神经科学杂志。2005年5月11日；25(19): 4766–4778.
在体内苍蝇神经活动基因编码指标的表现
1Max-Planck-Institute of Neurobiology，82152 Martinsried，Germany，系统与计算神经科学系，2加利福尼亚大学伯克利分校分子和细胞生物学，伯克利，加利福尼亚94720三日本柴达木RIKEN脑科学研究所记忆与学习实验室351-198
2004年12月1日收到；2005年3月24日修订；2005年4月4日接受。
版权©2005年神经科学学会0270-6474/05/254766-13.00/0 摘要
神经活动的基因编码荧光探针为系统神经科学提供了新的有希望的工具。这里，我们提供一个比较体内对10种不同基因编码的钙指示剂以及对pH敏感的突触-pHfluorin进行分析果蝇属幼虫神经肌肉接头。当表达Flash-Pericam、Camgaroo-1和Camgaroo-2时，强大的神经活动不会导致任何或显著的荧光变化。然而，根据原始数据计算，突触素-pHfluorin、黄骆驼2.0、2.3和3.3、逆-Pericam、GCaMP1.3、GCaMP 1.6和基于肌钙蛋白C的钙传感器TN-L15的分数荧光变化高达18%。所有这些指标的响应特征彼此相差很大，GCaMP1.6报告神经活动率高，荧光变化最大且最快。然而，GCaMP1.6遭受光漂白，而双生色团指示剂的荧光信号通常较小，但更具光稳定性和可再现性，TN-L15在较低的活性率下信号增长最快。我们表明，对于GCaMP1.3和YC3.3，扩大的神经活动范围引发了相当线性的荧光变化，并相应地线性增加了信噪比（SNR）。该指标的表达水平偏向信号动力学和信噪比，而信号幅度是独立的。所提供的数据将有助于体内有关选择适当指示器以及正确解释光学信号的实验。
关键词：遗传指标、GFP、神经活性、转基因动物、光学成像、钙
材料和方法
苍蝇与遗传学我们使用了Gal4/UAS系统(布兰德和佩里蒙，1993年)将指标的表达指向感兴趣的单元格。实验动物是通过杂交10只处女伊拉夫产生的155元-Gal4苍蝇（加利福尼亚大学伯克利分校C.S.Goodman慷慨赠予加州伯克利分校）给五只UAS-indicator雄性苍蝇。所有动物均在25°C下，在添加新鲜酵母的标准玉米培养基上饲养。
将九种不同结构的cDNA亚克隆到pUAST载体中(布兰德和佩里蒙，1993年)并插入果蝇属P元件介导的生殖系转染基因组(Spradling和Rubin，1982年). 此外，从其他实验室（见下文）获得了三条飞行线路，UAS-SpH、UAS-YC2.0和一条附加线路UAS-GCaMP1.3，并纳入了我们的分析。将以下指示cDNA插入pUAST载体(布兰德和佩里蒙，1993年). 黄骆驼（YC）变种YC2.3、YC3.3和Camgaroo-2（Camg2）的cDNA(Griesbeck等人，2001年)，以及原卟啉-L15（TN-L15）(海姆和格里斯贝克，2004年)已插入不是I pUAST站点；cDNA由Oliver Griesbeck（德国马丁斯里德神经生物学研究所Max-Planck-Institute（MPI））善意提供。GCaMP-1.3标准(Nakai等人，2001年)使用5′克隆Bgl公司II/3′不是I.使用含有额外5′的引物，通过PCR扩增GCaMP-1.6（Yunishi Nakai，未发表的观察结果）不是I和3′Xba公司I站点。这两份GCaMP-cDNA都是中井俊彦（日本崎岖市和谷市RIKEN脑科学研究所）慷慨赠送的礼物。Camgaroo-1（Camg1）(Baird等人，1999年)由Roger Y.Tsien（加利福尼亚大学圣地亚哥分校，La Jolla，CA）善意提供，并插入为不是我的碎片。闪光脉冲（FP）和反脉冲（IP）(Nagai等人，2001年)这些是宫崎骏（日本崎岖市和谷市RIKEN脑科学研究所）的慷慨礼物。这两个cDNA都是使用带有附加引物的引物通过PCR扩增的Xho公司I站点。在P-元件介导的生殖系转染白细胞之前，所有UAS-指示剂结构均通过限制性分析和测序进行验证-苍蝇（w-，“拜罗伊特”；由德国拜鲁伊大学克里斯蒂安·莱纳（Christian Lehner）提供。
对于每个指标，向200-1000个胚胎注射cDNA。成功的转化者通过眼睛的颜色进行识别，每个GECI饲养多达50只独立的苍蝇。通过将所有新的UAS-GECI系与Gal4苍蝇杂交来确定Gal4驱动的指示物表达的有效性（elav155元-Gal4）(林和古德曼，1994)以及随后的抗体染色。为了进行成像实验，选择了能够产生足够强表现力的飞线。在某些情况下，精确的P元素插入位置被分子映射。UAS-YC2.0-2/6i苍蝇(Reiff等人，2002年)包含原始“Yellow Cameleon”2.0 cDNA(Miyawaki等人，1997年)由Christoph Schuster（德国海德堡海德堡大学）提供。UAS-SpH飞行(Miesenboeck等人，1998年)和额外的UAS-GCaMP-1.3线路分别由Gero Miesenboeck（耶鲁大学医学院，康涅狄格州纽黑文）和Yalin Wang（纽约州冷泉港冷泉港实验室）慷慨捐赠。
对所有六个显示阴性成像结果的UAS指示蝇系进行分析，以确定是否将正确的指示序列插入到了蝇基因组中。针对Flash-Pericam、Camgaroo-1和Camgaroo-2分别分析了两条独立的飞行线路。从苍蝇中提取基因组DNA，并使用标准方案进行纯化（德涅阿斯；德国希尔登齐亚根）。然后，使用位于pUAST多克隆位点左右的正向（CAATCTGCAGTAAAGTGCAAG）和反向（CTCTGTAGGTTGTCCAA）引物通过PCR扩增指示cDNA，包括～150 bp的侧翼pUAST序列。PCR产物大小合适，使用同一组引物和另一组位于cDNA内的引物进行纯化和测序，并分别向cDNA的5′和3′区域延伸。获得的起始和终止区域约700 bp的序列与已发布的指示序列对齐，覆盖了整个指示cDNA的约90%，并且与已发布指示序列相同。
抗体染色大约1000份F1在标准化条件下，对雌性晚三星级幼虫进行标记、染色和分析。在HL3中解剖了晚期第三恒星幼虫(Stewart等人，1994年)并在冰镇4%多聚甲醛中固定5分钟，标记20-24片鱼片，收集在含有0.1%Triton X-100的PBS中的公共管中。在5%的正常山羊血清处理（S-2007；西格玛，圣路易斯，密苏里州）45分钟后，用抗绿色荧光蛋白（GFP）-IgG结合Alexa Fluor 488（A-21311；分子探针，尤金，OR）以1:1000的稀释度对菲力鱼染色2小时。将洗净的菲力片在70%的甘油/PBS 30%中进行平衡，并安装在荧光显微镜下。
生理学和光学成像按照Macleod等人的描述进行幼虫解剖(2002). 所有实验均在HL6中进行(麦克劳德等人，2002年)含7 m米谷氨酸盐和1.5米米钙，除非另有说明。谷氨酸能有效阻止浓度≥5 m的突触后肌肉收缩米不影响突触前钙动力学(麦克劳德等人，2004年). 简言之，将晚三英寸幼虫固定在自制记录室的底部，沿着背部中线打开，然后取出气管、肠道和脂肪体。切断所有节段神经，切除腹侧脑，在腹段2或3肌肉6/7处记录幼虫NMJ。通过将节段神经的切割端放置在抽吸电极中来进行刺激。应用超阈值电流脉冲（Iso-Stim 01-D；NPI Electronics，Tamm，Germany）定时锁定CCD图像采集（Cool Snap相机和MetaView软件；Visitron Systems，Puchheim，German）和荧光激发（Polychrome IV；T.I.L.L.Photonics，Martinsried，Germary）。应用的刺激范式（80、40、20、10、5和0 Hz）的时间顺序随机改变。实验由Delphi（加利福尼亚州斯科茨瓦利Borland）编写的定制软件控制，使用模数转换器（DAS-1602/12；马萨诸塞州Middleboro Computerboards）。使用带有机动焦点驱动装置（德国拉廷根Luigs&Neumann）和60×浸水物镜（LumPlanFL；日本东京奥林巴斯光学公司）的固定台显微镜（Axioskop；Zeiss，Oberkochen，德国）进行宽场荧光检测。在所有实验中，以10 Hz和3×3 CCD binning的速率采集图像，得到每超像素约290 nm的图像平面，也反映了光学元件的近似光学分辨率极限。YC变异体和TN-L15通过使用455双色长通（DCLP）在430 nm处激发并使用多光谱查看器（Optical Insights，Tucson，AZ）和额外的515 DCLP分离发射来成像。使用Q480LP和HQ535/50带通在470 nm激发，对SpH、GCaMP-1.3、GCaMP-1.6、Camg1和Camg2进行成像。IP在485 nm处激发，并使用490 DCLP和HQ535/50带通分离发射。所有二向色性和滤光片均来自Chroma Technology（马萨诸塞州Rockingham）。
使用IDL版本6（RSI，Boulder，CO）中编程的定制软件分析数据。荧光的相对变化（ΔF类/F类)通过减去控制图像计算(F类中国核试验研究所)从每个图像F类t吨然后将差分图像除以F类中国核试验研究所控制图像是在刺激开始前对图像进行平均得到的。对于背景减法，选择单个波顿周围的均匀区域。在计算Δ之前，从浮标的原始强度中减去其强度F类/F类如上所述。通过在拟合前删除刺激期来进行双指数漂白校正。生成的函数与剩余的荧光痕迹完全匹配，随后从原始荧光痕迹中减去（补充图2B类，网址为网址：www.jneurosci.org作为补充材料).
对于双生色团指示剂（见结果），根据增强黄色荧光蛋白（EYFP）和增强青色荧光蛋白（ECFP）荧光图像计算比率图像序列。按照上述方法处理以这种方式获得的电影，以产生荧光比（ΔR（右）/R（右）). 通过分别从两个通道中的原始波顿强度中减去一个背景区域来进行背景减除。然后，ΔR（右）/R（右）计算方法如上所述。
使用W.Denk（MPI for Medical Research，Heidelberg，Germany）设计的定制双光子显微镜拍摄双光子图像。使用二极管泵浦固体激光器（Millennia；Spectra-Physics）泵浦的锁模飞秒泰坦-宝石激光器（Tsunami；Spectra-Physics，Mountain View，CA）在860 nm处激发YC3.3。为了创建图像堆栈，在Δz（z）=1微米。采用CfNT软件（MPI for Medical Research）对实验进行控制。
结果
分析GECI和转基因果蝇
我们在这项研究中的主要目标是描述和比较神经活动的不同遗传指标体内.SpH和10种不同的GECI()代表了几乎所有目前已知的遗传钙指示剂设计(Tsien和Miyawaki，1998年;格雷罗和伊萨科夫，2001年;Zhang等人，2002年; 宫崎骏，2003年a,b条;鲁道夫等人，2003年;Griesbeck，2004年)在苍蝇的神经系统中表达（见材料和方法）。分析的GECI基于单个生色团(供应链)，它们的圆形排列变体(cpsc公司)或双生色团(直流电).供应链和中央处理器指示剂依赖于GFP构象的钙依赖性重排，而dc指示剂则基于荧光共振能量转移（FRET）功效中钙依赖性的变化(Habuchi等人，2002年;Jares-Erijman和Jovin，2003年)在两种光谱GFP变体之间。在所有指标中，钙依赖性构象变化是由钙结合蛋白引起的，如钙调素（CaM）或肌钙蛋白（Tpn）。在直流电指示物，该钙结合区域连接荧光团供应链指示器，它被拼接到荧光灯（Camgs）中cpsc公司指示物，野生型GFP（GCaMPs）或YFP（果皮）的循环置换变体融合到发色团N端的M13和C端的CaM。具体来说，苍蝇配备了以下设备cpsc公司探针：GCaMP-1.3(Nakai等人，2001年)新GCaMP1.6（Nakai，未发表的观察结果）、FP和IP(Nagai等人，2001年). 作为供应链探测器，我们选择了Camg1(Baird等人，1999年)和摄像头2(Griesbeck等人，2001年). 因此，我们插入了低亲和力供应链缺少CaM结合肽M13和高亲和力的探针（Camg1和Camg2）cpsc公司含有M13和各种GFP或YFP变体（用于K（K）d日，请参阅). 这些GECI代表了基于单个发色团的所有已知钙探针（比例果皮除外）(). 除了IP可以降低钙结合过程中发射的荧光外，所有其他供应链和cpsc公司指示剂的荧光随着钙的增加而增加。全部直流电我们测试的GECI依赖于ECFP和EYFP或柠檬酸之间的FRET。其中，我们选择了改良的骆驼变种YC2.3和YC3.3(Griesbeck等人，2001年). 这些指标与UAS-YC2.0-flies（原始骆驼）进行了比较(Miyawaki等人，1997年)来自以前的研究(Reiff等人，2002年)和携带“Troponeon”TN-L15的苍蝇(海姆和格里斯贝克，2004年). UAS-TN-L15苍蝇是第一批具有钙指示剂的转基因动物，其钙结合部分来源于鸡Tpn C，而非所有其他GECI中的CaM（详细信息见).
表1。
探查
|
设计
|
钙传感器
|
工作原理
|
体外第页灵魂一
|
体外Kd日(μ米)
|
体外变化（%）
|
40和80 Hz时的变化（%）
|
40和80 Hz时的τ上升（秒）e（电子）
|
40和80 Hz时的τ衰减（秒）e（电子）
|
静止时的能见度c（c）
|
|---|
| YC2.0系列 | ECFP/EYFP公司 | CaM公司 | FRET公司 | 6.9 | 0.1 | 100 | 7.8 |
1.52
|
0.58/2.52
| 高 |
| （不锈钢） | | | | 11 | | 11.6 | (0.53) | (0.47/3.39) | |
| YC2.3类 | ECFP/柠檬酸 | CaM公司 | FRET公司 | 5.7 | 0.1 | 100 | 5.5 |
0.72
|
0.53/3.48
| 高 |
| | | | | 4.3 | | 9.4 | (0.35) | (0.53/2.37) | |
| YC3.3标准 | ECFP/柠檬酸 | CaM公司 | FRET公司 | 5.7 | 1.5 | 100 | 5.9 |
1.07
|
0.62/3.02
| 高 |
| | | | | | | 9.6 | (0.42) | (0.51/2.84) | |
| TN-L15型 | ECFP/柠檬酸 |
Tpn C公司d日
| FRET公司 | 5.7 | 1.2 | 140 | 6.9 |
0.49
|
1.29
| 高 |
| | | | | | | 8.2 | (0.31) | (1.29) | |
| 摄像头1 | 拆分EYFP | CaM公司 | 钙诱导的 | ∼7 | 7 | 700 | (—) | | | 非常低 |
| （SVQST） | | 第页灵魂改变 | | | | | | | |
| 摄像头2 | 分离柠檬酸 | CaM公司 | 钙诱导的 | ∼7 | 5.3 | 700 | (—) | | | 中等 |
| | | 第页灵魂改变 | | | | | | | |
| FP公司 | cpEYFP公司 | CaM公司 | 钙诱导的 | ∼7 | 0.7 | 800 | | | | 无 |
| | | 第页灵魂改变 | | | | | | | |
| IP（IP） | cpEYFP公司 | CaM公司 | 钙诱导的 | ∼7 | 0.2 | 向下 | −6.7b条
|
0.61
|
0.90
| 高 |
| | | 第页灵魂改变 | | | 至15 | −8.9b条
| (0.28) | (0.98) | |
| GCaMP 1.3 | cpEGFP公司 | CaM公司 | 钙诱导的 | ∼7 | 0.235 | 450 | 8.2 |
0.84
|
0.46
| 中等 |
| | | 第页灵魂改变 | | | | 16.1 |
0.31
|
0.48
| |
| GCaMP 1.6 | cpEGFP公司 | CaM公司 | 钙诱导的 | ∼8.5 | 0.146 | 480 | 6.2 |
0.56
|
0.34
| 高 |
| | | 第页灵魂改变 | | | | 17.8 |
0.16
|
0.35
| |
| 转速（SpH） | EGFP公司 | | 第页灵魂
| ∼6 | | 600 | 9.1 |
4.33
|
（f）
| 中等 |
|
|
|
|
|
|
| 16.5
|
2.49
|
（f）
|
|
通过将所有新的UAS-GECI系与Gal4苍蝇杂交（elav155元-Gal4，以下称为“Gal4-driver”），驱动整个神经系统的表达(林和古德曼，1994). 在F中分析GECI荧光的特异性1雌性动物的双光子激光扫描显微镜(Denk等人，1990年).显示了YC3.3表达动物的幼虫半段的切片。GECI荧光仅在幼虫的神经系统中检测到。因为在一些供应链和cpsc公司探针（见上文和)，我们新的UAS-GECI系的表达水平的评估是通过用抗GFP的荧光抗体（Alexa Fluor 488；有关详细信息，请参阅材料和方法）进行筛选来进行的(). 我们发现Gal4-driven指示剂表达的功效在不同品系之间差异很大()可能取决于P元素的染色体位置(斯普拉德林和鲁宾，1983年). 大多数包含基于cpsc公司荧光团没有引起显著的表达。然而，这种方法使我们能够识别合适的UAS-GECI系，并生成每个指标具有足够高且不同表达水平的实验动物。总的来说，GECI表达水平可以通过多种方式进行控制：使用具有单一GECI拷贝但表达效率不同的株系()，使用带有多个GECI副本的行（见图。,，GCaMP1.3），或使实验苍蝇杂合或纯合GECI和/或Gal4源(). 稍后，我们将展示表达水平如何与测量的荧光变化相关（参见).
新生成的UAS-GECI飞行线路的特异性和表达水平。A类，显示了一个YC3.3表达的幼虫。双光子成像显示了elav的特异性155元-Gal4-driven UAS-GECI在幼虫神经系统中的表达。表达专门针对轴突和NMJ。B-D公司，NMJ幼虫的抗-GFP染色（见材料和方法）显示，不同的蝇系（UAS-GCaMP1.6-29c、-48b和-30iB类,C类，以及D类分别交叉至elav155元-镀锌4）。该协议允许我们定期评估新的UAS-GECI管线供应链休息时荧光被破坏的指示器。E类相同成年苍蝇的入射光（顶部）和荧光显微镜图像（底部）：实验动物中GECI表达水平也可以通过增加编码Gal4和/或UAS指示剂cDNA的拷贝数进行“调整”。最左边的动物是Gal4和UAS-YC3.3的纯合动物，最右边的动物是两者的杂合动物，中间的动物是纯合/杂合混合物。比例尺，20μm。
10种不同GECI和SpH突触前荧光变化的比较。如前所述对突触前神经束进行成像和分析（参见材料和方法）。通过电刺激（80、40和0 Hzt吨=1至3.2 s）。显示的平均ΔF类/F类和ΔR（右）/R（右）属于供应链和直流电根据未修改的原始数据分别计算指标，并绘制出与时间的关系图。括号中显示了分析动物、NMJ和Bouton的数量。表达GCaMP1.3的NMJ(A类)，GCaMP1.6(B类)，IP(C类)，转速(D类)，YC2.3型(E类)、YC3.3(F类)、YC2.0(G公司)和TN-L15(H（H）)显示出可靠的荧光变化。在40Hz（数据未显示）和80Hz刺激下，分别没有或只有非常小的信号从表达(我)和表达Camg2(J型)波顿。将细胞外钙浓度增加至10 m米(J型，浅灰色痕迹）导致荧光信号退化，我们无法解释。FP-表达动物(n个>10）通过聚焦肌肉6/7之间的缝隙进行成像，因为休息时无法检测到FP荧光。刺激不会导致荧光明显增加。在成像实验后，我们通过GFP抗体染色验证了FP在这些NMJ中的表达(K（K）). 对UAS-Camg1-、UAS-Camg-2-和UAS-FP诱导型苍蝇进行了适当的指示剂插入测试（见材料和方法）。结果和中给出了荧光变化的详细描述.
荧光信号的线性和信噪比。表达GCaMP1.3的NMJ(A-F公司)或YC3.3(G-L公司)以五种不同频率（5、10、20、40和80 Hz）刺激。单个激波的信号以灰色绘制，相应的平均响应以白色显示。在每个刺激频率下分析了大约50个波顿。对两种指示剂的信号进行背景荧光校正，并对GCaMP1.3信号进行漂白校正（参见材料和方法）（补充图2，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料). 在F类和L（左），显示了不同刺激频率的平均荧光分数变化。在插图中，给出了单个刺激的峰值振幅（黑色方框和线条）和SNR（灰色星号和线条）。为了计算信噪比，每个波顿取平均响应峰值周围的五个时间点，除以所选时间点的数量。这些振幅的平均值除以平均值的SD（SNR是平均振幅/SD）。
荧光变化的动力学和SNR取决于GECI表达水平。分析了两个不同的UAS-YC2.3品系，它们产生了不同数量的Gal4-驱动指示剂表达。40 Hz的刺激诱发相同的平均ΔR（右）/R（右）弱表达动物的振幅（白色痕迹）(A类)和强烈表达动物(B类). 在A类，第5b行显示（6只动物，71只布顿）B类，第30l行显示（7只动物，94只布顿）。单个浮石以灰色绘制。用于计算ΔR（右）/R（右），在单个通道中减去背景荧光（见材料和方法）。C类在弱表达线（5b，τ=594±58 ms；30l，τ=909±48 ms；单指数拟合）中观察到相同的振幅，但更快的动力学，尤其是荧光信号的上升。在减去背景之前，对于衰减的时间常数也发现了类似的结果。然而，减去背景后，这一点就不那么明显了。D类，指标表达水平的量化（通过背景扣除后的柠檬酸强度判断），平均ΔR（右）/R（右）、和SNR（有关SNR计算，请参见)两条线中的一条。*第页< 10-5（未成对t吨测试）。结果中给出了详细信息。a.u.，任意单位。
突触前神经束的遗传指标分析
产生明显可检测表达的UAS-GECI股票被交叉至泛神经元Gal4驱动因子。在宽场荧光显微镜水平上，结合CCD成像（参见材料和方法），单个NMJ()肌肉6/7处易于识别。因此，Gal4驱动因子的特异性使我们能够光学分离感兴趣的结构，如神经、轴突和突触前终末，并表征单个波顿水平上不同指标中显示的荧光变化体内(，YC3.3）。高达80赫兹的电刺激模拟了这种突触的自然活动(Barclay等人，2002年). 根据记录的原始图像序列，我们计算了分数荧光变化（ΔF类/F类)FRET的分数变化（ΔR（右）/R（右）). 在，显示假彩色图像，显示Δ变化R（右）/R（右）在图中所示的交界处观察到（补充电影1，网址：网址：www.jneurosci.org作为补充材料). 从原始图像中选择单个发作，并计算其荧光变化(). 这是为了一部NMJ的每部电影花费5-20博顿。在刺激期内，直流电指标总是在CFP通道中显示负荧光变化，而在YFP或柠檬酸通道中显示正荧光变化(，底图），表明观察到的荧光变化不是由于运动、漂白或其他伪影造成的。所分析的香肠的主要数量位于NMJ的中部，并显示出相当均匀的荧光变化(，底部和顶部图形，叠加的黑色痕迹），这与之前的研究一致(Reiff等人，2002年). 我们发现当ΔR（右）/R（右）(，顶图）与仅～5%Δ进行比较F类/F类在各个通道中(，底图），同时，漂白在ΔR（右）/R（右）电影（补充图1，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料). 背景没有荧光变化（来自由中的粉红色痕迹表示)如果没有包括离焦突触前结构。
转基因NMJ幼虫亚细胞水平的指标表现分析果蝇属.A类，肌肉6/7处NMJ的原始图像显示，可以通过休息时的指示荧光直观地识别隆起。B类，将包含相关轴突的节段神经置于刺激电极中。C类bouton的特写镜头（以A类)表明可以可靠地识别单个波顿，用于离线分析荧光变化。D类，空间低通滤波假彩色图像编码ΔR（右）/R（右）（无背景减法D类和E类)在实验过程中（80 Hz刺激2.2 s；见E类). 数字（以秒为单位）表示计算图像的时间点。E类，在同一实验中对～20个突触前神经束的荧光变化进行了离线分析。薄的黑色痕迹表示来自单个波顿的信号，平均ΔF类/F类CFP和YFP的计算值分别以青色和黄色绘制。平均ΔR（右）/R（右）以红色显示。来自背景区域的信号（粉红色区域A类)用粉色痕迹表示。背景（即肌肉细胞）没有显示荧光变化。
体内10种GECI与SpH在突触前勃起中的比较
突触前阵痛果蝇属和小龙虾NMJs，荧光信号先前被显示为快速达到稳态，其振幅线性地取决于刺激频率(Tank等人，1995年;麦克劳德等人，2002年)，与单室模型中计算的潜在稳态钙相匹配(Tank等人，1995年). 如果假设钙与GECI结合呈线性，则荧光强度应随刺激频率线性增加。此外，对于40和80 Hz的刺激，荧光信号上升的时间常数应相同[但参见GCaMP1.3(Nakai等人，2001年)]. 这一概念的偏差表明指示剂饱和和/或非线性钙结合。此外，其他固有特性，如漂白和对内源性钙缓冲液的干扰（即指示剂的表达水平）可能会影响显示的荧光信号。在，我们提供了一个包含11项活动指标的概要体内。这些指标几乎涵盖了GECI工程和钙亲和力的完整历史，包括K（K）d日约0.1至约10μ米分析时在体外(). 下图给出了其中一个选项的详细信息。所示GECI用于记录与残余突触前钙变化相关的荧光变化。直接控制触发的囊泡释放的快速纳米域钙无法直接测量。突触前小泡释放本身通过在我们的研究中包括UAS-SpH苍蝇进行分析（超黄道SpH）(Miesenboeck等人，1998年;Ng等人，2002年). 基于膀胱内和细胞外间隙之间的pH差异，SpH可以直接测量突触前囊泡融合，这是分析神经活动的关键参数。使用所述的准备和方案，以40 Hz的频率刺激(，灰色轨迹）或80 Hz(，黑色痕迹）在SpH中产生强烈的荧光变化()以及10个不同GECI中的7个。有反应的GECI为GCaMP1.3、GCaMP1.6、IP、YC2.3、YC3.3、YC2.0和TN-L15(). 在，平均值±SEMΔF类/F类或ΔR（右）/R（右）计算了大量数据样本（括号中显示的数字）sc、cpsc，以及直流电分别绘制了指标和时间。此外，控制影片(，浅灰色痕迹），在没有任何刺激的情况下在每个实验中进行，从每个分析的NMJ中测量出总共三种刺激条件。对照片可以粗略估计光漂白导致的测量荧光变化的破坏，尽管在发色团的荧光状态越强时，漂白可能越明显。这是由80 Hz刺激期间GCaMP1.3，特别是GCaMP1.6荧光的降低所表明的()（补充图2，网址：网址：www.jneurosci.org作为补充材料). 由于不同指示剂的荧光特性非常不均匀，所以在针对光漂白或背景荧光进行校正。我们宁可显示大多数原始和未修改的数据。图中给出了背景减影和漂白校正对信号振幅的影响示例和.总结了从中的数据获得的最大相对荧光变化或荧光比率变化、信号上升和衰减的时间常数以及指示器静止时的可见度.
在大多数情况下，必须使用UAS-GCaMP1.3的两个拷贝（在第二和第三染色体上）才能在静止状态下产生清晰可见的NMJ(). 一般条款aMP1.3()显示了一种双指数漂白，其快速成分在动作电位（AP）截击开始前明显终止（补充图2，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料). 观察80 Hz刺激期间荧光的相对变化，当荧光团变为高荧光时，信号显示出峰值响应，并没有明显稳定下来。在应用双指数漂白校正后，仍然可以观察到这一点()（补充图2，网址：网址：www.jneurosci.org作为补充材料). 这种缺失的稳态与报道的用合成染料测量的突触前钙的时间进程形成对比（Macleod等人。，2002,2004)在长时间的刺激期间。在40 Hz的刺激下，没有可见的瞬态峰值。在两种刺激模式下，刺激抵消后都可以看到轻度、长期的不足。这种下冲超过了对照电影中的漂白，并表明荧光团在更荧光的状态下的漂白增加。最大ΔF类/F类当刺激频率从40 Hz增加到80 Hz（从8%增加到16%）时，GCaMP1.3的含量增加了两倍。经过背景减除和漂白校正后，也获得了定性相似的结果（即，在扩大的刺激范围内，荧光线性增加）(). 相反，在相同的活动方案中，GCaMP1.6几乎增加了三倍（从6%增加到17%）。GCaMP1.6()休息时显示出更高的荧光()与GCaMP1.3相比，检测只需要一个cDNA拷贝。GCaMP1.6表现出较强的初始漂白，在刺激后（40和80 Hz）呈现出清晰的峰值，没有稳定状态，并且在刺激后表现出更明显的下冲。这一不足与钙结合指标的比例没有线性关系。在80 Hz的刺激下，下冲仅比40 Hz的刺激略为明显(). 这些现象在背景减影后也可以看到（数据未显示）。总之，与GCaMP1.3相比，GCaMP1.6在休息时更容易检测到，并且表现出更快的动力学()荧光信号，抵消了更明显的漂白的缺点。这两个指标的希尔系数都很高，预计其动态范围会很窄n个=3.3[GCaMP1.3(Nakai等人，2001年)]和n个=3.8[GCaMP1.6（Nakai，个人通信）]。此外，我们预计在年的实验中GCaMP会饱和因为钙的变化可以达到几百纳米到微摩尔范围果蝇属在这种情况下的拳击比赛(麦克劳德等人，2004年)、和K（K）d日235和146 n的值米已报告GCaMP1.3(Nakai等人，2001年)测量时，分别为GCaMP1.6在体外（Nakai，个人通信）。这种差异不能用几个补偿因素的相互作用来解释（如协同钙结合、探针饱和、背景缺失和漂白），因为观察到GCaMP1.3荧光与神经活动呈线性关系(). 这些结果表明K（K）d日Pologruto等人的工作进一步支持了这一观点(2004)谁报告了K（K）d日1.7μ米GCaMP1.3在病毒转染后海马切片中表达。荧光信号上升所需时间的缩短（GCaMP1.3和GCaMP1.6分别从840 ms降至310 ms和560 ms降至160 ms）表明了GCaMPs的饱和度()很可能完全由该指示剂的钙依赖动力学介导。在GCaMP1.3中，已知上升时间强烈依赖于钙，因此钙增加导致上升时间更快(Nakai等人，2001年).
在我们的研究中，唯一基于单个发色团的其他功能性钙指示剂是IP(). IP因其在静止时的高荧光和仍然合理的大荧光变化而成为单细胞表达实验的一种很有前途的工具。然而，它漂白得很快，并且高度非线性。我们发现衰减20%ΔF类/F类在照明开始后的第一秒钟内，照明在这些条件下严重破坏了信号检测。因为最初的时间进程非常匹配(，叠加痕迹），从刺激影片中减去控制影片可能是公平的（补充图2，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料). 然后，只有在IP中，才能更清楚地检测到突触前活动，并与诱发的神经元活动锁定时间。最大ΔF类/F类振幅仅略有增加（从6.7%增加到8.9%），而80 Hz刺激的初始上升速度更快，表明诱发的突触前钙增加足以部分饱和IP。报告中建议清除IP饱和体外Kd日200 n米(Nagai等人，2001年). 发现的中等饱和度与报告的较好一致K（K）d日脑切片中900nm(Pologruto等人，2004年). 与快速上升（τ=600 ms）相比，在40 Hz刺激下观察到荧光信号的衰减相当慢（τ=900 ms）().
相比之下cpsc公司指示器直流电指标YC2.3和YC3.3()显示出更稳定的荧光比率（ΔR（右）/R（右）)在刺激开始之前，在对照电影中只有-2%的信号改变。这表明，YC2.3和YC3.3信号仅通过漂白而适度降低（补充图1，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料). 同样在80 Hz刺激期间，信号增加到一个近似稳定的稳态水平，这在背景减影后也可见(). 在40 Hz时，刺激期结束时才达到平台，YC2.3和YC3.3信号的上升分别显示出700 ms和1 s的τ，明显慢于TN-L15(). 刺激后，信号衰减的时间进程相当缓慢，由双指数函数拟合(). 上升时间的减少和Δ的次线性增加R（右）/R（右）（YC2.3从5.5%到9.4%，YC3.3从5.9%到9.6%）表明开始饱和。这也可以在中看到其中五种不同的刺激和背景减法应用于YC3.3。
在我们的实验中，这些骆驼从未达到100%比率变化的最大值在体外，并从YC2.0中获得了可比较的结果。在YC2.0中，发现了上升时间和荧光振幅的类似变化()在40和80 Hz的刺激下（7.8%和11.6%ΔR（右）/R（右））。最初由Miyawaki等人出版(1997)，这种“原始的”骆驼在我们的实验中表现良好，就像它在以前的研究中一样(Reiff等人，2002年). YC2.0信号遵循其他YC变体的描述，只有细微差异。与骆驼相比，YC2.0荧光变化的动力学稍慢，最大信号变化更大(). 这两个结果都与YC2.0实验动物中的高cameeon表达水平相符（有关指示表达水平的影响，请参阅). 虽然YC2.0缺乏YC2.3和YC3.3受体的预期改善（更明亮的荧光和pH稳定性），但未观察到明显的缺陷(Miyawaki等人，1999年;Griesbeck等人，2001年). 事实上，正是静止时的荧光比率更为稳定(，浅灰色痕迹）。比例成像和静止时良好的可视性使这些指示器易于使用(;). 这些方面也适用于TN-L15。
以肌钙蛋白C为基础的报告基因TN-L15在所有GECI中表现出最少的漂白迹象(，浅灰色痕迹）。其荧光在刺激开始之前是稳定的，然后在刺激期间迅速上升，在80 Hz刺激下迅速达到几乎稳定的稳定状态。将刺激从40 Hz增加到80 Hz，最大Δ增加R（右）/R（右）仅为6.9%至8.2%，表明该指标接近饱和。在40 Hz的刺激下，TN-L15信号的上升阶段显示出所有指标中最快的时间常数（τ=490 ms），并且衰减的时间常数为τ=1.3 s。与骆驼相比，TN-L5衰减以单指数拟合良好。这一发现可能与钙与肌钙蛋白C的结合直接执行荧光团的重排有关，与骆驼相比，没有相互作用的M13连接子。
即使在长时间休息后，也可以识别出单个SpH表达的隆起物，而轴突却从未可见(). 因为pH<6时，对pH敏感的SpH是非荧光的(Miesenboeck等人，1998年)突触前细胞膜内必须存在一个小池，这很可能是由于突触前小泡自发融合果蝇属NMJ，频率为～1-3 Hz。使用SpH可以可靠地监测神经元活动()，显示出与所有GECI中钙依赖性荧光变化明显不同的动力学。SpH荧光增加到9.1和16.5%ΔF类/F类在40和80 Hz时，单指数时间过程分别显示τ=4.3 s和τ=2.5 s，在2.2 s刺激期内未达到平台。到实验结束时，SpH信号的恢复还不完全，这表明突触前膜的恢复缓慢。因此，就荧光信号的缓慢上升和衰减而言，SpH产生了所有指标中最慢的时间响应。考虑到SpH在囊泡释放和囊泡再循环的净平衡中传播变化，与GECI信号相比，可以预期荧光变化的时间进程较慢。
Camg1荧光几乎检测不到(). 在两只动物中，我们只能识别出一个荧光NMJ，共22个波顿。在40 Hz的刺激下，未观察到荧光变化（数据未显示）。只有在80 Hz的刺激下，建议在绘制的平均值水平上荧光增加最小()而信噪比（SNR）太低，无法进行检测。正如更高的基础荧光所预期的那样，在休息时更容易找到Camg2波顿(Griesbeck等人，2001年). 然而，它的性能并没有比Camg1更好(，黑色痕迹）。这是出乎意料的，因为据报道，两者的高荧光变化高达7倍供应链指标在体外(Baird等人，1999年;Griesbeck等人，2001年). 他们的低谷K（K）d日()不能完全解释这个结果，因为Camg2信号不能通过增加细胞外钙到10 m来增加米相反，我们发现信号严重退化，无法解释(，浅灰色痕迹）。
只有在抗体染色（抗GFP-Alexa 488；见材料和方法）后，才能在实验动物的NMJ处看到FP(). 在活体动物中根本没有检测到FP荧光()以及用于成像实验的菲力片制剂。在这些实验中，我们专注于肌肉6和7之间的缝隙，并像往常一样刺激神经。在所有情况下(n个>10），我们没有观察到荧光增加（数据未显示），尽管K（K）d日对于约700 n的钙米并且报道了非常大的荧光变化（高达八倍）在体外(Nagai等人，2001年) (). Hasan等人(2004)也报告了在HeLa细胞中表达FP的阴性结果。然而，我们的抗体染色显示FP在相同的突触上表达。
总之，GCaMP1.3()，所有基于FRET的GECI()SpH可以在单个试验中可靠地检测单个发声水平的突触前荧光变化（图。,，假彩色图像）（补充电影1-3，网址：网址：www.jneurosci.org作为补充材料). TN-L15在较低的活动速率下表现出最稳定和最快的上升信号，而GCaMP1.6在较高的神经活动速率下产生最快的信号。GCaMP1.6和GCaMP1.3信号因漂白而变得复杂，IP也是如此。Camg1和Camg2几乎没有反应，FP也没有在我们手中产生任何可检测到的荧光。对于三个“无功能”指标，我们不能绝对排除神经刺激的系统性失败。然而，这是极不可能的，因为在其他指示动物中从未观察到这种失败，并且在单个Camg和FP实验之间成功地成像了“功能性”指示物。
GECI的动态特性：连续三次AP截击后荧光变化。给定信号的检测关键取决于指示剂动力学。我们研究了如何从GCaMP1.3表达的荧光变化中很好地分辨顺序性神经元活动(A类)，YC3.3表示(B类)，或表达SpH-(C类)波顿。三次连续的AP截击（80 Hz/1 s；水平黑条）被诱发，间隔为休息时2 s和最后一次刺激后7 s。荧光变化绘制为平均ΔF类/F类(A类,C类)或平均ΔR（右）/R（右）(B类)（±SEM）针对以下数量的动物、NMJ和Bouton：A类、3、3和36；B类、4、4和61；和C类分别为3、3和44。图像以10赫兹的频率拍摄，持续15秒。在右侧，在数字所指示的时间点（以秒为单位）的实验期间，单个气泡以假彩色代码显示。与绘制的痕迹相比，在个别波顿中可以可靠地观察到定性相似的变化。这表明，在给定的刺激频率下，这些指标的信噪比很高。请注意，在该图中，为了显示数据，GCaMP1.3荧光已针对漂白进行了线性校正。
广泛神经活动的GECI信号
我们比较了GCaMP1.3中的分数荧光变化()和YC3.3()响应不同频率（5、10、20、40和80 Hz）的神经活动，并计算相应的信噪比。在每个基因型中，每刺激频率分析50±2个波顿。减去背景，并对GCaMP1.3信号进行额外漂白校正（参见材料和方法）（补充图2，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料). GCaMP1.3振幅在整个刺激范围内呈线性增加(，插入）（ΔF类/F类=0.7、2.7、12.7、39.8和82.3%），而YC3.3振幅仅在较低刺激范围内呈线性增加，在较高范围内呈次线性增加（ΔR（右）/R（右）=1.5、5.5、14.9、26.7和31.0%），表示探头饱和。由于YC3.3的反应在刺激期内没有完全达到稳定状态(，inset）可能会略微低估此探头的真实饱和特性。在模拟中（未显示数据），这种影响被证明与数据解释无关。对于这两个指标，SNR取决于动作电位频率，其方式与荧光振幅的增加一致(，插图），表明测量中的噪音基本恒定。因此，在80 Hz的高活性率下，GCaMP1.3显示出比YC3.3更高的信噪比（分别为6.3和3.8），在40 Hz时，这两个指标显示出相似的信噪比约（分别为3.3和3.3）。然而，在较低的活性范围内，YC3.3略为优越：在5、10和20 Hz时，我们计算出GCaMP1.3和YC3.3的SNR分别为0.2、0.9、2.6和0.5、1.4、3.1。
GECI信号的动力学和信噪比取决于表达水平
与钙变化相关的荧光变化取决于钙报告分子本身的浓度，荧光变化的动力学和振幅分别改变或可以改变(Yasuda等人，2004年). 为了研究这个问题，我们分析了两种UAS-YC2.3苍蝇，它们的GECI表达水平有四倍的差异()，通过量化静止时突触前神经束中的柠檬酸荧光强度来判断。为了精确量化表达水平，ΔR（右）/R（右）以及信号的信噪比，本地减去背景。然而，只能确定表达的相对水平。GECI在我们的实验动物中表达的实际浓度未知。对于刺激，我们选择了40 Hz的非饱和频率。显示的平均值（ΔR（右）/R（右）)由线5b的白色迹线表示()和30l线(). 两条线路的振幅相同。平均信号的叠加()更清楚地表明，弱表达线5b表现出更快的荧光信号，特别是对于信号的上升（5b的τ=594±58ms，30l的τ=909±48ms）。在，单个波顿的信号以灰色绘制，来自强表达线的信号的较高信噪比B类很明显。在，结果总结如下：柠檬酸强度，0.92±0.45和3.80±1.51任意单位，第页< 10-5; ΔR（右）/R（右）16.94±0.78和16.68±0.40%；YC2.3-5b的信噪比为2.58和4.30(n个=71/6）和YC2.3-30l(n个=95/7），分别为（±SEM，n个是boutons/动物）。
GECI的动态特性
我们研究了连续三次AP截击时基因编码活动指标的信号动力学(). 在这些实验中，没有减去背景信号，因为这不会改变信号的时间进程。这种更动态的刺激模式被用来引起三种明显不同的活性指标的荧光变化：GCaMP1.3、YC3.3和SpH。连续三次AP截击（80 Hz/1 s）间隔2秒，无刺激。表明GCaMP1.3荧光有足够的时间达到其最大水平或不足（τ衰减=480 ms）()并可靠地报告每次AP凌空抽射。Δ基本上没有减少F类/F类单个峰值的振幅。相反，YC3.3信号()显示了衰减信号上新诱发的荧光变化对先前刺激的响应的叠加。然而，与第一个最大值相比，第二个和第三个最大值并没有增加作为饱和度()探针发生了漂白。相反，对于SpH信号，发现荧光信号的明显叠加()这几乎导致了对连续三次刺激截击的阶梯式反应。由于这些指标在80 Hz刺激下具有足够的信噪比，因此也可以在单个声道水平上观察到不同的信号动力学。这是在一个波顿的假彩色图像中显示的(，右）在图像中的数字以及上的黑点指示的时间（以秒为单位）拍摄x-轴输入（补充电影2、3，网址：网址：www.jneurosci.org作为补充材料).
荧光变化的再现性
对于大多数神经元钙动力学的研究，在一系列实验中可靠地成像相同的解剖结构是很重要的。通过四次NMJ序列成像，研究了50Hz刺激诱发的荧光变化的再现性。在两次运行之间，允许每个NMJ恢复3分钟。表达YC2.3的动物()，TN-L15()，GCaMP1.3()，或IP()被选中。与我们之前的实验相反，我们使用了一个中性密度0.4的滤波器来减少激发能量，以便仅允许肉眼识别浮石。在这些条件下直流电GECI YC2.3()和TN-L15()表现出完全可重复的反应。在GCaMP1.3中()，荧光变化从8.1%Δ下降了～25%F类/F类首次运行至6.1%ΔF类/F类第四轮。GCaMP1.3在刺激开始前的时间过程中也发生了变化（从t吨=0至t吨=2秒；将第一次跑步与第二次、第三次和第四次跑步进行比较）。由于随机刺激呈现和随后的信号平均，这种影响在图中被掩盖了和.另一个圆形排列指示器IP()荧光信号的形状和时间进程始终表现出更大的变化。此外，单独运行期间的强烈信号退化以及缺乏可靠的荧光信号起始和衰减是该GECI应用于活体动物时的明显缺点。这些结果总结在其中，我们将每次运行的峰值振幅标准化为第一次运行。这个直流电指标波动～100%准确度，而两者中央处理器指标在首次运行时偏离了荧光变化。我们还量化了每次刺激开始前单个发声的原始荧光()并发现，对于各个指标而言，静态荧光从一次到另一次都相当稳定。因此，尽管GCaMP1.3和IP痕迹中可见漂白，但休息时的荧光在3分钟休息期内完全恢复。因为我们使用了宽场外荧光显微镜，所以在非焦点区域也会发生漂白。此外，几乎对整个NMJ进行了成像。因此，指示剂分子的扩散不太可能显著促进静止时观察到的荧光恢复。然而，我们不能完全排除这种选择。第一次运行后改变的时间进程和减少的分数变化表明，在连续的实验中，荧光特性发生了改变，而不是不可逆漂白。光转换和其他未知因素可能解释了时间进程的变化和有限的再现性cpsc公司指示信号[即GCaMP1.3分数荧光变化的减少()IP部分荧光损失增加()].直流电在这方面，指标明显优于其他指标。
荧光变化的再现性。在每个NMJ进行了四次连续成像实验（运行）。在每次运行中，以50 Hz的频率施加电刺激2.2 s（刺激间隔，从2到4.2 s）。在每次运行之间，允许制剂恢复3分钟。计算出的荧光变化与以下指标和动物数量、NMJ和boutons的时间关系曲线：A类YC2.3、2、2和15；B类、TN-L15、3、3和27；C类GCaMP1.3、3、3、50；和D类、IP、2、2和23。单个管路的完美叠加A类和B类证明了在直流电指标YC2.3和TN-L15。E类，中的数据A-D公司通过将每次运行到第一次运行的峰值振幅归一化来总结。对于峰值荧光的测量，取附近五帧的平均值。对于IP，该峰值从刺激开始时的信号中减去。F类，在刺激开始之前对原始荧光强度的量化，作为漂白的测量。将每次运行的原始荧光标准化为第一次运行。我们没有在任何GECI中观察到漂白现象。在所示的所有实验中，使用中性密度0.4滤波器将外荧光激发的功率衰减到仅允许我们在静止时识别单个NMJ的水平。
讨论
我们对11种神经活动的遗传指标进行了比较研究。确定了八种可靠的遗传指标，用于完整动物的神经活动成像。使用果蝇属NMJ幼虫突触前终末作为模型系统，我们进行了控制良好且重复性高的实验，以便直接比较不同的供应链、供应链，以及直流电钙指示剂和SpH。作为一项基本原则，不同指标的记录荧光信号存在显著差异。荧光变化与神经活动逐渐相关，但小于在纯化GECI上观察到的变化在体外，很可能是K（K）d日观察到了一些指标中的一些，以及与光漂白有关的更显著的问题。荧光信号的动力学和信噪比取决于指示剂的表达水平。新的传感器显示出显著的改进：GCaMP1.6在休息时显示出更强的荧光，并报告了高频率的神经活动以及最大和最快的荧光变化。与基于CaM的骆驼相比，TN-L15在神经活动速率较低的情况下，所有指标的上升速度最快，信号动力学也不太复杂。
无功能或不可靠的GECI体内
在我们的记录条件下，FP没有显示任何荧光体内。体外Hasan等人描述了类似的结果(2004)尽管Nagai等人(2001)报告的高动态信号在体外Camg1和Camg2没有或只有很小的荧光变化，然后信噪比很低。ΔF类/F类在tet控制下表达Camg2的转基因小鼠的神经元中，先前报道了4%(Hasan等人，2004年). Yu等人(2003)报告了更大的Camg1和Camg2荧光变化果蝇属蘑菇体在体外在我们的实验中，刺激后Camg2荧光往往会意外下降()Yu等人也看到了这种效果(2003). 另一个缺点是，表达Camg1的NMJ由于静止时的低荧光而不可见() (Baird等人，1999年;Griesbeck等人，2001年;Yu等人，2003年). 假设我们的结果可以归因于实验过程。在活体动物中，发色团的初始激发是聚焦于感兴趣的结构所必需的。这可能导致Camg2的光转换为几乎完全不敏感的钙形式(Filippin等人，2003年). 值得注意的是，所有无功能指示蝇都经过了正确插入指示蝇的测试。从苍蝇基因组DNA中扩增指示cDNA和侧翼P元件序列并测序（见材料和方法）。
脚注
这项工作得到了Max-Planck-Society的支持。我们感谢Winfried Denk在双光子激光显微镜方面的帮助，感谢Oliver Griesbeck、Atsushi Miyawaki和Roger Tsien提供DNA，感谢Yalin Wang、C.Goodman、C.Schuster、C.Lehner和Gero Miesenboeck提供苍蝇，感谢Juergen Haag提供编程、帮助和讨论。我们感谢Yong Choe对这份手稿的讨论和评论。我们特别感谢沃尔夫冈·埃斯鲍尔（Wolfgang Essbauer）和克里斯蒂安·泰尔（Christian Theile）提供了出色的技术援助。
通信地址：Dierk F.Reiff博士，系统和计算神经科学系，Max-Planck-Institute of Neurobiology，82152 Martinsried，Germany。电子邮件：ed.gpm.oruen@ffier编辑.
版权所有©2005神经科学学会0270-6474/05/254766-13$15.00/0
*D.F.R.和A.I.为这项工作做出了同等贡献。
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