猴免疫缺陷病毒在灵长类淋巴结邻接儿茶酚胺能性静脉曲张处的增强复制

病毒载量和CD4⁺-T细胞计数。

1500-1530小时，使用非肝素注射器从未麻醉的动物身上采集血液，并立即转移到含有EDTA的试管中。使用Serono-Baker诊断系统（宾夕法尼亚州阿伦顿）进行全血计数，所有电子计数均通过手动微分进行验证。流式细胞术对淋巴细胞亚群进行表型分析。全血与藻红蛋白-抗CD4（克隆M-T477）、抗CD8（克隆SK1）和异硫氰酸荧光素-抗CD3（克隆SP34）（所有来自BD Pharmingen的抗体）孵育。溶解红细胞，使用Coulter Q-prep（Coulter Corp.）固定样品，使用FACSCalibur流式细胞仪（BD Pharmingen）通过正向和侧向光散射对淋巴细胞进行门控。如前所述，使用SIV特异性分支DNA信号扩增分析对SIV RNA进行定量(22).

淋巴结。

肌肉注射盐酸氯胺酮（10 mg/kg）和间托米丁（0.03 mg/kg）固定动物，并在活检部位的近侧和内侧皮下注射布比卡因。对20只猴子（9只对照和11只SIV阳性[SIV⁺]猴子）在接种后37周存活。从每只动物身上取下四个腋窝淋巴结并用液氮冷冻。用低温恒温器以随机选择的方向在16μm处对来自6只注射盐水的对照猴的9个淋巴结和来自9只感染SIVmac251的动物的13个淋巴结的随机样本进行切片，相邻切片（i）用苏木精和伊红（H&E）染色以获得大体形态，（ii）通过原位杂交检测SIV复制，如下所述，以及（iii）通过蔗糖-磷酸-聚羟基乙酸（SPG）组织荧光检测儿茶酚胺神经纤维，如下所示。

原位杂交。

利用探针原位杂交技术定位SIV活性复制位点以检测SIV环境价值,堵住、和nef（奈夫）mRNA。冷冻切片固定在4%多聚甲醛中，在1 mg/ml蛋白酶K（Sigma）中37°C下消化5分钟，并在杂交缓冲液中预混合（50%甲酰胺、10%硫酸葡聚糖、0.05%十二烷基硫酸钠、0.05%聚乙烯吡咯烷酮、500μg/ml煮沸鲑鱼精子DNA、260μg/ml酿酒酵母tRNA、50 mM Tris HCl、pH 7.4、300 mM NaCl、2 mM EDTA）在37°C下保持2小时。如前所述，通过PCR合成单牌DNA探针，并用地高辛（Boehringer Mannheim）标记(4). 将所有三个互补探针（或作为阴性对照的三个感测探针）的混合物混合在杂交缓冲液中，在65°C下变性5分钟，并在37°C下杂交至各切片过夜。杂交后，在37°C下，在2×SSC（1×SSC是0.15 M NaCl加0.015 M柠檬酸钠）、1×SSC-和磷酸盐缓冲盐水中连续清洗玻片，然后在25°C下在DIG检测试剂盒封闭溶液（Boehringer Mannheim）中培养30分钟。使用碱性磷酸酶结合的抗地高辛抗体（Boehringer-Mannheim）在NBT/X-磷酸盐（Boehlinger-Mansheim）溶液中孵育4至6小时，观察杂交效果。切片用中性红或免疫荧光染色，并用水性固定介质覆盖。

免疫荧光。

用亲和素和生物素溶液（DakoCytomation）预处理对甲醛固定切片，以阻断内源性生物素，并在4°C下与CD3（兔多克隆；DakoCycomation）、CD20（L26；Zymed）、巨噬细胞标记物（HAM56；DakoCeotomation）和滤泡树突状细胞标记物（CNA.42；DakoCytomation）、CXCR4（12G5；BD Biosciences）、CCR5（3A9；BD生物科学）或阴性对照小鼠免疫球蛋白G或免疫球蛋白M（DakoCystomation）。清洗切片并用适当的Alexa结合二级抗体（分子探针）或生物素化二级抗体进行培养（载体实验室），然后用链霉亲和素Alexa（分子探测器）进行培养。切片用Hoechst 33342（分子探针）复染，盖玻片，并用荧光显微镜成像。在某些情况下，原位杂交染色似乎阻止了抗体的后续结合，从而阻止了SIV的最终鉴定⁺细胞。然而，所有SIV⁺细胞显示出小的圆形淋巴细胞样形态，表明毛囊树突状细胞对SIV RNA信号的贡献很小。

儿茶酚胺荧光。

用SPG化学荧光法绘制儿茶酚胺能神经纤维的空间分布(11)带有已确定的反染色修改(15). 简单地说，将16-μm冰冻切片熔化到玻璃载玻片上，并立即浸入乙醛酸-白榴石绿溶液（1%乙醛酸，0.236 m一元KH₂人事军官₄，0.2 M蔗糖，1.75 mg/ml孔雀石绿，pH 7.4）5 s，然后将玻片浸入不含孔雀石绿色的乙醛酸溶液中5 s。在冷空气流下将玻片完全干燥，然后用一滴轻质矿物油覆盖并加热至95°C 2.5 min。冷却玻片并盖住玻片。如下文所述，使用长通紫外滤光片（Chroma Technologies）通过荧光显微镜定量蓝白色儿茶酚胺荧光。

图像处理。

用于原位杂交/免疫荧光共表达分析，SIV⁺用NBT/X-磷酸色原原位杂交SIV特异性转录物检测细胞，并用亮场显微镜成像。用多通道荧光显微镜对同一区域进行成像，以对细胞表面标记物（CD3/CD20或HAM56/CD20）和Hoechst 33342核染色进行抗体染色。使用Photoshop 7.0倒置亮场图像并与荧光图像叠加，以显示SIV的共定位⁺细胞和细胞表面标记物。使用细胞表面标记物（CD3/CD4或CD3/CCR5），也可以使用单场和图像叠加的类似多通道荧光成像来识别允许病毒感染的细胞。为了分析儿茶酚胺能神经支配与SIV复制部位之间的关系，使用Axioskop 2显微镜（Zeiss）以×200倍放大率对每个淋巴结断面的整个表面进行数字成像。使用AxioCam HRc彩色摄像机和AxioVision 4.1软件（蔡司）采集图像。将单个图像组合成代表整个截面的单个数字文件和250-μm的网格²重叠空间单位以提供相邻组织切片之间的配准（如图。​图5a）。5a级). 经验丰富的兽医病理学家（R.P.T.）对儿茶酚胺能神经纤维和SIV RNA的位置数据视而不见，在H&E染色切片中鉴定了每个淋巴结的解剖亚区（皮质、副皮质和髓质）。每个空间网格单元或“象限”被分配到一个解剖亚区，将跨越两个或多个解剖分区的样方进行划分，以确保每个分析单元代表一个解剖区域。通过SIV五个淋巴结H&E染色切片的细胞计数，测量皮质、副皮质和髓质样方内的单核细胞密度⁺动物和未感染对照组的五个淋巴结。在病理学家不了解情况的情况下，从每个淋巴结的每个解剖区域随机选择三个样方，对细胞进行计数。

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图5：。

SIV复制和ANS神经支配的克隆化。SIV在整个淋巴结节段（a）复制的空间频率由250-μm范围内活跃病毒复制病灶（箭头）的数量定义²空间单位或样方（b）。（c） 250μm内SIV活性复制的几率（通过原位杂交）²含有一个或多个实质性儿茶酚胺能静脉曲张（ANS）与无（无ANS）的样方。通过Cochran-Mantel-Haenszelχ分析4300个评估样方的差异频率的统计意义²分析（比值比=3.9；差异，P（P）< 0.0001). （d） 相邻16μm切片的代表性样方，通过SPG化学荧光（黑色）绘制儿茶酚胺能静脉曲张图，通过病毒RNA原位杂交绘制SIV复制图（蓝色箭头）。（i和ii）在儿茶酚胺能性静脉曲张附近有SIV活跃复制的髓质淋巴结的典型例子（ii）（i）。（iii和iv）在缺乏儿茶酚胺能静脉曲张的样方中，髓质淋巴结无SIV复制的典型例子（iv）（iii）。

我们使用无偏体视学方法评估含有一个或多个儿茶酚胺能静脉曲张的淋巴结组织样方中SIV复制位点的密度，而不含任何样方。使用Mouton之前描述的方法(26)，我们（i）以随机选择的方向切片淋巴结，通过三维组织空间提供随机的二维（2-D）样本，（ii）在每个截面内的所有二维组织样方中列举SIV复制位点和儿茶酚胺能静脉曲张，（iii）使用Delesse面积-体积原理(26)根据具有儿茶酚胺能静脉曲张与不具有儿茶酚能静脉曲张症的组织单位中的2-D SIV RNA频率数据估计SIV复制的3-D密度，以及（iv）使用内部节点方法进行所有统计比较（即，对每个组织样本中含有一个或多个儿茶酚胺能静脉曲张的样方与不含儿茶酚醛能静脉曲张症的样方进行SIV复制密度差异的组织特异性估计，然后对多个组织样本的差异估计进行平均，以从我们的随机样本中生成种群水平估计肿块组织）。这种方法允许从二维组织学轮廓准确估计三维SIV复制密度，同时控制偏差的技术来源（例如，跨淋巴结的组织收缩差异、淋巴结大小差异、皮质、副皮质和髓质等亚区分布的变化等）(26). 使用这种方法，估计每个组织样方中儿茶酚胺能静脉曲张数量的任何错误都会导致保守地低估含有ANS神经支配的组织与不含ANS神经的组织中SIV复制率的真正差异(25).

猕猴淋巴结的儿茶酚胺能神经支配。

为了确定灵长类淋巴结内功能性ANS神经纤维的位置，我们使用SPG化学荧光来绘制含儿茶酚胺神经纤维的分布图。在分析的24个淋巴结中，23个淋巴结的实质中检测到儿茶酚胺能纤维，包括来自未感染对照组的所有标本。图​图22显示了腋窝淋巴结中儿茶酚胺能神经纤维的SPG定位示例。如之前在啮齿动物样本中发现的(2)猕猴淋巴结周围的血管有密集的神经支配（图。​（图2a）2a个)淋巴结实质的分支神经支配（图。​（图2b）。2亿). 实质神经支配的特点是树突状结构具有频繁的静脉曲张，这些静脉曲张被认为是神经递质释放的部位(16)（图中用箭头标记。​图2b）。2亿). SPG化学荧光对儿茶酚胺神经递质具有特异性，因此这些发现证实了先前报道的迹象，即哺乳动物淋巴组织通过ANS的交感神经分裂显示出实质神经支配（即与血管系统无关的儿茶酚胺能神经纤维）(23,34,37). 这些结果表明，灵长类淋巴结维持着含有儿茶酚胺神经递质的ANS神经纤维，这些神经递质可能会影响慢病毒的复制。

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图2。

SPG荧光检测交感神经元。16微米淋巴结切片用SPG染色，以化学荧光检测卡他胆胺能性静脉曲张。儿茶酚胺能神经分布于血管（a）周围、皮质旁实质（b）以及皮质和髓质的实质区域（数据未显示）。箭头表示儿茶酚胺能静脉曲张，被认为是儿茶酚胺释放的主要部位(16).

SIV复制。

图​图3三（a至d）显示原位杂交检测来自堵住,波尔、和nef（奈夫）SIV感染动物淋巴结中的基因。用未感染淋巴结或感染淋巴结的敏感链探针进行的平行分析始终为阴性（图。3e和f)，证明通过该试验可特异检测到单链SIV RNA。为了确定哪些细胞类型支持SIV在研究组织中的复制，我们对CD3（T淋巴细胞）和CD20（B淋巴细胞）或巨噬细胞标记物HAM56和CD20的组织切片进行了共染色。以前曾描述过另一株SIV在巨噬细胞和B细胞中的病毒复制(27)和HIV-1(28)，但其他研究小组发现仅在CD45RO中复制HIV-1感染⁺记忆T细胞(35). 原位杂交和免疫荧光同时分析细胞表面标记显示CD3⁺在我们的样本中，T淋巴细胞代表了大多数SIV感染细胞（图。​（图4）。4). 含有可检测SIV RNA的巨噬细胞很少见，但偶尔会出现（图。​（图4），4)尤其是在与生发中心的交界处。与滤泡树突状细胞（FDC）特异性抗体结合显示，淋巴结生发中心的FDC网络完好无损（数据未显示）。然而，尽管用蛋白酶K进行了简化，但FDC网络中捕获的病毒并不包含足够的SIV RNA，我们的原位杂交探针无法检测到SIV RNA（数据未显示）(35).

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图3。

原位杂交检测SIV复制。地高辛标记的SIV探针环境价值,堵住、和nef（奈夫）将mRNA与SIV感染动物（a至c）的16μm淋巴结切片杂交。所有三种反义探针的混合物用于绘制SIV活性复制位点（d）。通过无反义探针与未感染对照组组织结合（e）和无感测探针与SIV感染组织结合（f）来验证检测特异性。

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图4。

SIV表型⁺猕猴淋巴结中的细胞。SIV公司⁺通过原位杂交在淋巴结切片中识别细胞，并通过亮场显微镜成像（a和b中显示了两个独立的区域）。通过荧光显微镜平行成像每个区域，以检测T细胞标记CD3（a）、巨噬细胞标记HAM56（b）、b细胞标记CD20（a和b）和核染色Hoechst 33342。为了创建合并图像，将每个亮场图像（a和b）倒置，以便SIV⁺细胞呈白色，并覆盖有荧光图像，以显示SIV的共定位⁺mRNA和细胞表面抗原。

儿茶酚胺能神经纤维与SIV复制的空间关系。

为了评估ANS神经纤维与SIV活跃复制部位之间的关系，我们比较了实质性儿茶酚胺能静脉曲张附近淋巴结组织中SIV复制的频率与远离静脉曲张部位的复制频率。为了便于定量分析，每个淋巴结切片被分为250μm²空间样方（图。​（图5a），5a级)，并将含有一种或多种实质儿茶酚胺能静脉曲张（即与血管无关的ANS神经纤维）的象限中SIV复制位点的数量与不含有实质静脉曲张的象限中SIV复制位点的数量进行比较。在所有分析的标本中，在不含静脉曲张的组织样方中平均观察到0.179个SIV复制位点，在含有一个或多个薄壁静脉曲张组织样方上平均观察到0.275个复制位点(P（P）=0.0042乘以t吨测试）。当组织样方被归类为显示一个或多个SIV复制位点与无复制位点时，也出现了类似的结果，在含有儿茶酚胺能静脉曲张的样方中，SIV活跃复制的几率增加了3.9倍（χ²[1] = 53.39;P（P）<0.0001）（图。​（图5c）。5厘米). 图​图5d5天显示了SIV复制位点在典型髓样体中的分布，显示了一个或多个实质性静脉曲张与无实质性静脉曲张的对比。对每个样方中儿茶酚胺能静脉曲张的绝对数量和SIV复制位点的分析也显示出正的线性相关性，随着每增加一个静脉曲张，SIV复制部位的数量平均增加0.015个（通过线性回归分析；P（P） < 0.0001). 因此，一些替代性分析结果表明，SIV在次级淋巴组织内的实质性儿茶酚胺能静脉曲张附近的复制频率增加。

研究的动物之一（表​（表1，1动物9）淋巴结活检时，血浆中病毒载量高，CD4计数低，10天后被安乐死。为了确保该动物的数据不会对中期感染期间观察到的其他动物的结果产生偏见，在排除动物9后重复进行空间关联分析。出现了类似的结果，在含有一个或多个实质性静脉曲张的组织样方中，SIV活跃复制的几率显著高于无实质性静脉曲张的组织样方（比值比=2.60；χ²[1] = 15.65;P（P）< 0.0001). 排除三个显示轻微皮质扩张的淋巴结标本后，也出现了类似的结果（比值比=4.31；χ²[1] = 64.99;P（P）< 0.0001). 因此，个体变异对疾病进展和淋巴结结构的影响并不能解释实质性静脉曲张与SIV复制之间观察到的关系。

SIV-ANS跨解剖分区的相互作用。

SIV复制和儿茶酚胺能静脉曲张的密度在淋巴结的解剖亚区之间存在显著差异（图。​（图6）。6). 所有SIV⁺所调查的样本中，11.4%的皮质样方、20.7%的副皮质样方和12.9%的髓质样方检测到病毒基因表达（图。​（图6）6)（地区差异，χ²[2] =40.99和P（P）< 0.0001). 儿茶酚胺能静脉曲张的密度在各分区之间表现出平行变化，在4.1%的皮质样方、12.3%的皮质旁样方和11.2%的髓质样方中观察到一个或多个薄壁静脉曲张（图。​（图6）6)（地区差异，χ²[2] =94.01和P（P）< 0.0001). 为了确保儿茶酚胺能性静脉曲张和SIV复制位点之间的组织范围关联不仅仅源于它们在不同解剖亚区内的共分离，我们分别在每个亚区内重复了空间关联分析。在含有一种或多种静脉曲张的皮质象限中，SIV复制的几率高出4.04倍（χ²[1] = 27.33;P（P）<0.0001）和5.46倍（χ²[1] = 9.89;P（P）< 0.0017). 在含有一个或多个儿茶酚胺能静脉曲张的皮质旁样方中，SIV复制的几率是不含儿茶酚酚胺能神经曲张的样方的1.32倍，但这种差异没有达到统计学意义。控制解剖亚区差异的空间关联分析继续发现，在含有一种或多种儿茶酚胺能静脉曲张的组织单位中，活跃SIV复制的几率比不含有儿茶酚胺能静脉曲张的组织单位高3.1倍（χ²[1] = 29.83;P（P）< 0.0001). 因此，儿茶酚胺能性静脉曲张附近SIV复制升高并不是淋巴结不同解剖分区内两个变量共分离的伪影，甚至在单个分区内也观察到显著的空间关联。

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图6。

SIV复制和ANS神经支配在解剖亚室的分布。神经支配密度和SIV复制密度被量化为皮质、副皮质或髓质组织样方的百分比，这些样方分别显示实质组织中的一个或多个SIV复制病灶或一个或更多儿茶酚胺能静脉曲张（即不包括血管相关神经纤维）。误差线等于平均值的标准误差。

我们感谢Suzanne Stevens和Srinivasan Thyaga Rajan在SPG荧光技术方面的帮助；Harry Vinters和加州大学洛杉矶分校艾滋病研究所获得BSL2⁺低温恒温器；Christine Brennan、Erna Tarara、Greg Vicino、Carmel Stanko、Laura Del Rosso、Kristen Cooman以及中国人民共和国兽医、动物护理和研究服务部的工作人员，负责开展猕猴研究；Christina Nguyen协助数据分析；杰罗姆·扎克（Jerome Zack）和海伦·布朗（Helen Brown）批判性地阅读了手稿。

这项研究得到了美国国家心理健康研究所（MH049033）、美国国家过敏和传染病研究所、神经疾病和中风研究所（AI/NS052737）、加州大学艾滋病研究计划（CC99-LA-02）、加州洛杉矶大学诺曼表亲中心和James B。彭德尔顿慈善信托。