR检测NT2/D1细胞神经分化过程中的基因。(C类)EZH2、H3K27me3和CBX8与启动子结合的ChIP分析HOXA1型到HOXA13型RA治疗10天前后的基因。(D类)例如,PcG从分化过程中激活的靶基因移位,ZIC1、MEIS2、RARB、,和HOXA1–5型在神经元分化和CKM公司成肌细胞分化。(E类)未分化细胞中某些靶基因的多梳“预编程”,例如,神经系统2、OLIG2、,和HOXA9–13型。这些基因在未分化细胞中被PcG结合时表达矛盾。分化过程中触发PcG抑制功能的几个假设机制是可能的,包括PcG翻译后修饰、添加H1K26me3或泛素化H2A-K119标记、DNA甲基转移酶的招募、附加转录抑制因子的结合、,或这些机制的组合。
讨论
通过全基因组定位分析,我们确定了1000多个与PcG蛋白结合的推测基因。引人注目的是,这些基因包含Wnt、TGFβ、FGF、Notch和Hedgehog信号通路的关键成员,这些信号通路被称为发育和分化过程的调节器。此外,靶基因在整个进化过程中都是保守的果蝇属这表明,这种转录调控网络对所有多细胞生物的发育和分化至关重要。
多梳靶基因
通过对人类胚胎成纤维细胞进行基因表达谱分析,结合ChIP-on-ChIP实验,我们确定了43个PcG靶基因,其表达依赖于PcG。由于PRC2组分(EZH2、EED和SUZ12)或PRC1组分BMI-1(43个中的39个)的siRNA的特异性缺失,这些基因中的绝大多数被解除表达。这些靶基因包括骨、软骨和脂肪分化的几个已知标记(补充表2)。具体来说,成纤维细胞是中胚层的增殖细胞,构成几乎所有组织和器官结缔组织的一部分。它们来源于间充质干细胞,是一种多潜能的前体细胞,能够分化为成骨细胞、脂肪细胞、嗜铬细胞、内皮细胞以及非中胚层型谱系,如神经样细胞(卡西姆2004)。有趣的是,有证据表明,组织培养中的胚胎成纤维细胞至少保持了间充质干细胞的一些多向分化能力。例如,小鼠胚胎成纤维细胞可以进行致衰老和脂肪细胞分化(Ge等人,2002年;Lengner等人,2004年)。与此相一致,我们发现多克隆缺失细胞中骨细胞、嗜铬细胞、脂肪细胞和神经分化的几个标记物上调(图。; 补充表2)。例如,骨形态发生蛋白BMP2和Wnt/β-catenin信号蛋白丹麦克朗成骨细胞终末分化的功能(Li等人,2005年)。While期间HEY1型和TCF7公司在成骨过程中被转录激活(de Jong等人,2004年),均为CHST11(Kluppel等人,2005年)和PRKG2(Chikuda等人,2004年)与软骨细胞的慢性分化有关,后者是软骨细胞从增殖向肥大分化的分子转换。G0S2蛋白参与脂肪细胞分化(Zandbergen等人,2005年)UCP1是棕色脂肪组织的特异性标记物。此外,其他几个靶基因是已知的发育调节因子,例如RARB、WT1、,和同源异型盒基因SALL1公司和HOXA5。综上所述,结合ChIP-on-ChIP和人类胚胎成纤维细胞表达阵列分析,已鉴定出43个新的PcG靶基因,它们在间充质分化和发育中具有重要的调控作用。
令人惊讶的是,在人类胚胎成纤维细胞中,只有相对较少数量的>1000个已识别PcG靶基因的表达受到PcG耗竭的影响,并且>90%的已识别靶基因未检测到表达。这与之前的观察结果一致Kirmizis等人(2004年)SUZ12缺失的SW480结肠癌细胞。我们假设,在成纤维细胞中发现的1000个PcG靶基因中,大多数是永久沉默的。这种永久性抑制可能是由于靶基因启动子的二次表观遗传修饰,例如EZH2复合物本身或DNA甲基化。支持这一观点的是EZH2具有H1K26甲基化活性的证明(Kuzmichev等人,2004年)因为H1K26me3可以将HP1连接到染色质(Daujat等人,2005年),这可能会在PcG靶基因上增加一层转录抑制。此外,最近研究表明,EZH2的表达足以向细胞启动子募集DNA甲基转移酶,从而导致其DNA甲基化和抑制(Vire等人,2005年)。在缺乏PcG的细胞中,这种次级抑制性修饰可能不会减轻。作为对成纤维细胞中大量PcG靶基因缺乏表达的另一种补充解释,我们认为成纤维细胞可能缺乏组织特异性靶基因表达所需的特异性转录激活剂,如表.
描述PcG调节细胞命运决定的机制
PcG结合基因的鉴定使我们能够开始研究PcG抑制转录的机制。我们的结果基于神经元分化模型,提出了至少两种替代机制(如图。)。第一种模型以基因为例,例如ZIC1、MEIS2、,和HOXA1–5,在未分化细胞中被PcG结合和抑制。在诱导分化后,PRC1和PRC2被尚未确定的机制从这些基因中取代,导致其去表达。该模型与之前的结果一致,表明PcG在肌肉和生殖细胞终末分化过程中的作用类似(Caretti等人,2004年;Chen等人,2005年)并预测这是一种普遍现象。
替代模型描述了PcG靶基因在分化过程中下调的时间(图。)。该模型基于令人惊讶的观察结果,即PcG在某些情况下与未分化细胞中的靶基因结合,尽管该基因正在积极表达。根据我们的结果OLIG2、神经病学2、,和HOXA9–13,我们认为这些PcG靶基因已经“预先编程”,在适当的细胞命运信号下被抑制。为了支持这一假设,帕罗实验室证明果蝇属PcG和Trithoris蛋白与多梳反应元件(PRE)和HOX公司在基因的表达水平由早期作用的分割因子设定之前(Orlando等人,1998年)。进一步支持这一概念,我们观察到H3K27me3和SUZ12在整体上富集霍克斯A小鼠胚胎干细胞中的位点,类似于未分化NT/D1细胞中观察到的轮廓(图。; 附图S4;数据未显示)。这表明HOX公司控制细胞命运的基因和其他基因是预设的或“程序化”的,可能是由母体mRNA产生的合子中的PcG引起的。在这个模型中,RA浓度等特定的发育信号可能通过尚未确定的机制触发PcG抑制能力。这可能涉及PcG蛋白的翻译后修饰,PcG对其他蛋白/组蛋白的修饰,或PcG靶基因转录调控因子的特异性招募/解离(图。)。因此,我们认为PRC在发育和分化过程中起到了传导抑制信号的“平台”的作用。
总之,我们预测PcG构成胚胎发生早期建立的发育和分化的表观遗传蓝图的一部分。未来的研究有望揭示PcG蛋白、H1K26me3和泛素化H2A-K119等修饰物以及相关蛋白(如HP1和DNA甲基转移酶)在多种类型细胞命运决定过程中对此处确定的1000多个基因的精确机制贡献。未来的另一个挑战是利用这些知识,以便我们能够去分化或反式-分化细胞用于治疗目的。
材料和方法
组织培养
人二倍体胚胎肺成纤维细胞TIG3细胞系和胚胎癌细胞系NTERA2(NT2/D1)(Lee和Andrews 1986年)在补充了10%(v/v)FCS的DMEM中生长。为了诱导NT2/D1细胞分化,将异步生长的细胞接种在30%的汇合处,24小时后用1μM ATRA(溶解于DMSO;Sigma)处理。在0、2、5和10天收集用RA连续处理的培养物以提取RNA,或在0、5和10d收集用于ChIP。培养物每3-4天播种一次,并在播种后不少于24小时收集。
抗体的产生
使用分别对应于人类CBX8氨基酸107–129(KKPGRSPQDLASTSRAREGLRN MGL)和295–318(KKGQGALDPNTRVRHGSGPPSSGG)的合成肽,在兔子体内产生两种多克隆CBX8(hPc3)抗体“LAST”和“GALD”。这些药物通过N-末端赖氨酸残基与Keyhole Limpet血蓝蛋白(KLH)偶联,并按照标准程序(DAKO)皮下注射到兔子体内。根据标准程序,在相应肽抗原上对产生的阳性血清进行亲和纯化。对于ChIP分析,每次免疫沉淀使用5μg亲和纯化抗体池。
用qPCR定量mRNA水平
cDNA是使用PE Applied Biosystems TaqMan逆转录试剂通过RT-PCR生成的。使用SYBR Green I检测化学系统(Applied Biosystems)和ABI Prism 7300序列检测系统测定反应。泛素被用作正常化的对照基因。使用的引物序列可根据要求提供。
Affymetrix表达分析
从mock、EZH2、EED、SUZ12和BMI-1 siRNA转染的细胞中提取总RNA。对于每个处理,从六个独立的实验中制备RNA,并将其合并到一个样本中,以减少实验差异。根据供应商的说明(Affymetrix)合成微阵列杂交靶点。人类基因芯片阵列U133A(Affymetrix)用于基因表达谱分析,该阵列可查询约33000个转录物。15个基因芯片阵列U133A用于此分析;对于每种不同的条件,将三个单独的阵列与混合的cRNA进行杂交。根据制造商的说明,在意大利米兰IFOM-IEO园区的Affymetrix微阵列单元进行杂交、清洗、染色、扫描和数据分析。使用Microarray Analysis Suite(MAS)5.0统计算法软件(Affymetrix)分析表达水平,使用所有基因芯片阵列的默认参数和缩放(TGT值)信号强度,将值设置为500。模拟siRNA处理被用作与多梳siRNA处理样品进行比较的基线条件。
ChIP分析
基本上如前所述执行和分析了ChIP(Bracken等人,2003年)。使用的抗体是兔抗E2F3(sc-878;Santa Cruz)、抗PolII(sc-899;Santa Cruz)、抗H3K27me3(Upstate)、抗SUZ12(Upstate)、抗HA(sc-805;Santa Cruz),一种对EZH2(AC22)具有特异性的小鼠单克隆抗体(Pasini等人,2004b)以及上述CBX8多克隆抗体的等量混合。对于正常染色质IP,免疫沉淀DNA通过实时qPCR定量。PCR引物的序列可根据要求提供。如前所述,用LMPCR扩增免疫沉淀DNA以代替ChIP-ChIP分析(Ren等人,2000年)并与NimbleGen Systems,Inc.生产的平铺阵列进行混合(http://www.nimblegen.com网站).