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《生理学杂志》。2005年12月1日；569（第2部分）：519–531。
2005年9月22日在线发布。 数字对象标识：10.1113/jphysiol.2005.097642
预防性维修识别码：项目经理1464240
PMID：16179362

K的激活列车自动防护系统H通道2S在大鼠胰岛素分泌细胞中的表达及其潜在机制

魏阳,1 广东洋,1 贾旭明,2 吴凌云,2和王瑞（Rui Wang）1,三
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

H（H）2S是一种重要的气体递质，在哺乳动物细胞中由我-半胱氨酸代谢。因为它刺激K列车自动防护系统血管平滑肌细胞中的通道2S也可能作为K的内源性开放因子列车自动防护系统胰岛素分泌细胞系INS-1E细胞中的通道。在本研究中，K列车自动防护系统使用补丁灯技术的全细胞和单通道记录配置记录INS-1E细胞的通道电流。K（K）列车自动防护系统INS-1E细胞中的通道具有78 pS的单通道电导。这些通道被二氮杂卓激活，被格列齐特抑制。ATP（3米米)在移液管溶液中抑制K列车自动防护系统INS-1E细胞中的通道。大量H2S由INS-1E细胞产生，其中确认了胱硫蛋白γ-裂解酶（CSE）的表达。用CSE靶向的短干扰RNA（CSE siRNA）转染INS-1E细胞或用数字图书馆-丙炔甘氨酸（PPG；1-5 m米）抑制CSE，内源性H生成2S被废除。细胞外葡萄糖浓度增加显著降低内源性H生成2胰岛素分泌增加。将含有CSE基因的腺病毒（Ad-CSE）转染INS-1E细胞以过度表达CSE后，高葡萄糖刺激的胰岛素分泌几乎被消除。基础K列车自动防护系统将INS-1E细胞与高葡萄糖浓度（16m）孵育后，通道电流显著降低米)或降低内源性H2CSE-siRNA转染的S水平。在这些条件下，外源性应用H2S显著增加全细胞钾列车自动防护系统浓度等于或低于100μ的通道电流米.H型2S（100μ米)打开概率显著增加，超过单个K的2倍列车自动防护系统天然INS-1E细胞中的通道（内部输出记录）(n个= 4,P（P）< 0.05). K的单通道电导和ATP敏感性列车自动防护系统H未更改通道2S.总之，内源性H2INS-1E细胞产生的S随体内严重影响INS-1E细胞胰岛素分泌的条件。H（H）2S刺激K列车自动防护系统INS-1E细胞中的通道，独立于胞浆第二信使的激活，这可能是H的基础2S-抑制这些细胞的胰岛素分泌。H之间的相互作用2S、 葡萄糖和钾列车自动防护系统该通道可能是精细控制胰腺β细胞胰岛素分泌的一种重要而新颖的机制。

近年来的大量证据表明，H2S是一种具有重要生理功能的内源性气体分子(王，2002). 在心血管系统中，内源性H生成2硫主要由胱硫醚γ-裂解酶（CSE）催化。作为气体传递物，H2S在生理相关浓度下引起血管舒张(赵等。2001)并参与神经元功能的调节(Abe和Kimura，1996年). H的心血管作用机制之一2S是K的活化列车自动防护系统频道。H（H）2S增加了全细胞K列车自动防护系统大鼠主动脉血管平滑肌细胞（SMC）的通道电流(赵等。2001). 同样，在大鼠肠系膜动脉SMCs H2生理相关浓度下的S刺激K列车自动防护系统通道(程等。2004). H（H）2S对心脏有负性肌力作用。格列本脲（一种经典的磺脲K）部分阻断了这种作用列车自动防护系统通道阻断剂(耿等。2004). 虽然没有对分离的心肌细胞进行电生理记录，但表明K列车自动防护系统H心脏效应中的通道2注S。

K（K）列车自动防护系统通道对细胞内ATP浓度的变化很敏感。细胞内ATP水平升高导致K的关闭列车自动防护系统许多代谢活性细胞中的通道。这样，K列车自动防护系统通道是连接代谢活动和膜兴奋性的耦合因子。这一特征对胰腺β细胞尤其重要。当循环葡萄糖水平升高时，流入胰腺β细胞的葡萄糖增加，ATP生成也增加。K的间接闭包列车自动防护系统质膜上的通道使膜去极化并打开电压依赖性钙通道。这种连锁反应的最终结果是由于细胞内游离钙的增加而导致胰岛素释放增加。毫无疑问，K列车自动防护系统β细胞内的通道在调节葡萄糖诱导的胰岛素分泌中至关重要(厨师等。1988;阿什克罗夫特等。1989;Ashcroft&Gribble，1998年). 然而，除了葡萄糖的调节作用外，通过改变细胞内ATP水平列车自动防护系统通道，对于钾的其他内源性调节器的存在知之甚少列车自动防护系统胰腺β细胞中的通道。类比H的刺激作用2K上的S列车自动防护系统血管平滑肌细胞中的通道，有理由相信H2S可能是一个新奇的K列车自动防护系统胰腺β细胞中的通道开放剂。迄今为止，H的内源性生产2胰腺中的S，H的影响2S对胰岛素分泌和H相互作用的影响2S伴胰腺K列车自动防护系统尚未确定通道。

在本研究中，H2K上的S列车自动防护系统胰岛素分泌型胰岛素瘤细胞系INS-1E细胞中的通道使用补丁灯技术的全细胞和单通道记录配置进行检测。内源性H水平2通过用CSE-siRNA载体转染INS-1E细胞或用特异性H抑制剂透析细胞来降低S2S生成酶，或通过在INS-1E细胞中过度表达CSE基因而增加。内源性H的实际产量2S、 H的表达水平2测定INS-1E细胞中的S-生成酶和胰岛素分泌。我们的研究以K为特征列车自动防护系统INS-1E细胞中的通道，显示了H2S对胰岛素分泌和胰腺K的影响列车自动防护系统首次激活通道，揭示了H的内源性酶生产和代谢2胰岛素分泌细胞中的S。

方法

细胞培养

来自大鼠胰岛素瘤的INS-1E细胞（由瑞士日内瓦C.B.Wollheim博士善意提供）在加湿（5%CO）中生长2，95%O2)在添加有10%胎牛血清的Hepes-buffered RPMI-1640培养基（Sigma）中放置2天米丙酮酸钠，50μ米2-巯基乙醇（Sigma），100单位ml−1青霉素和100μg ml−1链霉素（西格玛）。对于膜片钳研究，将培养的INS-1E细胞置于安装在反相对比显微镜（Olympus IX70）台上的培养皿中。对于其他生化和分子生物学检测，在用PBS溶液冲洗两次后，采集INS-1E细胞并在500 g下离心10分钟。

电生理记录和分析

K的全细胞和单通道记录列车自动防护系统通道电流是按照前面描述的进行的(库克和黑尔斯出版社，1984年;赵等。2001). 使用Flaming/Brown微量移液器（P-87型，Sutter Instruments）从硼硅酸盐玻璃毛细管中拔出贴片移液管。当充满电解质溶液时，单通道记录的移液管电阻为8–12 MΩ，全细胞实验的移液器电阻为1–5 MΩ。所有电生理记录均在室温（20–24°C）下进行。

使用Axopatch 200A膜片钳放大器通过Digidata 1200（Axon Instruments Inc.）接口进行全细胞记录，并使用pCLAMP软件（6.02版；Axon仪器公司）进行离线分析。600 ms的测试脉冲以10 mV的增量从−150到+50 mV进行。保持电位设置为−20 mV。I–V型在600ms测试脉冲结束时，使用稳定的电流振幅构建关系。用含有（m）的溶液填充移液管米)：氯化钾105，氯化镁21.0，氯化钙21.0、EGTA 10和Hepes 10（用KOH调节pH至7.3）。除非另有规定，吸管溶液的ATP浓度为0.3 m米.所含镀液（m米)：氯化钠102、氯化钾40、氯化钙21.0，氯化镁21.2、葡萄糖4.5和Hepes 10（用NaOH调节pH至7.4）。在一些实验中，当葡萄糖浓度增加时，去除等摩尔NaCl以保持镀液的渗透压。未对原始记录进行漏电流减法，研究过程中漏电流出现明显变化的所有细胞均被排除在进一步分析之外。

对于单通道记录，拼接灯技术的内部输出配置(哈米尔等。1981)已使用。密封电阻为10 GΩ。在1 kHz（八极贝塞尔，−3 db）下过滤单通道电流，并在无间隙模型中以100μs采样间隔记录。使用pCLAMP 7.0软件（Axon Instruments Inc.）显示并分析单通道电流记录。对于每种浓度的受试制剂，至少30 s的通道活性直接记录在计算机硬盘上。开放概率(NP公司o个)即通道在总观测期内保持开放的时间分数N个表示一个补丁中单个通道的数量(Wang&Wu，1997年)使用Fetchan和Pstat程序（Axon Instruments Inc.）从全点振幅直方图中测定单通道电导。吸管溶液包含（m米)：氯化钾140，氯化镁21.2、EGTA 10和Hepes 5（用KOH调节pH至7.2）。在含有（m）米)：氯化钾140，氯化镁20.53、葡萄糖4.5、ATP 0.3、ADP 0.3和Hepes 5（用KOH调节pH至7.4）。

内源性H的测量2S生产

H（H）2如前所述测量S生产率(斯蒂帕努克和贝克，1982年)经过修改，我们实验室经常使用（赵等。 2001,2003;程等。2004). 简单地说，收集培养3-7天的INS-1E细胞，并在50 m米冰镇磷酸钾缓冲液pH 6.8。反应混合物包含（m米)：100磷酸钾缓冲液pH 7.4，10我-半胱氨酸、2吡哆醛5′-磷酸和10%（w/v）匀浆。将冷冻试管（2 ml）用作中心孔，每个试管中含有0.5 ml 1%乙酸锌作为捕集液，以及2 cm×2.5 cm的滤纸，以增加空气与液体的接触面。反应在25ml锥形烧瓶中进行（派雷克斯，美国）。用N冲洗含有反应混合物的烧瓶和中心孔2然后用双层Parafilm密封。反应是通过将烧瓶从冰中转移到37°C的摇晃水浴中开始的。在37°C下培养90分钟后，添加0.5 ml 50%三氯乙酸以停止反应。再次密封烧瓶，并在37°C下再培养60分钟，以确保完全捕获H2S从混合物中释放出来。然后将中心孔的内容物转移到试管中，每个试管中含有3.5 ml水。随后，0.5 ml 20 m米 N个,N个-二甲基-第页-7.2中的硫酸苯二胺米立即添加HCl，然后添加0.5 ml 30 m米氯化铁三在1.2中米盐酸。20分钟后，用分光光度计在670 nm处测量所得溶液的吸光度(西格尔，1965年). H（H）2根据标准H的校准曲线计算S含量2S解决方案。

INS-1E细胞胰岛素分泌的测定

将天然或转染的INS-1E细胞以5×10的密度镀入24孔板4每孔细胞数，24–48小时后当细胞达到80%的汇合时进行测试。细胞在37°C的无葡萄糖RPMI 1640培养基中保持2 h，清洗并在无葡萄糖（0 m）中预培养米)Krebs-Ringer-碳酸氢盐培养基（pH 7.4），含（m米)：135氯化钠、3.6氯化钾、5氯化钠三，0.5 NaH2人事军官4，0.5氯化镁2，1.5氯化钙2预孵育30分钟后，在37°C和不同葡萄糖浓度下培养细胞30分钟。在每个培养期结束时，收集培养基并在2500℃下离心10分钟克清除细胞碎片。上清液立即储存在−20°C下，直到使用大鼠胰岛素ELISA试剂盒（瑞典乌普萨拉Sylveniusgatan Mercodia AB）测定胰岛素。

蛋白质免疫印迹

收集培养细胞并在裂解缓冲液（EDTA 0.5）中进行裂解米; 三氯甲烷1米pH值7.4；蔗糖0.3米; 盐酸安替品1μg ml−1; 水合苯甲脒1米; leupeptin半硫酸盐1μg ml−1; 1,10-菲咯啉一水合物1米; 胃蛋白酶抑制素A 1μ米; 苯基甲基磺酰基氟化物0.1 m米和碘乙酰胺1米米). 通过在4°C下于14000 g下离心15分钟来分离提取物。如前所述进行SDS-PAGE和Western blot分析(杨等。2004一). 简单地说，等量的蛋白质在1×SDS样品缓冲液（62.5 m）中煮沸米Tris-Cl，pH 6.8，2%十二烷基硫酸钠，10%甘油，50 m米DTT和0.01%溴酚蓝），并在10%SDS-PAGE凝胶上溶解，然后转移到聚偏二氯乙烯（PVDC）硝化纤维素膜上。CSE的主要抗体稀释度为1:1000，β-肌动蛋白的稀释度为1:5000。HRP结合二级抗体在1:5000时使用。通过增强化学发光（ECL）观察免疫反应，并暴露于X射线胶片（柯达科学成像胶片）。通过在含有100 m的缓冲液中培养来剥离膜米β-巯基乙醇、2%十二烷基硫酸钠和62.5 m米三氯化氢（pH 6.8）。

CSE-siRNA转染INS-1E细胞

使用基于网络的siRNA设计程序设计CSE靶向21核苷酸siRNA(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder_html)根据AA-N19规则(碳刷放大器等。2002;Lake&Castellot，2003年). 靶序列定位于CSE起始密码子下游192个碱基的位置（GenBank登录号NM001902）。Ambion（美国德克萨斯州奥斯汀）商业化合成了带有两个5′脱氧胸苷悬链的正向（ggu uau uua ucc ugg gcu g dtdt）和反向（cag ccc agg cua aau aac c dtdt。为了优化转染条件，还产生了GADPH靶向siRNA。阴性对照siRNA，一种21核苷酸的RNA双链体，与所有已知基因没有序列同源性，也从Ambion购买。使用Ambion的siPORT脂质转染剂将siRNA转染到INS-1E细胞中。简单地说，将细胞放置一夜，形成60-70%的融合单层。30 n时的CSE siRNA米并将转染试剂复合物加入到无血清培养基中的细胞中4小时。然后加入新鲜的正常生长培养基并将细胞再孵育20小时。作为对照，使用阴性siRNA转染INS-1E细胞。

重组CSE腺病毒载体的构建及对INS-1E细胞的感染

用PCR扩增CSE（GenBank登录号）的开放读帧（ORF）AB052882号)使用一组引物：5′-CGTCCAGCATGCAGAAGAA-3′和5′-CAGTTATCAGAAGGTCCC-3′从反转录大鼠血管组织中提取。将CSE扩增的ORF连接到PCR2.1载体（Invitrogen）千磅/平方英寸I–Xho公司CSE的I限制性片段被亚克隆到千磅/平方英寸I–Xho公司穿梭载体pAdShuttle-CMV（Qbiogene，Inc.）的I位点，其中包含巨细胞病毒启动子/增强子元件和猴病毒40多聚腺苷酸化信号。对含有CSE ORF插入物的阳性克隆进行测序，以确认插入的CSE序列的准确性。所得质粒用线性化个人电脑I和腺病毒主干载体pAdeasy-1共同转化为大肠杆菌电穿孔法检测BJ5183细胞。通过限制性内切酶消化和琼脂糖凝胶电泳检测含CSE cDNA的同源重组子。然后将重组CSE腺病毒载体（Ad-CSE）转化为大肠杆菌用于大规模扩增的DH5α细胞。这个派克靴然后使用磷酸钙-DNA沉淀物将I-消化E1-缺失复制缺陷Ad-CSE载体转染到哺乳动物HEK-293细胞中。对重组Ad-CSE进行扩增、纯化和滴定(他等。1998). 以来自同一载体的编码细菌β-半乳糖苷酶（Ad-lacZ）的重组腺病毒作为对照。对于腺病毒感染，在无血清培养基中用Ad-CSE或Ad-lacZ培养亚流INS-1E细胞。孵育4 h后，取出培养基，将细胞在适当的培养基中孵育48 h。腺病毒载体在INS-1E细胞中的转染效率首先通过在不同感染倍数（MOI）下用Ad-lacZ感染细胞来测定。感染Ad-lacZ的细胞通过检测β-半乳糖苷酶的表达就地X-gal染色法(Hirooka&Sakai，2004年). 当MOI≥50时，>90%的细胞显示β-半乳糖苷酶的核染色。随后的实验在MOI为50时进行。

实时RT-PCR检测CSE转录水平

转染24小时后，从100 mm培养皿中采集未转染细胞、阴性siRNA或CSE siRNA转染细胞。用PBS冲洗单层两次，并使用Tri试剂（美国俄亥俄州辛辛那提市分子研究中心）收集总RNA。使用无DNA-free试剂盒（Ambion）避免污染DNA，并根据制造商的协议（美国印第安纳州罗氏应用科学公司），使用随机六聚体引物，使用AMV逆转录酶将总RNA（2μg）反转录到cDNA中。不含逆转录酶的对照品用于保护每个样本中的基因组DNA污染。

在与iCycler光学系统软件（3.1版）相关的iCycler iQ设备（Bio-Rad，Harcules，CA，USA）中使用SYBR Green PCR Master Mix进行实时PCR。所有PCR均使用96μl光学级PCR板和光学密封胶带在20μl体积内进行。本实验的阴性对照是没有模板的样本。循环条件为95°C 90 s，然后是38个95°C循环10 s和60°C循环20 s。为了量化，目标基因被标准化为内部标准基因β-actin。使用上述方案用转录成cDNA的总RNA（Ambion）的一系列稀释液构建标准曲线，以证实PCR中相同的扩增效率。使用热循环曲线进行标准熔化曲线分析，热循环曲线从95°C开始1分钟，降至55°C 1分钟，然后以1°C的增量上升至95°C，以确认不存在引物二聚体。通过在1.8%琼脂糖凝胶上运行PCR产物来确定产品大小。使用算术公式“2”计算相对mRNA定量-ΔΔCT'，其中ΔCT是给定目标cDNA和内源性参考cDNA的阈值周期之间的差异(杨等。2004一). 因此，该值产生归一化为内生引用的目标量。

化学品和统计分析

H（H）2S-饱和溶液（0.09米)是用纯H泡泡新鲜制成的2S气体（Praxair；加拿大密西沙加）在30°C下注入Krebs溶液40分钟，如前所述（Zhao等。 2001,2003;程等。2004). 在37°C和pH 7.4下，H的浓度2溶液中的S相对稳定(赵等。2003). 数据表示为平均值±s.e.m.公司。采用单因素方差分析（ANOVA）和临时的分析（Tukey测试）。统计显著性设置为P（P）< 0.05.

结果

内源性H2INS-1E细胞的S生成和胰岛素分泌

研究培养的INS-1E细胞是否产生H2S下不同体内条件下，INS-1E细胞与5或20 m米将细胞外葡萄糖浓度从5 m增加到20 m米显著降低内源性H生成2INS-1E细胞中S含量约为46%(图1A类). H的类似抑制2在16 m处观察到INS-1E细胞产生S米葡萄糖（未显示）。为了进一步检查这种葡萄糖介导的内源性H2硫的生成是由特定的酶过程调节的，数字图书馆-使用了选择性CSE抑制剂丙炔甘氨酸（PPG）。将溶解的INS-1E细胞与PPG混合，以促进该抑制剂与胞质定位的CSE的相互作用，然后H2测定硫生成量。发现PPG显著抑制H2INS-1E细胞中的硫生成(图1A类).

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H（H）2INS-1E细胞的S生成和胰岛素分泌

A类，葡萄糖介导的H2INS-1E细胞中的S生成。H的内源性产生2培养基中的高糖浓度显著降低了S。PPG（5米米)INS-1E细胞治疗显著降低内源性H2S生产*P（P）< 0.05与其他组。n个=每组4人。B类，葡萄糖刺激INS-1E细胞分泌胰岛素，Ad-CSE转染增加内源性H2S级*P（P）< 0.05与16 m浓度的天然或Ad-LacZ转染的INS-1E细胞米葡萄糖。n个=每组6-8人。C类，H的生产2S在Ad-CSE转染的INS-1E细胞中。用16 m培养细胞米培养基中的葡萄糖*P（P）< 0.05与其他组。n个=每组4-6人。

高糖影响INS-1E细胞的胰岛素分泌。葡萄糖浓度从5 m增加到16 m米，INS-1E细胞的胰岛素分泌增加3倍(图1B类). 用Ad-CSE转染INS-1E细胞以过度表达CSE后，基础水平（5 m米葡萄糖）没有改变。然而，高葡萄糖刺激的胰岛素分泌实际上被取消了(图1B类). 内源性H的产量显著增加2来自Ad-CSE转染的INS-1E细胞的S如所示图1C类天然INS-1E细胞也转染Ad-LacZ作为阴性对照。Ad-LacZ转染对INS-1E细胞基础和高葡萄糖刺激的胰岛素分泌均无影响(图1B类).

K的表征列车自动防护系统INS-1E细胞中的通道

格列齐特是一种特异性K受体阻滞剂列车自动防护系统胰腺β细胞中的通道(特鲁伯等。1986;阿什克罗夫特，2000年). 格列齐特（1μ米)显著降低全细胞K列车自动防护系统在−100 mV时，INS-1E电池中的电流从−1049.9±115到522.8±88 pA(n个= 5,P（P）< 0.05). 格列齐特对全细胞钾影响的典型结果列车自动防护系统频道如所示图2A类.重氮氧化物是K的有力开创者列车自动防护系统胰腺β细胞的通道(鲟鱼等。1988;德哈汉等。1999). 全电池K列车自动防护系统INS-1E细胞中的通道受到二氮氧化物的显著刺激(图2B类). 全电池K列车自动防护系统INS-1E细胞中的通道也以其对细胞内ATP的敏感性为特征。K（K）列车自动防护系统通道电流为82.9±8.6 pA pF−1（-120毫伏），0.3米米移液管溶液中的ATP(n个= 6). 当ATP浓度增加到3 m时米，K列车自动防护系统通道电流降至29.7±5.6 pA pF−1（-120毫伏）(n个= 5,P（P）< 0.05与0.3米米移液管溶液中的ATP）。

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全细胞钾的药理学敏感性列车自动防护系统INS-1E细胞中的通道

保持电位，−20 mV。A类，抑制全细胞钾列车自动防护系统INS-1E细胞中的格列齐特通道。代表K列车自动防护系统通道电流（顶部面板）和平均值I–V型全细胞K的关系列车自动防护系统通道（底部面板，n个=5）在施用1μ米.B类，刺激全细胞钾列车自动防护系统INS-1E细胞中的二氮杂卓通道。代表K列车自动防护系统通道电流（顶部面板）和平均值I–V型K的关系列车自动防护系统通道（底部面板，n个=4）在0.3 m处施用二氮杂卓前后米.

具有对称K+（140米米)移液管和浴液中的K列车自动防护系统INS-1E细胞中的通道具有78±2.3 pS的单通道电导(n个= 5) (图3A类). 这些单通道K列车自动防护系统电流以快速开闭转换和短暂爆发的形式出现。单个K的开放概率列车自动防护系统−60 mV时的通道为0.08±0.01(n个= 6). 当格列齐特（1μ米)加入镀液后，单通道的活性大大降低，开放概率降至0.004±0.001(n个= 5,P（P）< 0.05) (图3B类). 当二氮杂卓（100μ米)应用于内外贴片，单通道活性大大增加，单通道开放概率为K列车自动防护系统通道从0.09±0.01变为0.28±0.03(n个= 5,P（P）< 0.05). 然而，应用二氮杂卓后，单一内向电流振幅没有明显变化。单通道K的单位电流振幅列车自动防护系统使用二氮杂卓前后的电流分别为4.68±0.09和4.70±0.06 pA（-60 mV）(n个= 5,P（P）> 0.05).

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K的单通道特性列车自动防护系统INS-1E细胞内外膜贴片记录的通道

A类，代表性单通道K列车自动防护系统一个内外膜贴片（左面板）中的通道电流和K的单通道电导列车自动防护系统通道（右侧面板，n个= 5).B、，单个K的开放概率列车自动防护系统在没有格列齐特（1μ米). 膜电位，−60 mV。

H的影响2K上的S列车自动防护系统INS-1E细胞中的通道

K（K）列车自动防护系统INS-1E细胞中的通道也对葡萄糖刺激敏感。浴液的葡萄糖浓度从5 m改变后米至16米米，全细胞K列车自动防护系统电流显著减少(图4A类). 有5米米镀液中的葡萄糖，H2100μ时的S米对全细胞钾无影响列车自动防护系统INS-1E电池中的电流(n个= 5,P（P）> 0.05). 存在16 m米葡萄糖，H的应用2S（100μ米)INS-1E细胞显著增加K列车自动防护系统电流(图4B类). 应用数字图书馆-双三醇（DTT）（3 m米)对INS-1E细胞作用5分钟后，K没有显著变化列车自动防护系统INS-1E电池中的通道电流（79±2.69与86±2.68微安−1在−100 mV时，n个= 5,P（P）> 0.05). DTT对K缺乏影响列车自动防护系统胰腺β细胞中也有通道的报道(伊斯兰教等。1993;Krippeit-Drews公司等。1994). 由于DTT是一种还原剂，我们的结果表明H的刺激作用2K上的S列车自动防护系统INS-1E细胞中的通道不太可能由一般的还原作用介导。

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葡萄糖浓度对基础钾的影响列车自动防护系统通道电流和H的相互作用2S和K列车自动防护系统INS-1E细胞中的通道

保持电位，−20 mV。A类，葡萄糖对全细胞钾的抑制作用列车自动防护系统INS-1E细胞中的通道。代表K列车自动防护系统通道电流轨迹（顶部面板）和平均值I–V型K的关系（底部面板）列车自动防护系统槽液中葡萄糖浓度不同的通道。n个=每组5人*P（P）< 0.05.B类，H的相互作用2S与全细胞K列车自动防护系统存在高糖（16 m）时的通道米)在镀液中。代表K列车自动防护系统通道电流轨迹显示在顶部面板中，平均值I–V型K底部面板中的关系列车自动防护系统H前后INS-1E细胞中的通道2S应用程序。n个=每组5个。

检查K列车自动防护系统在静息状态下，高内源性H使INS-1E细胞的通道脱敏2S水平，我们试图降低内源性H2用PPG预处理这些细胞，以达到S水平。在PPG在场的情况下（5–10 m米)在含有5 m的镀液中米葡萄糖，H2100μ时的S米没有改变整个细胞的K列车自动防护系统INS-1E细胞中的电流（812±63与−120 mV时为796±81 pA，n个= 5,P（P）> 0.05). 在下一组实验中，PPG（1 m米)包括在用于透析细胞的移液管溶液中。仅此操作就显著降低了K列车自动防护系统通道电流增加40±9.6%(n个= 5,P（P）< 0.05). 更有趣的是，在移液管溶液中加入PPG，揭示了外源性H的剂量依赖性刺激效应2K上的S列车自动防护系统通道(图5A类). 即使浓度为10μ米，H2S增加了K列车自动防护系统PPG治疗后通道电流增加69.4±5.7%(n个= 4,P（P）<0.05，−120毫伏）(图5C类). H的影响2K上的S列车自动防护系统通道与1米或5米无差异米移液管溶液中的PPG(图5A类和B类)，表明即使在1米处米PPG可能已经显著抑制CSE。Western blot分析证实CSE蛋白在INS-1E细胞中表达(图6A类). 为了进一步证明细胞内PPG的预处理效应与内源性CSE活性降低有关，将培养的INS-1E细胞转染CSE-siRNA，以抑制CSE基因的内源性表达。虽然阴性siRNA转染并没有改变CSE的翻译或转录表达水平，但CSE-siRNA转导将CSE基因的表达降低了约80%(图6A类和B类). 与抑制的CSE基因表达一致，内源性H生成2与天然INS-1E细胞相比，CSE-siRNA-转染INS-1E细胞的S显著降低(图6C类).

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H的刺激作用2整个单元格K上的S列车自动防护系统移液管溶液中PPG存在时INS-1E细胞的通道

A、，H的镀液应用2100μ时的S米向内增加K列车自动防护系统INS-1E细胞中的通道电流，用5 m透析米PPG（PPG）。n个= 4.B、，H的镀液应用2100μ时的S米向内增加K列车自动防护系统用1m透析的INS-1E细胞的通道电流米PPG（PPG）。n个= 5.C类H的浓度依赖性刺激效应2K上的S列车自动防护系统1m渠道米移液管溶液中的PPG。n个=每组5-6人*P（P）< 0.05与没有H时的录音2美国。

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CSE基因的表达与H的产生2培养的INS-1E细胞中的S

A类，Western blot检测INS-1E细胞中CSE蛋白的表达。B类，在有和没有siRNA转染的INS-1E细胞中CSE表达水平的实时RT-PCR比较。n个= 4. *P（P）< 0.01.C类，H的内源性生产2来自具有或不具有CSE siRNA转染的INS-1E细胞的S。n个=每组3-5人*P（P）< 0.05与天然INS-1E细胞。

全电池K列车自动防护系统CSE敲低INS-1E细胞的通道电流密度明显较小（26.8±1.9 pA pF−1,n个=4）比天然未转染细胞（46.4±3.9 pA pF−1在−120 mV时，n个= 5). 外源H2100μ时的S米全细胞钾显著增加列车自动防护系统CSE-siRNA-转染细胞的通道电流(图7). 例如，K增加67.6±5.6%列车自动防护系统通道电流是由H引起的2−120 mV时为S(n个= 5). 此外，还发现PPG没有改变单个K的功能列车自动防护系统从内到外的通道。单个K的开放概率列车自动防护系统使用PPG（1 m）后，通道为0.079±0.004米)与缺乏PPG时的情况没有区别（在−50 mV时为0.083±0.001，n个= 4,P（P）> 0.05). 该观察结果支持PPG对K的抑制作用列车自动防护系统在细胞溶质环境中，通道由CSE介导。

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H的影响2全细胞K上的S列车自动防护系统CSE-siRNA-转染INS-1E细胞中的通道

A类，H2S（100μ米)对K没有影响列车自动防护系统转染负siRNA的INS-1E细胞中的通道。n个= 4.B类，H2S（100μ米)K显著增加列车自动防护系统用CSE siRNA转染的INS-1E细胞中的通道电流。n个= 5. *P（P）< 0.01.

采用内向外单通道记录配置，曝光K列车自动防护系统离体膜贴片中通往内源性H的通道2S最小化。因此，K的脱敏列车自动防护系统内源性H在胰岛素分泌细胞中的通道2S可以得到更好的确认。在这种记录配置中，H的应用2低浓度下的S（100μ米)显著刺激K列车自动防护系统通道(图8A类). 单个K的开放概率列车自动防护系统通道从0.08±0.002增加到0.26±0.05(n个= 4,P（P）<0.01），单通道关闭时间从189±7降至59±6ms(n个= 4,P（P）<0.01）乘以100μ米H（H）2S.然而，H2S没有改变单通道的开放时间，也没有改变K的单通道电导列车自动防护系统频道。H的影响2还检测了不同膜电位下S对单通道活性的影响。H没有改变单通道电流的线性电流-电压关系2S（100μ米)单通道电导为78±2.2 pS(n个= 6) (图8B类). 检查H2S改变了K的ATP敏感性列车自动防护系统通道，内外斑细胞溶质侧的ATP浓度从300μ米至30和3μ米.虽然单个K的开放概率列车自动防护系统通道随着ATP浓度的降低而增加，H2S增加了K的打开概率列车自动防护系统具有不同ATP水平的相同程度的通道(图9). 看来H2S直接作用于K列车自动防护系统通道蛋白，而不是改变钾的ATP敏感性列车自动防护系统频道。

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激活单个K列车自动防护系统H在INS-1E细胞中的通道2S、 以对称140 m的内向外配置记录M（M）KCl解决方案

A类，单个K的打开概率变化列车自动防护系统H诱发的通道2S.通道的关闭状态由每条记录旁边的条指示。膜电位，+60 mV。开启概率的变化(P（P）o个)显示在右侧面板中。B类，H的影响2S关于K的单通道电导列车自动防护系统INS-1E细胞中的通道。K的代表性原始记录列车自动防护系统H存在时的通道2S（100μ米)如左面板所示。这个I–V型K的关系列车自动防护系统这些条件下的通道显示在右侧面板中。n个=每个数据点6。

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H的刺激作用2K上的S列车自动防护系统INS-1E细胞中的通道与这些通道的ATP敏感性无关

单个K列车自动防护系统内外膜贴片中的通道电流(n个=4）以对称140 m记录米KCl解决方案。A类，代表性单个K列车自动防护系统H前后内外膜贴片的通道电流2S（100μ米)镀液在−60 mV膜电位下，具有不同浓度的ATP。每条记录道旁边的条指示单通道的关闭状态。B类，增加膜斑细胞溶质侧ATP的浓度降低了单个K的开放概率列车自动防护系统通道，但没有改变H的相对刺激作用2美国*P（P）< 0.05与控件。

讨论

近年来，H的生理重要性2S获得了越来越多的认可。由多种哺乳动物细胞产生，H2S调节神经元活动(Abe和Kimura，1996年)保护心脏免受缺血损伤(耿等。2004)，参与细胞凋亡和增殖的调节(杨等。2004一,b条). H的细胞效应的公认机制之一2S是K的活化列车自动防护系统这种气体递质的通道，特别是在血管平滑肌中(赵等。2001,2003;程等。2004). K（K）列车自动防护系统通道通过膜电位的变化将代谢变化与胰岛素分泌耦合，在调节胰岛素分泌细胞的功能中发挥核心作用(厨师等。1988;阿什克罗夫特和罗塞曼，1989年;Ashcroft&Gribble，1998年). 然而，关于胰腺K的内源性调节的信息很少列车自动防护系统除了已知的细胞外葡萄糖和细胞内ATP的作用。H的相互作用2S伴胰腺K列车自动防护系统迄今为止，尚未对渠道进行调查。据推断，H2S也可能刺激K列车自动防护系统胰腺β细胞中的通道与血管平滑肌细胞中的一样。应注意K的分子组成列车自动防护系统不同细胞类型的通道不同。例如，在胰腺β细胞中，K列车自动防护系统通道复合体由成孔内向整流K组成+通道四聚体Kir6.2和调节性磺脲受体SUR1(萨斯库拉等。1995;阿什克罗夫特，1996年;格鲁布尔等。1997;洛伦兹等。1998). 然而，在血管平滑肌细胞中，K列车自动防护系统河道复合体是Kir 6.1和SUR2B的组合(横崎等。1998;William&Odle，2003年). 在这种情况下，H的相互作用2S与K列车自动防护系统需要专门研究不同细胞类型中的通道。

我们记录了78 pS K列车自动防护系统INS-1E细胞中的通道。这种单通道电导是典型的K列车自动防护系统胰腺β细胞中的通道(Ashcroft&Gribble，1998年). K的其他特征列车自动防护系统通道，包括爆发开放、ATP敏感性、葡萄糖敏感性、电压不敏感性和格列齐特敏感性，都与天然胰腺β细胞中描述的类似(无界等。1998). 此外，0.3米米维持钾需要Mg-ATP列车自动防护系统我们研究中的通道电流，SUR1/KIR6.2型K共享的特性列车自动防护系统通道(殷纳加奇等。1995;格鲁布尔等。1997). 磺酰脲如格列齐特通过关闭K刺激胰岛素分泌列车自动防护系统通道(鲟鱼等。1985;特鲁伯等。1986;阿什克罗夫特，2000年). 钾通道开放剂，如二氮杂卓，通过开放钾离子抑制胰岛素分泌列车自动防护系统通道(特鲁伯等。1986;邓恩等。1987;鲟鱼等。1988;米纳米等。2003). 在我们的研究中，二氮杂卓显著增加，格列齐特抑制K列车自动防护系统INS-1E细胞的通道活性。K（K）列车自动防护系统INS-1E细胞中的通道也被槽液中的高葡萄糖浓度（16 m）抑制米)或ATP（3米米)在移液管溶液中。这些特征是K的标志列车自动防护系统胰岛素分泌细胞中的通道(库克和黑尔斯出版社，1984年;阿什克罗夫特和罗塞曼，1989年;Ashcroft&Gribble，1998年). 胰岛素分泌和钾列车自动防护系统通道功能以这种方式响应葡萄糖水平的变化。这些药理学和生物物理特性表明K列车自动防护系统INS-1E细胞的通道与胰腺β细胞的通道具有相同的特征(Ashcroft&Gribble，1998年;无界等。1998).

INS-1E细胞来源于胰岛素瘤胰腺β细胞系(Janjic公司等。1999;默格伦等。2004). 这些细胞表现出稳定的分化β细胞表型，并通过K的刺激分泌胰岛素以响应葡萄糖和非营养分泌促进剂列车自动防护系统通道和一个小的放大途径(Merglen公司等。2004). 大量H2S由INS-1E细胞产生。我们使用CSE-siRNA技术在INS-1E细胞中实现了CSE基因的部分敲除。由于该部分击倒显著减少了H的生成2S、 人们认为CSE是产生H的主要酶2INS-1E细胞中的S。更重要的是，我们的研究表明，这种内源性H2INS-1E细胞中S的产生由葡萄糖浓度的变化介导，从而为H提供了生理调节机制2S生产。H的函数相关性2INS-1E细胞中的S水平是通过这些细胞分泌胰岛素实现的。通过减少内源性H2在INS-1E细胞中产生S，高糖也刺激胰岛素分泌。此外，通过Ad-CSE感染在INS-1E细胞中过度表达CSE基因显著增加内源性H2S生成，从而抑制高葡萄糖刺激的胰岛素分泌。

在本研究中，我们首次证明了H2S激活K列车自动防护系统INS-1E细胞中的通道。不操纵内源性H2S水平，外源H2S浓度等于或低于100μ米对全细胞钾无影响列车自动防护系统INS-1E细胞中的通道。这种现象可以解释为K列车自动防护系统INS-1E细胞中的通道对内源性H不敏感2S处于静止状态。当INS-1E细胞与高浓度葡萄糖（16–20 m）孵育时米)，这些细胞对外源性H变得敏感2显著增加K的S列车自动防护系统100μ时的通道活度米.高糖浓度对K的增敏作用列车自动防护系统通道可能与高葡萄糖诱导的内源性H降低有关2S生产。通过直接抑制INS-1E细胞中的CSE活性，进一步验证了这一假设。当PPG（1-5米米)用于透析INS-1E细胞以抑制CSE和内源性H的生成2S、 全细胞K列车自动防护系统外源性H使通道电流大大增加2S的浓度依赖性。另一条支持K条件反射的证据列车自动防护系统内源性H在INS-1E细胞中的通道2S来自单通道记录研究。外源H2S显著增加了单个K的开放概率列车自动防护系统INS-1E细胞内外膜贴片中的通道。利用这种无细胞记录结构，内源性H的底物和酶2S生产被淘汰。因此，K列车自动防护系统高水平内源性H使胰岛素分泌细胞的通道脱敏2S处于静止状态。内源性H的去除或减少2S将重新敏化K列车自动防护系统使这些通道恢复对H的敏感反应2我们认为内源性H2S级有一个开关用于打开或关闭K列车自动防护系统胰岛素分泌细胞中的通道，而葡萄糖水平调节内源性H2S生产。在低细胞外葡萄糖（～5 m）的生理条件下米)，内源性H2S水平较高，这将保持K列车自动防护系统通道大多处于开放状态，从而使胰岛素分泌细胞的膜超极化。这将导致电压依赖性钙通道活性降低，胰岛素分泌细胞分泌胰岛素的能力降低。当血浆葡萄糖浓度升高时，内源性H2胰岛素分泌细胞中S的生成减少。K的后续闭合列车自动防护系统通道导致胰岛素分泌增加。在我们之前的研究中，已经表明H的血管舒张作用2S不由任何已知的第二信使介导，包括cGMP、cAMP和PKC途径(赵等。2001,2003;赵和王，2002). 在本研究中，我们发现H2S直接激活K列车自动防护系统无细胞内外膜贴片中的通道。我们还发现K的ATP敏感性列车自动防护系统H未更改通道2综上所述，这些观察结果表明H的相互作用2S和K列车自动防护系统通道不是由胞质第二信使介导的。作为还原剂，H2S可减少K的选择性半胱氨酸残基列车自动防护系统通道蛋白，改变其功能状态。然而，将经典还原剂（DTT）应用于INS-1E细胞并没有复制H的兴奋作用2K上的S列车自动防护系统通道，表明应该寻求其他机制来解释H的相互作用2S和K列车自动防护系统以组织/细胞类型特异的方式形成的通道复合体。

总之，K列车自动防护系统胰岛素分泌型INS-1E细胞中的通道与天然胰腺β细胞中的相应通道具有许多共同特征。H（H）2S增加了这些K的活性列车自动防护系统通道通过增加单通道的开放概率，而不是单通道的电导。内源性高水平H2INS-1E细胞中的S设置K的音调列车自动防护系统通道活性和胰岛素分泌水平。细胞外葡萄糖浓度增加会降低内源性H2S级。这将有两个效果。首先，K的活性列车自动防护系统INS-1E细胞中的通道将显著减少，从而增加胰岛素分泌。其次，K列车自动防护系统INS-1E细胞中的通道将部分关闭并对H重新敏感2S.内源性H的后续变化2S水平对K的功能状态影响更大列车自动防护系统这些条件下的通道。H之间的相互作用2S、 葡萄糖和钾列车自动防护系统胰岛素分泌细胞中的通道可能是在生理和不同病理生理条件下精细控制胰岛β细胞胰岛素分泌的一种重要而新颖的机制。

鸣谢

本研究得到了加拿大自然科学与工程研究委员会和加拿大卫生研究院（CIHR）的支持。W.Yang获得加拿大CIHR/心脏与中风基金会GREAT培训项目博士后奖学金的支持。X.Jia由加拿大心脏与中风基金会的学生奖学金资助。G.Yang获得了加拿大萨斯喀彻温省健康研究基金会（Saskatchewan Health Research Foundation）的博士后奖学金。L.Wu是CIHR新调查员。

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文章来自生理学杂志由以下人员提供生理学会