由Kcnq1其他1反义启动子决定沉默的程度

摘要

介绍

已有几项证据表明，反义RNA介导的基因沉默可能是多步转录调控机制中的关键调控步骤(拉沃尔尼亚等, 2004). 这包括X染色体失活(李等，1999年a)，印迹簇中的基因调控(Sleutels公司等2002年;塔库尔等, 2004)最近，个人基因调控的证据(图法雷利等, 2003).生物信息学基于小鼠和人类EST数据库的研究预测存在2500多个反义转录物(耶林等, 2003). FANTOM3财团最近的研究预测，反义转录物比先前在小鼠和人类的研究中估计的要大1.5–2倍，这表明反义转录介导的基因调控是一种普遍的机制(片山等, 2005).

根据现有文献，反义转录可分为两类：小反义转录和长反义转录。小反义转录物（也称为micro-RNA）的长度在21到23个核苷酸之间，而长反义转录体的长度差异很大，即从100 bp到数百千碱基。虽然一些小的反义转录物在发育过程中的功能意义最近被揭示了(Pasquinelli和Ruvkun，2002年)长反义转录物在发育中的功能作用尚未得到彻底研究。

染色质是组蛋白和DNA紧密结合成重复核小体单位的结果，被组织成常染色质和异染色质。新的证据表明，非编码RNA在影响常染色质和异染色质组织中具有功能性作用(伯恩斯坦和艾利斯，2005年). 然而，基本机制在很大程度上仍然未知。常染色质和异染色质是通过表征各种组蛋白修饰的相对存在来区分的。例如，常染色质富含组蛋白修饰，如乙酰化H3K9（H3K9Ac）和二甲基化H3K（H3K 9Me2），而异染色质主要以三甲基化H3 K9（H 3K9Me3）和三甲基化的H3K27（H 3K 27Me3）标记。有趣的是，H3K9的三种甲基化形式（单（H3K9Me1）、双（H3K9Me2）和H3K9-Me3）在常染色质和中心周围异染色质区域的沉默域中存在差异。常染色区中的沉默区富含H3K9Me1和-Me2，而中心周围异染色质富含H3K9Me3(彼得斯等, 2003;大米等, 2003).

最近的研究在建立活性和非活性染色质状态时调用了反义转录。例如，在地中海贫血患者的α-珠蛋白基因座中，珠蛋白启动子被广泛表达的LUC7L启动子的反义转录表观遗传失活，由于易位事件，该启动子在反义方向与α-珠蛋白质启动子并列(图法雷利等, 2003). 有趣的是，最近的一项研究表明，在胚胎干细胞中Tsix公司反义转录在整个细胞中诱导H3K4Me2西斯特轨迹，与Tsix公司反义转录，从而使西斯特/尖峰基因座转录能力强。有人建议Tsix公司-诱导转录活性染色质可能在哺乳动物胚胎早期从印迹性X染色体失活过渡到随机性X染色体灭活中起关键作用(纳瓦罗等, 2005). 然而，有趣的是，印迹控制区（ICR）的反义转录与显示原始特异性表达模式亲本的基因簇相关，导致重叠基因和非重叠基因的沉默(Sleutels公司等2002年;塔库尔等, 2004). 虽然在印迹簇中已鉴定出几个印迹反义转录物，但只有反义转录体空气和Kcnq1其他1到目前为止，在功能上与调节印记有关(Sleutels公司等2002年;塔库尔等, 2004). 与这些反义转录物相关的另一个有趣的特征是，它们的长度通常超过50kb(三津屋等, 1999;莱尔等2000年;着陆器等, 2004). 然而，反义转录长度在印迹基因簇中维持基因表达的功能作用尚不清楚。

发起人Kcnq1其他1反义转录物被映射到位于Kcnq1公司小鼠7号染色体上的基因。ICR在母体染色体上甲基化(李等，1999年b;斯米利尼奇等, 1999)而它在父系染色体上保持非甲基化。删除Kcnq1公司ICR，包括Kcnq1其他1启动子，导致正常沉默基因的激活Osbp15标准,Phld2a博士,Slc22a1l公司,Cdkn1c公司（端粒）和Kcnq1公司,Tssc4型,抄送81,Ascl2公司（着丝粒），表明ICR在保持邻近基因的原始特异性表达的亲本在距离反义启动子200 kb处的关键作用(菲茨帕特里克等2002年). 在之前的一份报告中，我们记录了Kcnq1公司ICR在控制相邻基因的表达时具有双向沉默特性。通过选择性地删除包含反义启动子的序列，或者通过在反义转录起始点不同距离插入多聚腺苷酸化序列来截断反义转录，我们已经证明了反义启动因子的双向沉默特性Kcnq1公司ICR由反义RNA控制(潘迪等, 2004;塔库尔等, 2004). 尽管3.6 kbKcnq1公司ICR片段（包含反义启动子的1.7 kb序列3′）在基于外显子的系统中独立地沉默侧翼报告基因，当我们在反义转录起始点下游1.7 kb处插入多聚腺苷酸化序列时，即在ICR序列的末端，我们没有检测到任何显著的沉默(塔库尔等, 2004). 这一观察结果表明，为了实现有效的双向沉默，需要ICR片段以外的反义转录。基于这些观察结果，我们先前提出，增加反义转录物的长度或反义转录的持续时间可能会增加反义RNA对阻遏物复合物的招募。这反过来会在与反义转录重叠的序列上为异染色质的形成创造一个成核位置，然后异染色素从成核位置扩散到其他区域(潘迪等, 2004;塔库尔等, 2004).

因此，我们热衷于解决上述有关反义转录介导的双向沉默的未决问题，即使用基于表位体的系统。首先，通过使用RT-PCR，我们发现PS4上位体中的反义转录物长度超过10kb。通过在距离反义转录起始位点4.9、5.5、6.2和9.2kb处引入SV40多腺苷酸化（PolyA）序列，我们已经表明沉默程度与转录物的长度成正比。此外，我们已经证明，与较短的转录物相比，较长的反义转录物可以更有效地传播针对非活性染色质的表观遗传修饰。

通过分析与反义转录相关的重叠和非重叠基因沉默动力学，我们证明反义RNA最初通过传播非活性染色质构象沉默重叠基因，随后沉默非重叠相邻基因。利用染色质免疫纯化（ChIP）分析组蛋白修饰与反义转录相关的动力学研究表明，H3K9的所有三种甲基化形式都可以在侧翼序列上检测到。然而，令人惊讶的是，与H3K9Me2或H3K9-Me3相比，侧翼序列最初富集了H3K9 Me1，随后转移到了H3K 9Me3富集。这些观察结果共同为Kcnq1其他1反义RNA介导的双向沉默，更重要的是，本研究提供了反义RNA和异染色质之间强有力的机制联系。

结果

Kcnq1ot1启动子编码的反义RNA的长度决定了双向沉默的程度

为了解决反义转录长度的功能作用Kcnq1其他1发起人Kcnq1公司ICR，我们最初将反义转录物定位在PS4上位组（参见图1B有关详细信息，请参见RT-PCR方法。如所示图1A–C，通过使用覆盖PS4外种皮不同区域的引物对（参见图1B对于RT-PCR引物的位置，如虚线所示），我们已经证明反义转录物跨越超过10kb的序列。我们通过在4.9 kb处插入polyA来截断反义RNA（参见图1B)，5.5 kb（参见PS4polyA5.5英寸图1B)，或9.2 kb（参见PS4polyA9.2英寸图1B)反义转录起始位点的下游。我们已经瞬时转染了这些上位体结构以及先前特征化的PS4polyA1.7上位体结构（polyA序列插入反义转录起始位点下游1.7kb；参见塔库尔等, 2004（详细信息请参阅）注入JEG-3细胞系（源自人类胎盘）8天。最初，我们使用映射polyA序列插入前后的引物对从这些转染中提取的RNA进行RT-PCR分析，以检查polyA顺序是否截断了反义转录物。我们使用OripA和OripB RT–PCR引物检查反义转录物是否因分别在反义转录起始点下游9.2或5.5 kb插入PolyA序列而被截断。同样，由于PolyA序列插入反义转录起始位点下游4.9kb，因此使用RT-PCR引物H19-Pro检查反义转录的截短(图1B和C). 在PolyA序列插入位点之外没有可检测的反义转录（见PS4polyA9.2的左侧面板、PS4polyA5.5的中间面板和PS4polyA4.9的右侧面板图1C).

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图1

PS4附加体质粒中反义转录物的定位。(A类)小鼠7号染色体末端印迹簇的物理图。6.8 kb区域的扩展地图，包括Kcnq1公司ICR如下所示。曲线箭头表示转录起始位点。(B类)各种上位体结构体PH19、PS4、PS4polyA9.2、PS4polyA5.5、PS4ΔH19polyA9.3和PS4 polyA4.9的物理图，描绘了PolyA序列（由标记显示）相对于反义转录起始位点的位置。RT-PCR引物OriPA、OripB、H19pro和Kcnq1ot1（用虚线表示）用于反义转录物的定位，并检查由于PolyA序列插入而导致的反义转录的截断。(C类)反义转录物的RT-PCR精细定位表明，反义转录体的长度超过10kb。分析还显示PolyA序列的反义转录物被截断。

接下来我们分析了第19页报告基因通过核糖核酸酶保护试验（RPA）和潮霉素基因活性通过计数潮霉素筛选后获得的耐药菌落。总之，这些分析使我们能够评估Kcnq1公司ICR，因为这些报告基因位于PS4polyA5.5和PS4poly A9.2中ICR的两侧。我们观察到，与PS4polyA5.5和PS4poyA1.7相比，PS4poly A9.2中的报告基因发生了明显的沉默，这表明反义RNA长度的增加增加了沉默的程度（见左面板图2A). 然而，插入PolyA序列不会干扰反义转录（参见图2A). 这些结果清楚地表明，转录物编码长度在Kcnq1其他1反义启动子。

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图2

反义转录物的长度决定了双向沉默的程度。(A类)左侧面板包含一个条形图，显示第19页和潮霉素基因在不同的外体结构中，如条形图所示。对于每个构造第19页用黄色条表示，潮霉素用绿色条表示。每个报告基因的活性以百分比表达水平表示。控制载体的活性（PH19第19页为了方便起见，将潮霉素基因的值指定为100%，并且突变的上位体质粒获得的值与该值相关。的活动第19页报告基因用RPA定量，RNA来自瞬时转染后8天收获的JEG-3细胞。在对总输入RNA进行归一化后，使用GAPDH公司mRNA作为内部标准，以及通过Southern杂交从转染细胞中获得的DNA定量的外显体拷贝数，该DNA通过外显体特异探针和内部对照探针进行探测，PDGF公司基因。潮霉素抗性克隆（绿色条）的数量用于评估双向沉默Kcnq1公司ICR。右侧面板描绘了一个条形图，显示了与对照结构PS4相关的各种PolyA结构中反义转录物的表达水平。如上所述计算反义转录物活性的百分比表达水平。数据表示三个独立实验的平均值±标准差。(B类)的功能映射Kcnq1其他1反义启动子Kcnq1公司国际协调委员会。卡通展示了Kcnq1公司ICR被克隆到无启动子荧光素酶载体（PGL3-Basic）。条形图显示了荧光素酶的相对活性。PGL3-Basic570和PGL3-Basic742的启动子活性强度相对于PGL3-BaseCycB2呈现。所有荧光素酶构建物均转染JEG-3细胞系。数据表示重复进行的三个独立实验的平均值±标准差。(C类)742 bp片段包含Kcnq1其他1反义启动子没有任何双向沉默活性。该图显示了PH19ot1 742中潮霉素基因相对于对照PH19质粒的活性。数据表示三个独立实验的平均值±标准差。(D类)RT-PCR分析表明，742 bp片段编码PH19ot1 742外显子结构中的反义转录物。使用H19pro引物进行RT-PCR（参见图1B有关底漆的详细信息）。(E类)使用Kcnq1ot1引物进行链特异性RT-PCR（参见图1B对于引物细节），显示反义转录物在Kcnq1公司ICR区域，但不存在任何由上位序列编码的转录物。

接下来我们研究了反义转录物是否由跨越Kcnq1其他1仅反义启动子就足以诱导双向沉默。为了解决这个问题，我们在3.6kb基因中精细定位了功能性反义启动子Kcnq1公司ICR通过PCR将跨越反义启动子不同区域的多个片段克隆到无启动子荧光素酶载体（PGL3-Basic）中，并通过分析荧光素酶活性来检测其启动子活性。我们使用CycB2启动子（B2-Luci）作为该检测的阳性对照(Lange-zu Dohna公司等2000年). 与570 bp片段和CycB2启动子相比，742 bp片段的启动子活性最高(图2B). 然后我们替换了3.6 kbKcnq1公司PS4 polyA9.2中742 bp片段的ICR（参见PH19ot1 742 in图2C)并将该质粒连同PH19转染到JEG-3细胞系。对这些转染细胞获得的RNA进行RT-PCR分析表明，742 bp的片段编码反义转录物，表明742 bp片段包含功能性反义启动子(图2D). 接下来，我们通过测量潮霉素基因活性，计算潮霉素抗性克隆，分析其双向沉默特性。如图所示图2C，仅插入跨反义启动子的序列不能传播双向沉默。

在PS4polyA9.2和PS4poly A5.5构建物中，反义RNA与第19页报告基因，因此由于来自相反启动子的双向转录，有可能形成双链RNA（dsRNA）。这反过来可能触发dsRNA介导的RNA干扰沉默途径。然而，在之前的研究中，我们通过选择性地删除第19页PS4外泌体中的转录单位。由于反义转录物与PS4外种皮中超过10kb的序列重叠，因此有可能与外种皮特异转录物（如EBNA）配对(塔库尔等, 2004). 为了调查这种可能性，我们删除了3.0 kb的第19页转录单元，覆盖第19页启动子和编码区，来自PS4polyA9.2构建体（参见PS4ΔH19 polyA 9.2图1B). 因为我们无法分析第19页在PS4ΔH19 polyA 9.2构建物中的报告基因活性，我们检测了潮霉素基因的活性，发现潮霉素的基因发生了显著的沉默（参见图2A). 更重要的是，在PS4ΔH19polyA9.2结构中，反义转录物与任何已知的表位特异转录物都不重叠。此外，在Kcnq1公司PS4ΔH19polyA9.2结构中的ICR未显示任何双向转录，这可能是由于来自外显序列的隐秘启动子活性所致(图2E). 与我们早期的结果一致，目前用PS4ΔH19 polyA 9.2获得的数据排除了dsRNA的潜在参与，dsRNA是由相反启动子的双向转录而形成的，在Kcnq1公司ICR介导的双向沉默。有趣的是，与PS4polyA9.2相比，PS4ΔH19polyA9.3中潮霉素基因沉默的程度相对较低。这与PS4ΔH19polyA 9.2中反义转录物的总长度为6.2kb的事实一致。

老鼠第19页转录单位已被证明包含保守的二级结构(蒂尔格曼等, 1995). 尽管迄今为止的研究尚未将任何已知功能归因于小鼠第19页转录，通过这些重复的反义转录可以产生二级结构，而二级结构又可能负责沉默。换句话说，观察到的双向沉默可能是由于反义转录通过第19页或表位特异序列。为了解决这个问题，我们从鼠标中添加了额外的3.2 kb本机序列Kcnq1公司定位到反义启动子下游已经存在的1.7kb序列上，使得天然基因的总长度Kcnq1其他1反义启动子下游4.9kb的基因序列。然后我们将polyA序列插入到不是4.9 kb序列末端有1个位点（参见PS4polyA4.9 in图1B). 这种反义转录物与任何已知的外种皮特异序列或外种皮转录物都不重叠。对该结构中报告基因表达的分析表明，这两种基因的活性都显著降低第19页和潮霉素基因，表明所观察到的双向沉默是3.6kb的结果Kcnq1公司ICR和第19页或表位特异性序列在沉默中没有作用(图2A). 更重要的是，这一观察结果强调了这样一个事实，即1.7 kb的下游序列包含参与双向沉默传播的关键区域，并且这些关键区域可以通过与RNP复合物的相互作用，在更长的反义转录物中有效传播沉默信号(图5). 与PS4 polyA9.2相比，PS4polyA4.9中反义RNA沉默报告基因的程度相对较低，这与反义转录长度在双向沉默中的功能作用一致。

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图5

描述反义转录物长度在介导的双向沉默中的功能作用的模型Kcnq1其他1反义RNA。由于反义启动子合成1.7kb所需的时间较短Kcnq1其他1PS4polyA1.7中的反义转录物，在其形成后很快与染色质分离，尽管它具有双向沉默所需的序列。相反，反义启动子在PS4polyA9.2中合成9.2kb的反义转录物需要更长的持续时间，从而使与异色机制复合的反义RNA在反义转录位点保持相对较长的时间。这反过来又为反义转录提供了一个机会，使非活性染色质结构扩散到顺式曲线表示反义转录。H3K9Me3用红色圆圈表示，而H3K8Ac用绿色圆圈表示。

表观遗传学修饰在重叠的H19报告基因启动子上的传播与反义转录长度紧密相连

由于上述观察清楚地证明，与较短的反义转录物相比，较长的反义基因转录物可以更有效地沉默侧翼基因，因此我们想研究反义转录体的长度如何促进侧翼基因的沉默。首先，我们想知道Kcnq1其他1反义转录与在侧翼序列上建立非活性染色质有关。为此，我们使用野生型PS4（PS4polyA9.2）和携带Kcnq1公司反义启动子（PS4CAT1-3）NF-Y结合位点发生突变的ICR；有关详细信息，请参阅潘迪等, 2004)与野生型PS4相比，它只支持30%的反义转录。如所示图3A、B和E，重叠第19页与PS4CAT1–3相比，PS4polyA9.2中的启动子富含H3K9Me3，表明反义RNA参与了侧翼活性染色质向非活性染色质的修饰。接下来，我们讨论了反义转录物长度的增加是否会影响非活性染色质的形成。从中可以看出图3C-E与PS4polyA1.7相比，PS4poly A9.2中重叠的启动子富含H3K9Me3，这表明从Kcnq1其他1启动子可以有效地将两侧的活性染色质修饰为非活性染色质。

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图3

与较短的转录物相比，较长的反义转录物有效地诱导重叠启动子上的非活性染色质。(A类)PS4polyA9.2上位体结构的示意图。(B类)对从转染PS4polyA9.2和PS4CAT1–3的JEG-3细胞中获得的ChIP材料进行半定量PCR分析，发现在重叠的启动子上以反义转录依赖的方式建立了非活性染色质。(C类)对从转染PS4polyA9.2和PS4poly A1.7表位结构的JEG-3细胞中获得的ChIP材料进行半定量PCR分析，结果表明，反义转录体越长，而非越短，修饰活性侧翼染色质的时间越长第19页报告基因启动子（富含H3K9Ac）转化为非活性染色质（富含H3CMe3）。(D类)β-球蛋白（用作对照，以测量对非活性染色质的特异性组蛋白修饰）和LDH（看家基因，用作对照，测量对活性染色质特异性组分子修饰）启动子作为内部对照，以评估ChIP的质量。(E类)（B–D）中使用的ChIP材料的定量分析。该图显示了富集百分比，并按照材料和方法中的描述对数据进行了量化。数据表示三个独立ChIP实验的平均值±s.d。

反义RNA在非重叠基因之前沉默重叠基因

在小鼠中，反义转录物Kcnq1其他1仅与重叠Kcnq1公司基因，但仍影响几个非重叠基因的调节（参见图1A). 动力学实验，重叠和非重叠基因沉默体内通过反义RNA，尚未进行。这可能部分是由于在小鼠早期发育期间，当沉默以时空方式进行调节时，很难进行这种动力学实验。在PS4polyA9.2中，反义转录物与第19页，但不是潮霉素基因，它位于Kcnq1公司ICR（参见PS4polyA9.2 in图1B). 因此，基于外显体的系统（PS4polyA9.2）提供了一个机会来解决与反义转录相关的重叠和非重叠基因沉默的时间顺序。为了详细研究这个问题，我们在转染后将PH19和PS4 polyA 9.2质粒培养到JEG-3细胞系中2、4和8天。使用特异于第19页潮霉素报告基因。如所示图4A重叠基因在转染后2天内显著沉默。然而，非重叠基因在大约2天时略微沉默，仅在8天时检测到显著沉默。有趣的是，当我们对NS11外显子结构进行后一个实验时，我们获得了类似的结果（其中潮霉素基因是与反义启动子和第19页基因为非重叠基因；有关详细信息，请参见塔库尔等, 2004)这排除了启动子特异性的可能参与(图4B). 总之，这些结果表明，反义RNA沉默重叠基因的时间比沉默非重叠基因的要早得多。

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图4

反义转录在非重叠基因之前沉默重叠基因。显示活动的条形图第19页PS4polyA9.2中的潮霉素基因(A类)和NS11(B类)质粒，转染后增殖2、4和8天。这个第19页使用RPA评估潮霉素基因活性。The percentage activity of the第19页和潮霉素基因根据总输入RNA和上位拷贝数进行归一化后计算，如图例所示图2. (C类)PS4polyA9.2上位体结构的示意图。虚线表示用于定量PCR反应的引物的位置。(D、 E类)ChIP材料的定量分析（条形图显示富集百分比，数据表示三个独立ChIP实验的平均值±s.d.，并按照图3E)在转染后2天和8天收获的PH19-和PS4polyA9.2-转染细胞的交联染色质上使用抗体，如H3K9Me1、H3K9-Me2和H3K9/Me3、H3K27Me3、H3K4Me2和H3K9Ac。ChIP分析表明第19页与非重叠潮霉素启动子（E）相比，重叠启动子（D）在2天样品中更富含非活性染色质特异性组蛋白修饰。显示EBNA（Ec，F类)和H19（H19c1和H19c2，G公司)PS4polyA9.2和PH19结构的编码区域。按照中所述进行实时量化图3E.数据表示三个独立ChIP实验的平均值±s.d。(H、 我)反义转录干扰RNAPolII启动前复合物的占据。用RNAPolII和TFIIB抗体对转染PS4polyA9.2和PH19的JEG-3细胞的交联染色质在重叠启动子上进行2天和8天的ChIP材料进行定量PCR分析第19页（H） 和非重叠潮霉素基因（I）。图表显示了浓缩百分比。如中所述进行实时定量图3E.数据表示三个独立ChIP实验的平均值±s.d。

转染2天后，反义RNA沉默重叠基因而非非重叠基因是一个有趣的发现，这促使我们研究重叠和非重叠基因上与反义转录相关的非活性染色质形成动力学。为此，我们通过使用各种抗体（H3K9Me1、H3K9-Me2、H3K9Me3、H3K 9Ac、H3K17Me3和H3K4Me2）的ChIP分析，分析了重叠和非重叠启动子上活性和非活性染色质的组蛋白修饰的时间顺序在从用PH19和PS4PolyA9.2转染的JEG-3细胞获得的交联染色质上染色2天和8天。免疫纯化材料的定量分析表明，在2天的样品中，重叠启动子富含H3K9Me1、H3K4Me2和H3K9 Ac，但不富含H3K 9Me2、H3K 9 Me3和H3K 27Me3。然而，与H3K4Me2、H3K9Ac、H3K 9Me1和H3K 9 Me2相比，8天样品中H3K9 Me3相对富集。与2天样品相比，重叠启动子处的H3K27Me3在8天样品中的富集程度明显更高(图4C和D).

相比之下，在2天的样品中，围绕非重叠启动子的染色质用H3K9Ac和H3K4Me2比用H3K 9Me1、H3K9 Me2和H3K 9 Me3富集。然而，与其他组蛋白修饰相比，在8天的样品中，染色质在H3K9Me3中相对富集(图4C和E). 由于重叠启动子与非重叠启动子相比有显著的沉默，即使重叠启动子富含H3K9Me1、H3K4Me2和H3K9 Ac，我们推测，除了表观遗传学修饰侧翼染色质外，反义转录，也可能干扰RNAPolII起始前复合物的形成。为了测试这种可能性，我们对RNAPolII前启动复合物的主要成分RNAPolⅡ和TFIIB在与反义转录相关的重叠和非重叠启动子上的占据进行了动力学分析。有趣的是，与非重叠启动子相比，重叠启动子在2天和8天样本中的RNAPolII和TFIIB占有率显著受到干扰(图4H和I).

接下来我们分析了反义RNA介导的异染色质化是否局限于启动子区域，或者是否也包括非启动子序列。我们通过分析EBNA（Ec）和第19页PS4polyA9.2和PH19结构的（H19c1和H19c2）编码区(图4C). EBNA和第19页与PH19相比，编码区显示PS4polyA9.2中H3K9Me3水平增加，H3K9 Ac水平降低，表明反义RNA介导的双向沉默涉及表观遗传修饰的线性传播(图4F和G). 总的来说，这些结果表明H3K9Ac和H3K9-Me谱主要受反义转录的影响。更重要的是，这些发现表明反义RNA介导的异染色质化涉及H3K9Me1和H3K9-Me2对H3K9/Me3的加工。

讨论

反义转录介导的双向沉默是生物学中研究较少的领域。ICR编码的反义转录物长度通常超过50 kb，更重要的是，它与分布在数百千碱基上的侧翼基因的双向沉默有关。然而，旨在揭示反义转录长度的功能意义的研究尚未开展。在这份报告中，我们首次表明，反义转录物长度与双向沉默和染色质重塑的程度密切相关。通过将polyA序列插入PS4表位体中与反义转录起始位点相关的不同位置，我们证明了长反义转录物沉默侧翼报告基因的效率高于短反义转录体，这表明反义转录物的长度在反义RNA介导的双向沉默中起着关键作用。这一观察提出了一个重要的问题，即反义转录物长度的增加如何决定沉默的强度？我们设想了两种不同的场景来解释这一有趣的观察结果。（1） 如果反义RNA更长，反义转录过程需要更多的时间来合成RNA，从而使反义RNA在转录位点停留更长的时间。反过来，这有助于通过关键的顺式-将反义RNA中的序列作用于反义转录重叠的区域，从而形成异染色质在顺式（请参见图5). （2） 或者，更长的反义转录物将更有效地与染色质结合顺式较短的反义转录物。反义RNA与染色质的结合必须通过RNP复合物与RNA中的关键序列的结合或通过RNA本身中某些序列的直接相互作用来介导。我们推测异染色质在这种情况下的扩散可能类似于西斯特-哺乳动物雌性体内介导的X失活。

尽管最近的研究表明，在整个小鼠中存在等位基因特异性染色质修饰Kcnq1公司领域(刘易斯等, 2004;乌姆洛夫等, 2004)等位基因特异性组蛋白修饰与反义转录的相关性尚未确定。通过利用野生型Kcnq1公司ICR（PS4polyA9.2）和Kcnq1公司ICR含有突变的反义启动子（PS4CAT1-3），目前的数据表明反义RNA参与了活性染色质向非活性染色质的重塑。更重要的是，更长的反义转录物（而不是更短的反义翻译物）富集了针对非活性染色质的组蛋白修饰，进一步强调了反义RNA长度在异色机制招募中的功能作用。启动子序列和非启动子序列中都存在非活性染色质，这表明反义RNA介导的双向沉默涉及非活性染色蛋白的线性扩散。

我们对与反义转录相关的重叠和非重叠基因的表达和染色质组织的平行动力学研究表明，富含H3K9Me1、H3K8Ac和H3K4Me2的重叠启动子最初沉默，而最初富含H3K4Me2和H3K9Ac的非重叠启动子随后沉默。然而，在8天内，重叠和非重叠启动子都基本沉默，并富含H3K9Me3、脱乙酰化H3K9和H3K27Me3，这表明H3K9的甲基化和H3K8的去乙酰化是对反义转录反应的早期事件，似乎与沉默过程一致。有趣的是，在高水平H3K9Me1、H3K4Me2和H3K9 Ac存在下重叠启动子的显著沉默表明，重叠启动子最初的沉默不仅可能是反义RNA介导的异染色质化的结果，而且可能是与反义转录相关的机制的结果。我们推测，反义启动子的基础转录机制可以通过更强的功能阻断重叠启动子的转录机制，从而导致重叠启动子显著沉默。在2天的样本中，重叠启动子上RNApolII和TFIIB的占有率显著下降，而非重叠启动子，这支持了通过重叠启动子的反义转录直接干扰RNAPolⅡ起始前复合物的占有率的说法。基于这些观察结果，我们推测重叠基因的沉默既涉及反义转录介导的染色质表观遗传修饰，也涉及干扰RNAPolII起始前复合物的形成。然而，非重叠基因的沉默主要是由于反义RNA介导的异染色质双向扩散导致的顺式在之前的一份报告中，我们排除了dsRNA的潜在参与，dsRNA是由重叠区之间的转录形成的第19页和反义启动子，在双向沉默中(塔库尔等, 2004). PS4ΔH19polyA9.2中双向沉默的存在进一步支持了我们之前的数据。然而，我们不能排除stemloop在Kcnq1其他1反义RNA可以触发重复相关的小干扰RNA介导的异染色质化，随后扩散到邻近区域。

以前，我们已经证明重叠启动子的DNA甲基化发生在对反义转录反应的沉默过程之后(塔库尔等, 2003). 总之，这些发现表明H3K9Me和H3K8Ac的变化是反义转录反应的主要事件，DNA甲基化是组蛋白修饰的结果。有趣的是，在2天的PS4polyA9.2样品中检测到H3K9Me1和H3K9-Me2的变化以及H3K9的脱乙酰化与反义转录有关。这里提供的动力学数据不允许我们确定组蛋白脱乙酰化是否发生在组蛋白甲基化之前，因为两者几乎同时发生。以前，整合转基因沉默的动力学数据在体外培养细胞表明H3K9首先发生脱乙酰化，然后是H3K9Me3和DNA甲基化(Mutskov和Felsenfeld，2004年). 综上所述，这些观察结果表明，与基因沉默相关的组蛋白修饰的时间顺序发生在多个途径中。

H3K9Me1和H3K9-Me2在2天后富集，H3K9/Me3在8天后富集，表明H3K9 Me1和H3K9Me2对H3K9:Me3的加工性。有趣的是，最近的一份报告显示，常染色质中不太稳定的沉默结构域以H3K9Me1和H3K9-Me2标记，而更稳定的中心周围异染色质主要以H3K9Me3标记(莱纳茨等, 2003;彼得斯等2003年;大米等, 2003). 在本研究中，H3K9Me3从H3K9 Me1和H3 K9 Me2中逐渐富集，表明最初由反义转录形成的沉默染色质结构具有不太稳定的特征，并逐渐转化为更稳定的沉默染色蛋白结构，类似于中心周围异染色质。更重要的是，推测组蛋白N末端选择性赖氨酸位置的三甲基化状态而不是单甲基和二甲基化状态代表稳定的表观遗传标记(莱纳茨等2003年;彼得斯等, 2003). 基于这些观察结果，我们推测反义RNA产生的沉默程度可能与H3K9的甲基化程度有关。

已有研究表明，G9a组蛋白甲基转移酶催化大多数全局H3K9Me1和H3K9-Me2的形成，而H3K9/Me3则由Suv39h1和Suv39h2特异性催化(彼得斯等, 2003;大米等, 2003). H3K9的所有三种甲基化形式对反义转录的反应表明，G9a和Suv39h组蛋白甲基转移酶是通过反义RNA招募的异色机制的一部分。有趣的是，缺乏Suv39h1和Suv39h2甲基转移酶的ES细胞显示H3K9Me3水平显著降低，同时中心周围异染色质中H3K9-Me1水平增加，表明H3K9/Me1可能作为一种体内Suv39h1和Suv39h2的基板(莱纳茨等2003年;彼得斯等, 2003;大米等, 2003). 目前的观察结果表明，在反义RNA-介导的沉默中，H3K9Me1和H3K9-Me2逐渐转变为H3K9/Me3，这有力地支持了H3K9-1和H3K-9Me2可以充当体内Suv39h1和Suv39h2的基板。

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