虽然有证据表明synaptotagmin I（Syt I）是钙2+感应器在胞吐中持续上升，其转导过程的机制尚不清楚。Syt I雇佣了两名Ca2+-结合模块C2A和C2B域以感知Ca2+触发膜融合(佩林等。1990;Jahn&Südhof，1999年;Koh&Bellen，2003年;塔克等。2004). 钙2+与这两个域中的位点结合会引发与假定分子靶点的许多相互作用，包括含有磷脂酰丝氨酸（PS）的脂质体(博泽等。1992;查普曼，2002年)，含有磷脂酰肌醇二磷酸（PIP）的脂质体2)，Syt I的其他分子，SNARE蛋白SNAP-25和突触蛋白，以及含有这些蛋白的复合物(查普曼，2002年). 对多种细胞类型的研究表明，Syt I与这些不同靶点的结合有助于触发胞吐(福田等。1995;费尔南德斯·查孔等。2001;白等。2004b条)提出了如何协调这些多效应器相互作用的问题。根据这些发现，胞吐似乎取决于一系列复杂的步骤，这些步骤是通过许多分子成分的协同活动产生的。
安培测量法是一种非常适合于解开此类涉及事件时序的复杂过程的技术。这种电化学技术可以检测小泡中容易氧化的物质（如去甲肾上腺素），并解决胞吐的一些关键步骤。在单个囊泡胞吐开始时，电流测定法显示融合孔的开口为棘前足（PSF），这是由于囊泡内容物通过开放的融合孔缓慢泄漏而引起的。然后，融合孔可以闭合以保留大部分囊泡内容物并产生吻和流事件，或者扩张以排出整个囊泡内容物质并产生尖峰。我们对融合孔开口和峰值的时间序列的分析揭示了两种不同的钙2+-胞吐的触发步骤。因此，Syt I和Ca2+触发融合孔的开放及其随后的扩张。此外，Syt I的C2A和C2B域在这两个步骤中扮演不同的角色。
方法
分子生物学
DNA构建物编码野生型Syt I（G374）和突变型Syt I-D230S和Syt I-D363N(王等。2003一)如前所述，被亚克隆到pIRES2EGFP（Clontech）中(王等。2001). pIRES2EGFP载体允许根据荧光选择转染细胞。使用ECM 830电穿孔器（BTX Inc.，San Diego，CA，USA）以230 V，5 ms脉冲通过电穿孔将50μg DNA转染细胞。根据重组标准校准的免疫印迹分析表明，与空白载体转染的对照细胞相比，野生型或突变型Syt I转染的细胞中Syt I水平高约7.5倍(白等。2004b条).
细胞培养
PC12细胞以1.2–2×10的密度进行电镀5每35 mm培养皿，在添加4.5 mg ml Dulbecco改良Eagle培养基中培养−1葡萄糖，3.7毫克毫升−1氯化钠三、5%马血清和5%铁补充小牛血清，37°C，10%CO2大气(海伊和马丁出版社，1992年). 在实验前一天，用1.5 m培养过夜，加载细胞米去甲肾上腺素和0.5 m米抗坏血酸。涂布皿上的细胞（50μg ml−1聚d日-赖氨酸和胶原蛋白I）通过冷冻-解冻循环使用液氮进行渗透(克伦钦等。1998;王等。2003一). 使用位于细胞附近的微量移液管中的溶液在完整细胞和渗透细胞中诱发分泌。溶液通过Picospritzer（General Valve Corp，Fairfield，CT，USA）门控压力（10-20 p.s.i.）排出。在完整细胞中，应用高KCl溶液（m米：105 KCl，5 NaCl，1 NaH2人事军官4，0.7氯化镁2，2氯化钙2，10个Hepes，pH 7.4）。在渗透性细胞中，应用由（m米)：121 K-谷氨酸，20 K-醋酸盐，0.2 EGTA，20 Hepes，pH 7.2，含Ca2+调整至所需浓度并用Ca进行验证2+电极。
电流测量和数据分析
用安培法监测去甲肾上腺素的释放(Chow&von Rüden，1995年;王等。2001). 使用5μm碳纤维电极记录电流，电极极化为650 mV，配有VA-10放大器（美国纽约州韦斯特伯里ALA科学仪器公司）。使用Clampex 8（Axon Instruments/Molecular Devices Corp，Union City，CA，USA）以1 kHz的频率对信号进行低通滤波，并以4 kHz的数字化率将其读入PC。PSF分析使用了大峰值（峰值振幅>15或20 pA），因为这些事件更可能发生在靠近记录电极的释放部位(哈勒等。1998). 这降低了PSF测量的可变性。PSF寿命从开始到结束进行测量，如标准Chow&von Rüden（1995）.
该实验室先前的研究描述了一种独立足，平均振幅为～0.4 pA，远小于PSF（～2 pA）(王等。2003一). 在本研究中，我们将注意力集中在振幅接近PSF的不同类型的独立足上。这里开发了分析方法，以将这些事件与那些因扩散而扭曲的全融合峰值区分开来(哈勒等。1998). 假定kiss-and-run事件的持续时间分析如下。一旦确定事件（通常峰值振幅>2 pA），开始时间即为电流上升至基线电流以上1×RMS（均方根）噪声（1 kHz时为～0.25 pA）的时间。如前所述，这种发作与用于PSF的发作相同。假定kiss-and-run事件的结束时间被视为信号低于基线和峰值之间的中点定义的两个初步时间边界之间的点的平均振幅的时间。此持续时间称为t吨1并在中的迹线中进行了说明。作为持续时间的另一种测量方法，我们采用了相同的起点，但使用了电流返回到基线电流1×RMS噪声范围内的时间。此持续时间称为t吨2也在中的迹线中进行了说明这两次的比率提供了一个事件形状指数，用于评估假定亲吻和奔跑事件的矩形。
接吻和跑步活动澳大利亚、大型接吻和跑步活动（韩国我)从转染Syt I C2B*cDNA的PC12细胞中记录。抗体一个尖刺加上一个预尖刺脚（PSF）。交流电,. 小型接吻和跑步活动（KRS公司) (王等。2003一); 这段录音是用一个100赫兹的低通滤波器录制的。抗体和交流电来自转染Syt I C2A*cDNA的PC12细胞。文学士，绘制了野生型Syt I（Syt I-wt）的峰值振幅分布Bb公司，C2B*突变（Syt I–C2B*）。野生型Syt I的74个细胞共发生1985起总事件，C2B*的38个细胞共出现313起总事件。密件抄送，来自的两个分布文学士和Bb公司以累积形式绘制，并标准化为事件总数。C类，两种不同的持续时间度量，t吨1和t吨2，显示为KR我事件和扣球。这两种情况下的起始点都是信号偏离基线的点。对于t吨1终点是信号低于事件平均振幅的位置（参见方法）。对于t吨2终点是信号返回基线的位置。比率t吨1/t吨2尖刺状项目比矩形项目小。D类，比率t吨1/t吨2对同一箱子中峰值振幅的事件进行平均并绘制与峰值振幅。3.5 pA的垂直线标志着用于将事件分类为峰值（峰值>3.5 pA）或KR的截止点我（峰值<3.5 pA）。
事件的峰值振幅被确定为最高电流值，是对全融合峰值振幅的适当测量。然而，这种测量方法不适用于矩形kiss-and-run事件。对于这些事件，平均振幅是一种更好的测量方法，它是使用面积计算的，该面积由从起点到终点的积分除以持续时间确定(t吨1). 为了排除之前研究的小振幅独立足(王等。2003一)，我们对峰值振幅使用了2 pA的截止值（2 pA峰值对应于0.7 pA的平均振幅，这很好地将小型独立足（平均值～0.4 pA）与这里描述的平均振幅为～1.5 pA的新一类kiss-and-run事件分开）。
统计分析
PSF的平均寿命（τ）计算为算术平均值（t³）减去截止时间(t吨c（c）); τ=t³-t吨c（c），其中t吨c（c）是指事件无法可靠检测到的限值，对于所有时间长于t吨c（c）.（对于指数分布，此结果是精确的(Colquhoun和Sigworth，1995年)). 单个PSF寿命测量值是数字化间隔0.25 ms的倍数，我们判断1.0 ms是能够可靠检测和准确测量的最短寿命。这定义了t吨c（c）作为0.75和1.0之间的中点t吨c（c）= 0.875. 根据累积分布的单指数拟合估计的平均寿命(王等。2001)按χ2最小值（使用原点5.0）与τ=t³相差<0.1 ms-t吨c（c）τ的误差估计值被视为寿命算术平均值的标准误差，它等于由似然最大化确定的单指数分布的τ误差(Colquhoun&Sigworth，1995年).
尖峰振幅显示出对细胞和/或记录的强烈依赖性。出于这个原因，我们计算了两个阶段的平均尖峰振幅。首先，分别计算每个细胞的平均值。然后对这些平均值进行平均，得出所谓的双平均值，并使用单元格数量（而非事件总数）计算标准误差(碰撞器等。2000). 由于事件频率和频率比率在细胞/记录之间也会有所不同，因此这些数量是针对单个细胞确定的，然后取平均值以生成细胞-分子。Kruskal–Wallis非参数检验和变异分析（GraghPad Instat第3版）表明，PSF寿命对细胞/记录没有统计上的显著依赖性，因此可以将多个细胞的PSF寿命汇总起来进行上述分析。采用两组的Mann-Whitney检验和两组以上的Kruskal-Wallis检验评估不同组平均值之间的差异的统计显著性。
结果
钙2+释放动力学相关性
直接钙2+对渗透性PC12细胞的应用引发了囊泡释放，在电流描记中记录为峰值(). 与完整细胞一样，渗透细胞中记录的峰值通常伴随着PSF()这些熔合孔隙事件的寿命服从指数分布(). 单一指数可以很好地拟合所有Ca浓度2+测试结果表明，渗透作用使熔孔动力学性质相似。如果我们假设完整细胞的去极化提高细胞内[Ca2+]至1-2μ米(王等。2001,2003一). 平均PSF寿命随着[Ca的增加而降低2+]，表明Ca2+影响开放融合孔的稳定性(). 因此，Ca2+在小泡实际吐出过程中与融合器相互作用。这种作用可能由Syt介导，已证明Syt会影响融合孔的稳定性(王等。2001).
钙2+-从渗透性PC12细胞触发的电流尖峰A类，指示的Ca浓度2+在箭头处涂抹，触发转染Syt I cDNA的渗透细胞释放。B类，展开的记录道将PSF显示为着色区域。C类，所示[Ca的PSF寿命分布2+]（60-152个PSF事件，17-31个细胞，每个细胞有6-7个转染[Ca2+]).D类，绘制了平均PSF持续时间（τ）与[加利福尼亚州2+]. * 表示P（P）<0.05，与[Ca的汇总数据进行比较2+]≥ 5 μ米.E类，峰值频率（峰值>3.5 pA；参见和方法）与[加利福尼亚州2+]. 对希尔方程的拟合得出五最大值=0.33±0.02秒−1，欧共体50= 0.74 ± 0.13 μ米,n个H（H）（Hill系数）=1.13±0.25（χ2=0.00038）。
根据融合孔动力学的最小模型，闭合孔组装并打开。打开的融合孔可以闭合或扩张(王等。2001).
C类,O（运行）、和D类分别代表闭合、开放和膨胀的融合孔。k个一表示熔孔组装的速率常数，k个o（o）是开启速度，k个c（c）是关闭速度，kd日是进入膨胀状态的速率。平均PSF寿命仅取决于闭合和膨胀速率常数：
因此，[Ca2+]τ的依赖性如所示表示k个c（c）和k个d日随[Ca增加2+]增加。这表明Ca2+绑定至少加速了其中一个基本速率过程。
表明k个d日而不是k个c（c）表示[Ca2+]通过对尖峰频率的分析，给出了τ的依赖性。我们之前报告称，增加[Ca2+]增加透性细胞的棘波频率(王等。2003一). 在早期的研究中，我们绘制了峰值振幅大于2 pA的所有事件。由于本文后面将给出新的结果，我们现在知道，使用此截止值会导致包含来自产生PSF的同一熔合孔的kiss-and-run事件。为了避免包括这些事件，我们绘制了峰值振幅>3.5 pA的事件频率(). 这使我们能够专注于孔隙扩张后的峰值，其频率可以写为
哪里（f）o（o）是指细胞中距离电极足够近的区域内用于检测的熔孔开口的频率。
等式（1）和(2)允许我们解释[Ca2+]τ的依赖性()和（f）()根据我们的聚变孔动力学方案中出现的基本速率常数。值得注意的是k个d日含[Ca2+]与观测到的τ的减少一致(等式（1）)以及（f）(等式（2）). 相比之下，如果k个c（c）随[Ca变化2+]那么两个测量的量（f）τ将呈现正相关。自从（f）伴随着τ的减少，更容易解释这两个量的变化k个d日.τ和（f）如补充材料所示，以及更详细的动力学分析。[加利福尼亚州]2+]下面将更直接地评估这些速率常数的相关性(). 重要的是，仅在k个c（c）或（f）o（o）与τ减小和τ增大的观测结果不一致（f）含[Ca2+].
钙2+渗透性Syt I转染细胞融合孔动力学的依赖性A类膨胀率，k个d日,B类，收盘价，k个c（c）、和C类，熔合开孔频率，（f）o（o）绘制了与[加利福尼亚州2+]. 最合适的希尔方程被画入A类和C类; 最合适的生产线(P（P）=0.10（线性回归）B类。对于A类,k个d-最大值=0.74±0.03，EC50= 0.90 ± 0.13 μ米,n个H（H）= 1.35 ± 0.27. 对于C类（f）o最大值=0.37±0.01秒−1，欧共体50=0.43±0.03μ米,n个H（H）= 0.74 ± 0.05 (χ2= 0.00002).
突变对释放动力学的影响
在钙分析的补充方法中2+根据融合孔动力学的依赖性，我们研究了Syt I的突变体，其中Ca2+与C2A或C2B结构域的结合受损。将编码Syt I突变体D230S和D363N的cDNA转染PC12细胞，研究钙对细胞增殖的影响2+胞吐时的配体置换。D230S是Ca2+-C2A结构域（命名为C2A*）和D363N中的结合位点突变是Ca2+-C2B结构域中的结合位点突变（命名为C2B*）。每个突变的残基形成Ca的第三环的第一配体2+-C2域的结合囊(乌巴赫等。1998). 对包含整个细胞质区域和两个C2结构域的重组蛋白与含有磷脂酰丝氨酸（PS）和磷脂酰肌醇二磷酸（PIP）的脂质体的结合进行了测试2)以及与t-SNARE、SNAP-25和syntaxin（补充材料）的异二聚体复合物结合。C2A*和C2B*胞质结构域与含PS脂质体和t-SNARE异二聚体的结合均显著降低，但只有C2B*与PIP的结合降低2-含有脂质体。
电流测量记录显示，转染了编码野生型Syt I以及编码C2A*和C2B*的cDNA的完整PC12细胞中发生了单囊泡释放事件(). 与转染野生型Syt I cDNA的细胞相比，这两个突变体减少了胞吐。野生型Syt I的峰值频率与对照细胞中的峰值频率相同(王等。2001). 用编码C2B*的cDNA转染可将释放事件的频率降低5.9倍，而C2A*的频率降低了2.6倍(). 这种差异可能与PIP的更大依赖性有关2绑定(白等。2004一)和Syt I齐聚(吴等。2003)在C2B域上。
完整转染细胞的电流测量记录A类、转染Syt I cDNA的完整细胞和Ca基因突变的Syt I c DNA的电流测量记录2+-C2A和C2B结构域的结合位点（D230S=C2A*和D363N=C2B*）。按照条形图所示，使用高KCl溶液（见方法）触发分泌。B类，绘制每个单元格的累计事件计数（事件>2 pA峰值）与时间，在编码Syt I（□）、C2A*（）和C2B*（○）的cDNA转染的细胞中。C类确定每个细胞的Syt I指示形式峰值>2 pA的事件频率，并取平均值。D类，所示蛋白质的平均PSF持续时间*P（P）< 0.05; ***P（P）< 0.001. 数据来自37到38个细胞，每个蛋白质转染5-8次。E类，指示蛋白质的平均峰值振幅（双平均值，见方法）。
C2A*对PSF的平均寿命没有影响(). τ值=1.62±0.26 ms(n个=35）与1.60±0.10 ms的值无法区分(n个=201）对于野生型Syt I（该值包括与此处研究的突变体平行获得的数据以及早期研究的对照数据(王等。2001)). 导致Ca适度减少的其他突变2+-C2A结构域的结合函数对平均PSF寿命也没有影响(索伦森等。2003;王等。2003b条). 相比之下，C2B*突变体将τ降低到0.70±0.29 ms(n个= 23;P（P）= 0.02;)与野生型Syt I和C2A*的值分别为1.60和1.62 ms相比。
C2A*对单囊泡释放事件的平均峰值振幅没有影响，但C2B*将平均峰值振幅降低了一半以上(). 单个囊泡释放事件的面积显示出类似的减少(P（P）与Syt I相比<0.001，数据未显示）。对这种减少的传统解释是囊泡的含量减少。然而，很难看出Syt I的突变如何改变囊泡的含量。在下一节中，我们将探讨更合理的解释，即这种减少是由于kiss-and-run事件的频率更高所致，在这种情况下，融合孔打开，产生与PSF类似的电流振幅，但随后闭合而不扩张。
C2B突变的接吻和跑步
转染PC12细胞的电流测量记录C2B公司*cDNA显示了大量近似矩形的小事件(). 这些事件的振幅与PSF相似()和比0.4 pA矩形事件大约4倍()这反映了一种独特的、独有的kiss-and-run细胞外排途径，在Syt IV水平升高的细胞中变得更加普遍(王等。2003一). 因为矩形是kiss-and-run胞吐的重要标志(阿尔瓦雷斯·德·托莱多等。1993;阿尔比洛斯等。1997;麦芽酒等。1999;王等。2003一)，中显示的事件表明引起PSF的～2 pA融合孔能够闭合而不扩张。因此，我们进一步分析了这些事件，以确定它们是否构成具有预期通过PSF融合孔释放kiss-and-run的特性的独特群体。在来自C2B公司*突变时，矩形事件的比例较高，这有助于开发数据分析方法，然后将其应用于野生型Syt I的数据，其中矩形事件的发生率较低，使得基于直接目测电流记录的分类更加困难(王等。2001,2003一).
由于这些矩形事件的较高比例可以解释C2B*的平均峰值振幅降低()，我们检查了峰值事件振幅的分布。转染野生型Syt I cDNA的细胞内()振幅广泛分布在～4 pA以上，但有一个狭窄的事件簇，峰值在～2.4 pA。在～1 pA也有一个小峰值，这些较小的事件是由之前描述的不同形式的kiss-and-run引起的(王等。2003一). 事实上，这些事件的振幅比在我们之前的研究中，有必要对100Hz的记录进行滤波，以将RMS噪声降低到~0.1pA，并清楚地揭示这些事件，但在目前1kHz的带宽下，RMS噪声为~0.25pA。由于许多这些事件被隐藏，我们只看到了平均振幅为~0.4pA的总体的边缘。
The distribution for theC2B公司*突变()与野生型Syt I的三个组具有相同的基本特征，但来自广泛分布的4 pA以上人群的贡献较小。这两个图的比较表明C2B公司*突变通过增加以2.4 pA为中心的小事件的比例来改变振幅的分布。当两个累积分布归一化为事件总数并绘制在一起时，这种差异尤其明显().
如果在主要反映的是经历kiss-and-run而非完全融合的小泡，那么这些事件与尖峰状完全融合事件相比应该具有更为矩形的形状。为了评估事件形状，我们比较了两种不同的事件持续时间测量方法，如下所示t吨1和t吨2在里面.t吨1定义为从开始到振幅低于事件半宽度内各点平均振幅的时间（见方法）。t吨2定义为从相同起点开始，但在电流返回基线时结束的持续时间。对于尖峰状事件，第二个终止点比第一个要晚得多，因此t吨2将比t吨1对于矩形事件，两个端点之间的差异反映了最终陡峭坠落的持续时间，因此t吨2和t吨1将小于峰值。t吨2比…大约25%t吨1对于～2.5 pA的矩形事件，显示为以及以下轨迹中显示的～20 pA峰值的两倍以上。计算t吨1/t吨2，不同峰值振幅区间的平均值表明，当峰值振幅>3.5 pA时，该比值较低，但在3.5 pA以下急剧上升(). 因此，该图显示了大事件和小事件之间的形状差异，其跃迁略低于3.5 pA。该结果支持以下假设，即小振幅事件与分布中2.4 pA处的峰值相关()与尖刺相比，形状更为矩形。
作为对小振幅事件矩形形状的额外测试，我们确定了持续时间，t吨12–3.5 pA峰值振幅范围内的事件，估计平均振幅为事件面积除以持续时间。（重要的是要重申意思是振幅和峰振幅。峰值振幅是尖峰的一个适当度量，因为尖峰有一个尖锐的顶点。相比之下，峰值对于平均振幅提供更好估计的平坦矩形事件没有什么意义。当根据振幅对事件进行分类时，我们发现使用峰值更方便。当振幅与PSF的振幅相比较时，我们使用平均振幅，并表明它对应于给定的峰值。）每个事件的平均振幅图与表达C2B*的细胞189次事件的持续时间平缓，无显著相关性(,P（P）=0.62），如预期的矩形事件，振幅均匀，寿命可变。这种行为仅限于小型活动。>3.5 pA的事件图显示出强烈的负相关(P（P）<0.0001，数据未显示）。PSF振幅图与转染野生型Syt I cDNA的细胞的持续时间也很平缓，平均值稍高()和平均振幅图与通过转染野生型Syt I cDNA的渗透细胞记录的该范围内所有事件的持续时间()看起来很像C2B*的情节(). PSF的平均振幅稍大，反映了三种偏差来源：（1）峰值振幅>20 pA的尖峰；（2） 不同形状的PSF和假定的kiss-and-run事件对其测量振幅影响较小；（3）排除了峰值>3.5 pA的推测kiss-and-run事件。
PSF和kiss-and-run事件振幅的比较A类，振幅图与2–3.5 pA峰值振幅范围内事件的持续时间（KR我)用于转染细胞的记录C2B公司*cDNA（198个事件）。B类，振幅图与从转染Syt I cDNA的细胞记录的PSF持续时间（201个事件）。C类，振幅图与2–3.5 pA峰值振幅范围（KR）内事件的持续时间我)用于记录Ca2+-转染野生型Syt I cDNA的渗透性细胞的诱发释放（936个事件）。最佳拟合线显示为根据拟合确定的斜率。线性回归给出P（P）=0.62、0.42和0.97A类,B类和C类分别是。Syt I–C2B*事件的振幅分布(D类)和Syt I PSF(E类)，将最拟合的高斯曲线绘制为连续曲线。F类，事件的分数(X（X）KR公司)对于指示的蛋白质，相对于总>2 pA的峰值振幅在2–3.5 pA范围内（双平均值，见方法）*P（P）< 0.05; **P（P）与野生型相比<0.01。数据来自37至38个细胞，转染野生型或突变型Syt I cDNA的完整细胞为5至8个转染，转染164个细胞的数据来自于转染野生类型Syt I c DNA的渗透性细胞的50个以上转染。
单囊泡融合事件形状的变化部分反映了扩散，因为从较远的位置释放会产生更宽和更小的峰值。这种效应在振幅和持续时间之间产生了显著的负相关(哈勒等。1998). 如前所述，对于>3.5 pA的事件图，这种反向相关性非常显著，但图中所示的相关性不存在表明这些事件不是被扩散扭曲的全融合尖峰。平均振幅对持续时间的依赖性不足表明存在矩形，因此支持将这些事件识别为kiss-and-run。
C2B*在2–3.5 pA峰值振幅范围内的平均振幅分布由以1.38±0.02 pA为中心的高斯函数很好地拟合()，进一步表明这些事件是一个不同的群体，而不是更大的全融合尖峰分布的尾部。这种分布类似于Syt I转染细胞中PSF振幅的分布，尽管由于前面提到的原因，高斯拟合的平均振幅明显更高（1.80±0.05 pA;P（P）< 0.001). 假定kiss-and-run事件的持续时间为τ=2.39±0.07 ms(n个=813）和1.30±0.13毫秒(n个=189）在转染Syt I和C2B公司*cDNA。这些值比相应的PSF平均持续时间的值稍大，我们无法确定这是真正的差异，还是反映了检测短暂的kiss-and-run事件的更大难度。
这些比较表明，在转染编码C2B*突变的cDNA的细胞中，峰值幅度在2–3.5 pA（平均值0.7–2.5 pA）范围内的事件是融合孔开口，其闭合时不会出现峰值。因此，我们将其指定为大型接吻和跑步活动（KR我). 这些KR我不同于之前报道的0.4 pA（平均振幅）的小吻跑事件(王等。2003一)，我们现在称之为KRS公司.参考最小动力学方案王等。(2001)用于解释Ca2+PSF寿命和峰值频率的依赖性，这些KR我这些事件反映了经过C→O→C序列而不是C→O>D峰序列的融合孔。
量化KR的分数我与全融合峰值，我们选择峰值电流振幅作为边界，并将较小事件归类为KR我和更大的事件如尖峰。所有小于2 pA（平均0.7 pA）的事件均被忽略，以排除KRS公司事件(王等。2003一). 基于KR的范围我振幅分布中的峰值()关于矩形指数图中的过渡(t吨1/t吨2在里面)，我们认为3.5–4 pA范围内的峰值振幅可以有效地将峰值与KR分开我。我们测试了3.5和4 pA，发现分析结果对这个选择不敏感，因为这个范围内的实际事件数小于总数的10%。我们决定使用3.5 pA，以便更保守地对KR进行分类我，对KR使用范围2–3.5 pA（0.7–2.5 pA平均值）我峰值>3.5 pA。KR的分数我事件（XKR公司=韩元我/（韩国我+尖峰））表示为用编码C2B*突变的cDNA转染的细胞，KR的比例是前者的两倍我与野生型Syt I相比，在转染了编码C2A*突变的DNA的细胞中，这一比例减少了两倍以上。考虑到这一较高比例的韩元我相对于尖峰，表明相对于野生型Syt I，C2B*的总事件频率降低了5.9倍()转换为全融合峰值频率降低7.7倍。C2A*的相同校正改变了峰值频率从2.6降低到2.2的因子。
KR的高比例我C2B*表明该突变阻止了开放融合孔的融合。这表明Ca2+与C2B结构域的结合驱动融合孔扩张。根据上述用于分析Ca的动力学模型2+融合孔寿命的依赖性，突变的影响可以反映融合孔扩张速率的降低，k个d日或融合孔闭合率增加，kc（c）下面的分析使用τ和KR分数的测量值我以确定这些速率常数中的每一个是如何改变的。
钙2+KR依赖性我事件
尽管KR我与转染野生型Syt I cDNA的细胞相比，转染野生类型Syt I c DNA的细胞中事件所占比例较小C2B公司*cDNA，它们具有相同的基本属性。1.46 pA的平均振幅()与韩国类似我C2B*突变体（1.45 pA，)平均振幅与持续时间无关(). 因此，我们回到了转染Syt I cDNA的渗透细胞的记录。如果升高[Ca2+]减少PSF持续时间，因为Ca2+触发融合孔扩张()，我们希望KR我低[Ca时事件更加频繁2+]. 这从两个方面得到了证实。首先，KR的比例更大我事件应降低平均事件振幅，事实上，低[Ca时显著降低2+] (). 这一结果让人想起表达C2B*的细胞记录到的事件平均振幅降低(). 这一观察结果并不取决于事件细分为尖峰和KR我，因此是钙的作用的一个特别有力的证明2+聚变孔隙动力学。
钙2+kiss-and-run事件峰值幅度和分数的相关性A类，加利福尼亚州2+平均事件振幅的相关性（峰值振幅>2 pA的事件的双平均值，见方法）**P（P）与[Ca相比<0.012+]= 0.35 μ米.B类，KR的分数我事件，X（X）KR公司，绘制了与[加利福尼亚州2+].X（X）KR公司计算方法为2–3.5 pA范围内的事件数除以所有>2 pA的事件数。误差条是平均值的标准误差，其中计算每个单元格的分数，然后求平均值***P（P）<0.001，与[Ca相比2+] > 1 μ米数据来自17至31个渗透细胞和6至7个转染。
在第二种方法中，我们检查了KR我通过将所有事件细分为用于，并计算了2–3.5 pA范围内事件的比例作为KR的分数我,X（X）KR公司这个数量明显减少，因为[Ca2+]已提出(). 这些结果表明，KR我在低钙条件下，渗透细胞中观察到的事件占观察到事件的较大比例2+].
[Ca的动力学分析2+]依赖
[加利福尼亚州]2+]PSF寿命的依赖性，τ()再加上kiss-and-run事件的分数，X（X）KR公司()，可用于计算速率常数，k个d日和k个c（c）在上面使用的动力学方案中。在我们最初使用该模型时，速率常数为k个c（c）包含完整性(王等。2001)但当时我们没有直接证据证明这种转变的发生。韩国队我这里揭示的事件表明，确实发生了这些转变。
动力学方案给出了KR的分数我根据速率常数
这种关系与等式（1）使求解成为可能k个d日和k个c（c）。值绘制于正如我们对τ和（f）(和补充材料），k个d日随着[Ca的增加而增加2+] (). 相比之下，k个c（c）没有显著的[Ca2+]依赖(;P（P）=0.10（线性回归）。我们还确定了事件的总频率>2 pA()根据的数据王等。(2003一)，但这里的频率是作为双平均值计算的(碰撞器等。2000; 方法）。中的情节与图中绘制的较大峰值频率不同因为它代表全融合峰值和KR的总和我，因此是所有融合孔隙开口的频率，包括闭合或扩张的开口。熔合孔隙开口的总频率在上文中被称为（f）o（o）.
的情节k个d日()拟合希尔方程，得出k个d-最大值=0.74±0.03毫秒−1，欧共体50= 0.90 ± 0.13 μ米、和n个H（H）（希尔系数）=1.35±0.27。对于（f）o（o）()对希尔方程的拟合得出（f）o最大值=0.37±0.01秒−1，欧共体50= 0.43 ± 0.03 μ米、和n个H（H）= 0.74 ± 0.05 (王等。2003一). 因此，这些结果解决了熔孔张开和熔孔膨胀问题(k个d日)作为两种不同的钙2+-对钙有独立贡献能力的相关过程2+-触发的胞吐。欧盟委员会50Ca的值和Hill系数2+依赖k个d日和（f）o（o）是不同的。因此，这两个Ca2+-触发步骤显示不同的Ca2+-传感特性。较高的EC50的值k个d日确保在低[Ca时发生kiss-and-run事件2+].
C2A和C2B突变体的动力学分析
我们对τ和X（X）KR公司由完整细胞通过KCl去极化触发释放的细胞。该分析得出了以下值k个c（c）和k个d日野生型Syt I和两个Syt I突变体(). 的野生型Syt I值k个c（c）接近于绘制的值的平均值. Thek个d日值介于1和2μ处绘制的点的值之间米[加利福尼亚州2+] ()从而降低了细胞内[Ca的范围2+]在用KCl去极化的完整PC12细胞中估计(王等。2003一). 中的值表明X（X）KR公司对于Ca2+C2A结构域中的配体突变()主要是由于k个c（c）.C2B*更改了这两个费率。这种突变加速了开放融合孔的退出速度，但k个c（c）表现出最大的变化。k个c（c）似乎对钙特别敏感2+Syt I中的配体突变。选择性地削弱Syt I与t-SNARE结合的其他突变以与增加k个c（c）(白等。2004b条).
表1
熔孔闭合速率常数(k个c（c）)和膨胀(k个d日)根据熔合孔寿命（τ）和kiss-and-run事件分数的测量值计算(X（X）KR公司)，使用等式（1）和(3)
| 速率常数（ms−1) |
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|---|
| k个c（c） | k个d日 |
|---|
| 系统I | 0.14 | 0.49 |
| C2A公司* | 0.056 | 0.56 |
| C2B公司* | 0.58 | 0.84 |
讨论
我们对融合孔的分析将胞吐分解为一系列不同的步骤，其中两个步骤对[Ca增加作出反应2+]. 两个Ca2+和钙2+-Syt I中的配体突变改变了融合孔的稳定性和动力学，以及融合孔开放的频率。不同[Ca的结果2+]Syt I基因突变可识别多种Ca2+-调节步骤，以及这两种独立实验方法的收敛，加强了Ca双位点的一般结论2+控制胞吐的触发。这些观察结果为囊泡融合的具体步骤提供了见解，这些步骤由Ca控制2+和Syt I，从而有助于开发Ca2+与Syt I结合触发胞吐。
根据目前的研究结果2+-相关步骤需要打开融合孔，第二步需要扩张融合孔。这两个速率过程都随着[Ca的增加而增加2+]，但[Ca的数量性质不同2+]依赖性。相比之下，融合孔闭合的速率常数对[Ca没有显著依赖性2+]这表明这是一个开放融合孔的一级动力学过程。因此，开放熔合孔恢复到由Ca表示的闭合状态2+-独立速率常数k个c（c）反映Ca引发的转变2+–Syt I复合物，可能涉及钙的解离2+如下文所述，k个c（c）对钙的突变敏感2+-结合位点，这些突变可能对k个c（c）通过加速Ca2+从C2A和C2B域中释放。
加利福尼亚州2+融合孔扩张速率的依赖性与肥大细胞的结果一致，肥大细胞中[Ca较高2+]缩短融合和发布之间的延迟(Fernandez-Chacon和Alvarez-de-Toledo，1995年). 这些结果也与量子突触电流在果蝇属幼虫神经肌肉接头(保罗等。2004). 有趣的是，高细胞内[Ca2+]考虑到高细胞外[Ca2+]嗜铬细胞中的kiss-and-run(麦芽酒等。1999). 然而，与野生型嗜铬细胞相比，转染PC12细胞中的Syt I水平很高也可能是一个因素。据报道，融合孔波动随着细胞内[Ca升高而增加2+] (周等。1996)但这一结果很难与此处研究的熔孔转变动力学联系起来。
对Syt I突变体的实验表明，Syt I的两个C2域在这些步骤中的第一步都起作用。此外，C2B结构域随后稳定了开放的融合孔，为下一步的扩张留出了更多时间。相比之下，C2A结构域具有相反的作用，关闭融合孔以促进kiss-and-run。这些对融合孔的竞争效应揭示了在kiss-and-run和完全融合之间的选择，以平衡Syt两个C2域施加的力。因此，可以在小融合孔通道和大融合孔通道之间进行选择(王等。2003一)，本文研究的大融合孔途径中的选择受到Syt I的调节，其调节方式可能因不同的Syt异构体而异。
在胞吐的两个不同点上，C2B结构域的破坏比C2A结构域的中断影响更大。大量工作支持C2B结构域损伤对胞吐更具破坏性的观点(Koh&Bellen，2003年;西基和奥古斯丁，2004). 加利福尼亚州2+两种C2A的配体(Stevens&Sullivan，2003年)和C2B(Mackler公司等。2002;西基和奥古斯丁，2004)结构域参与Ca2+-触发分泌，并且本分析有助于描述蛋白质的这些部分中的每一个所做出的精确贡献。
对于C2B结构域的突变，开放的融合孔扩张的可能性是其一半(). 突变在野生型背景下过度表达，增加了C2B*的少数扩张峰反映野生型Syt I作用的可能性。然而，由于C2B突变缩短了PSF寿命()，突变蛋白似乎以某种方式参与融合，而不仅仅是阻断融合。Syt I突变引起的融合孔排出率的变化很难与Ca诱导的变化联系起来2+结合。因为Ca2+增加k个d日，我们希望k个d日当Ca2+结合受损，但C2A*几乎没有变化k个d日C2B*则发生了相反的变化。这些令人困惑的结果需要进一步研究才能解决。
令人惊讶的是，虽然两个C2结构域都会影响开放融合孔的退出率，但只有C2B结构域突变会改变PSF的寿命。原因是k个c（c）小于k个d日由于C2A突变减少k个c（c），平均寿命，1/(k个c（c）+k个d日)，几乎不受影响，尽管k个c（c）减少了近3倍。这可以解释其他改变Ca的突变2+与C2A结构域结合不能改变熔合孔寿命(索伦森等。2003;王等。2003b条). C2B结构域中的突变更有效地改变τ，因为它们会增加k个c（c）不同Syt亚型对融合孔寿命的影响可能(王等。2001)至少部分反映了此处描述的C2B域的操作。考虑到钙的依赖性2+-依赖PIP2约束（补充数据和白等。2004一)和齐聚(吴等。2003)在C2B结构域上，这些效应器是Syt介导的融合孔动力学变化的有力候选。胞吐作用的两个不同步骤由Ca控制2+鉴于Syt-I-结合相互作用的多样性，这是一个有趣的问题。Ca如何的问题2+-受激效应器相互作用介导的胞吐已引起争议，解决这一问题可能需要更深入地了解不同效应器交互作用如何在胞吐的不同步骤中发挥作用。
EC双方50秒和两个Ca的Hill系数2+-相关步骤()相差大约两倍。乙状结肠钙2+依赖k个d日表明这种对融合孔隙扩张的作用是协同的，而Ca2+熔合开孔依赖性(（f）o（o）)不是。Ca的希尔系数2+对于使用不同实验系统的报告，发布的依赖性差异很大。目前的结果为这种差异提供了可能的解释。加快非合作早期步骤的细胞外显器的变化将允许后期合作步骤成为限速步骤。希尔系数将反映这一合作过程。在PC12细胞中，Ca2+胞吐依赖性的希尔系数为一或更少(厄尔斯等。2001;王等。2003一)这表明，在这些细胞中，速率限制步骤是非合作的孔隙开放过程。增加的操纵（f）o（o）从而改变释放的明显协同性，使融合孔扩张成为速率限制。导致这种变化的操作不需要直接作用于Ca2+-传感机制，但可能会影响这两个过程中的任何一个，从而改变限制的速率。
目前的研究集中于由电流为～2 pA的融合孔介导的胞吐。另一种专门的kiss-and-run途径使用电流仅为～0.4 pA的融孔(王等。2003一). 这两条通路先前由以下模型表示，我们在这里对其进行了修改，以纳入关于C2A和C2B域作用的现有结果。
如KR的名称我和KRS公司上面，下标L表示大的～2 pA孔隙，下标S表示小的～0.4 pA孔隙。注意，S通路是唯一的kiss-and-run通路，没有扩张步骤。我们之前建议C2B结构域参与S通路，C2A结构域参与L通路，因为操作可以减少Ca2+绑定到C2A域将流量转移到S路径(王等。2003一). 目前的结果表明，突变C2A或C2B结构域会降低L事件的频率，因此我们将这两个结构域都放在L通路的入口。钙2+-触发进入S通路是合作的，可能需要两个以上的钙2+离子。退出的动力学步骤O（运行）我也取决于C2A和C2B结构域，C2B结构域变慢k个c（c）超过k个d日，而C2A域加速k个c（c）C2A结构域在S通路不同孔隙状态之间转换控制中的位置基于C2A操作后多指数熔合孔隙寿命分布的变化(王等。2003一).
将这两条通路结合在一起进行研究后得出的一个有趣的观点是，两个C2结构域的接合顺序在L通路和S通路之间部分颠倒。因此，当其中一个C2域开始生成特定类型的融合孔时，另一个C2区域决定下一步。这两个C2结构域在其效应器相互作用方面可能是灵活的，能够相互替换以产生不同形式的胞吐，并具有不同的功能结果。这扩展了Syt的功能，潜在地赋予不同亚型以控制神经递质释放和突触传递的功能。
