Notch需要早老素介导的跨膜分裂信号转导果蝇属

摘要

受体LIN-12/Notch家族在正常情况下介导细胞-细胞相互作用LIN-12/Noch信号的产生、发展和畸变与许多不同疾病相关（参考文献综述）。1和2).LIN-12/Notch蛋白是一种单程膜蛋白在成熟和信号转导。首先，蛋白酶Furin在受体转运至细胞表面；由此产生的氨基末端结构域仍然相关具有羧基末端跨膜结构域(三,4)。第二，配体结合触发细胞外区域的额外分裂羧基末端结构域（位点2），可能由ADAM家族；第二次分裂缩短了细胞外12个氨基酸的区域(5,6)。第三，蛋白质分解跨膜结构域（位点3）释放细胞内结构域，以便它可以转移到细胞核并激活靶基因的转录基因（参见参考文献。7——9).

本文研究了早老素在蛋白质水解中的作用释放LIN-12/Notch胞内结构域的分裂事件，以及对信号蛋白水解裂解事件的要求转导。早老素在家族形式的阿尔茨海默病（参考文献。10)，一个毁灭性的神经系统与脑内Aβ肽沉积有关的疾病加工由跨膜前体蛋白生产的产品，β-APP。两次卵裂事件从β-APP中释放Aβ：一次卵裂发生在细胞外结构域中称为β的位置解理发生在跨膜结构域中的一个称为γ的位置（在10中审查）。γ“位点”不是特定序列，并且跨膜结构域内的分裂可能在几天后发生不同的氨基酸。γ位点的加工需要早老素活动(11)以及最近对推定天冬氨酰蛋白酶活性的研究位点抑制剂提供了证据表明早老素本身可能是γ-分泌酶，一种执行切割事件的长期难以捉摸的酶(12,13).

遗传研究秀丽隐杆线虫,果蝇属小鼠表明早老素是必需的用于LIN-12/Notch信号(14——19)以及几条证据表明早老素介导跨膜分裂释放LIN-12/Notch细胞内结构域的事件(18,20——23)。然而，人们对这一观点表示怀疑（例如24、25），因为两项同期研究果蝇属达到关于早老素在Notch中作用的相互矛盾的结论加工和信号转导。

我们进行的一项研究检查了秒无效的Notch胞内结构域对核通路的突变敏感，体内化验，化验(18)。此分析利用功能性Notch蛋白，其中嵌合转录因子Gal4-VP16（GV）插入框架中的槽口（N）中跨膜结构域，使细胞核进入细胞内域导致表达式UAS-lacZ公司报告基因在GV控制下(9)。生化证据证实该试验为跨膜断裂的测量(26)。我们发现了核弹N的访问⁺-GV3是一种野生型蛋白质，依赖于早老素活性。同样N个^{工程变更通知}-GV3，一种组成活性跨膜模拟站点2处理产品的形式（见图。​图1），1)也依赖于早老素活性。然而，N^内部-GV3，一种组成型活性形式它仅由细胞内结构域组成，并模拟一个位点3加工产品（图。​（图1），1)即使在缺席的情况下也能获得核武器早老素活性。根据这些结果，我们得出结论：早老素是3号位点跨膜分裂和Notch胞内结构域从质膜中释放。

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图1

Notch在胚胎中枢神经中的早老素依赖性活性系统。Hb蛋白表达标记的成神经细胞如图所示野生型(A类,C类、和E类)和秒⁻(B类,D类、和F类)无处不在的胚胎表示N⁺(A类和B类),N个^{工程变更通知}(C类和D类)，或N个^内部(E类和F类)低于Gal4/UAS控制。(A类)无处不在的N个⁺在其他方面，野生型胚胎几乎没有影响神经母细胞分离。(C类和E类)在对比，N的普遍表达^{工程变更通知}或N个^内部抑制神经母细胞分离，表明本构转换活动。在秒⁻胚胎，大部分或全部腹外胚层细胞分离为成神经细胞，即使在N⁺或N^{工程变更通知}无处不在(B类和D类)，表示这些跨膜形式的转导活性需要早老素。相反，神经母细胞分离在秒⁻表达N的胚胎^内部(F类)，表示这种形式的槽口绕过对早老素的要求。所有胚胎都显示在腹部就在胚带延伸完成之后（在左侧之前）。Notch蛋白的结构如图所示：EGF，表皮生长因子基序；LNR，LIN-12/缺口重复图案；TM、，跨膜结构域；CDC10、CDC10/SWI6图案。

另一项研究由Ye进行等人。(19)，检查了通过使用表型分析。关键的基因实验是表达N个^{工程变更通知}或N^内部在控制野生型和秒⁻机翼想象盘，然后到检查对神经发生的影响：当Notch构成时神经发生受到抑制。叶等人。报告说两个N^{工程变更通知}和N^内部是能够抑制神经发生秒⁻翼盘，就像野生型盘一样。根据这一观察，他们结论是跨膜分裂不需要早老素就其本身而言而不是上游事件产生激活的跨膜形式的受体。

如果LIN-12/Notch信号转导的裂解模型是正确，那么跨膜分裂和Notch活性应该是严格相关。然而，叶的发现等人。表明Notch活性与跨膜无关N情况下的解理^{工程变更通知}蛋白质。因此，我们重新评估了本构关系是否需要早老素氮的转化活性^{工程变更通知}和N个^内部在几个不同的发展中背景，包括翼盘的神经发生，同样的背景叶化验等人。(19)。在所有情况下，与叶等人。，我们发现对N的本构转换活性^{工程变更通知},但不适用于N^内部因此，我们的结果强烈支持Notch信号的跨膜裂解模型以及早老素在介导配体诱导的跨膜分裂。

材料和方法

结果

穿过多索中央隔间边界的缺口信号。

跨背室Notch信号的激活机翼想象盘的边界产生一条“边缘”的细条纹跨越边界表达靶基因的细胞和无翼（Wg；参考文献。31和32)。Cut是一种转录因子是边缘细胞分化所必需的(31,32)Wg是一个控制翅膀生长和图案的形态原，包括装饰机翼的机械传感鬃毛规范裕度（参见参考。33)。缺少Notch或早老素活性无法表达Cut或Wg假定翼缘。可以可视化“剪切”表达式的丢失通过抗体染色在圆盘中；此外，在成年人中，Wg的丢失信号可以通过存在大型机翼缺口。相反，表达Notch的构成活性形式，例如N个^内部或N^{工程变更通知}，外胚层无论在机翼叶片内出现什么位置，都要表达Cut和Wg原基。Wg的异位表达反过来诱导邻近翅膀组织中的异位感觉母细胞（SMCs）以及导致异位翅膀生长。

的克隆秒⁻表达N个^{工程变更通知}或N^内部，以及绿色荧光蛋白（GFPnls）的核定位形式和黄色（Y）蛋白（允许成人结构遗传标记），在翼盘开发早期使用MARCM技术(29)及其对Cut表达和生长的影响对机翼叶片进行了化验（参见材料和方法)。这个MARCM技术(29)是Gal4/UAS的改进型(27)和飞行高度层/飞行高度层(30)方法中酵母Gal80蛋白占优势酵母Gal4蛋白转录激活拮抗剂从构成上表达管蛋白α1-八国集团转基因定位在trans中在这种情况下，发生了兴趣突变秒⁻.诱导有丝分裂重组使用Flp/FRT方法(30)，生成纯合子秒⁻/秒⁻缺少管蛋白α1-八国集团转基因。在这些范围内秒⁻克隆，因此，无人机-靶基因，如无人机-N个^{工程变更通知}或无人机-N个^内部，连同无人机-GFPnls公司和无人机-黄色的,可以在Gal4的控制下表达。

秒⁻表达克隆N个^{工程变更通知}跨越背室边界无法表达切割（图。​（图22B类).此外，它们还与成人翅膀的严重切口有关（图。​（图3三A类)，与一致Wg信号丢失。这些表型表明N活度^{工程变更通知}在发展中的翼取决于早老素活性。

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图2

早老素是跨膜转导活性所必需的但在翅膀发育过程中不是细胞内形式的Notch。每个该列包含单个马赛克图像翼盘的视图。克隆这种缺乏秒活性以GFP表达为标志（绿色）。这些克隆也表达N^{工程变更通知}或N个^内部，在野生型中具有组成活性遗传背景。smc-Z型表达式（红色）标签SMC会在假定的凹槽（n）中形成机械感刚毛以及磁盘其他部分的感觉器官。剪切表达式（蓝色）标记SMC的子集。切割也表示为跨背室边界的“边缘细胞”(_v（v）^d日)在叶片和上皮细胞中与notum相关。中显示的磁盘A类包含只有一个小克隆，因此可以作为正常磁盘。椎间盘位于左侧前方，腹侧向下。(A类)包含一个小克隆的磁盘的系列视图属于秒⁻ 无人机-N个^{工程变更通知}-表达单元格（黄色箭头）。克隆中的细胞形成SMC簇（由标记smc-Z型和Cut表达式），而不是通常在此位置形成的单个SMC，表示无Notch转导活性。单个SMC（标记为smc-Z型表达）在邻近的野生型组织中用箭头表示。(B类)此磁盘承载多个秒⁻表达N的克隆^{工程变更通知}并显示与Notch转导缺失相关的表型活动。凹坑中的两个克隆（黄色箭头）显示了SMC集群取代单一SMC；机翼翼展上的两个克隆背室边界（白色箭头和箭头）和显示一个细胞自动失去Cut表达。(C类)这个磁盘充当控件。的克隆秒⁻ 无人机-N个^{工程变更通知}-表达细胞是在救援人员在场的情况下生成的浴缸-秒⁺转基因。从挽救转基因中恢复早老素活性的研究N的本构活性^{电子计算机网络}在克隆中。在notum，SMC不形成，表明神经发生受到抑制。克隆（绿色）和之间没有重叠smc-Z型表达（红色）；少数明显的情况是由于核GFP和细胞质smc-Z型信号输入不同的焦平面。在翼片中，克隆人自主表达切割，表示缺口的本构活动（白色箭头标记a代表性克隆）。这些克隆也与过度生长有关相邻的野生型组织表明突变细胞在外胚层表达Wg和Cut。(D类)这个磁盘上有几个克隆秒⁻ 无人机-N个^内部-表达细胞。机翼叶片中的克隆自动表示切割。机翼以白色箭头标记的叶片克隆也诱导了相邻的野生型细胞表达表面活性剂-Z记者表明这些细胞正在发育成翼缘鬃毛突变体细胞对Wg的反应克隆（另请参见图。​图3三C类).

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图3

成虫翅膀表型与秒⁻表达跨膜或Notch的核形态。克隆的标记为黄色UAS/Gal4控制，使包括翅膀在内的表皮结构变暗毛发和边缘刚毛（图中不可见）。(A类)秒⁻表达N个^{电子计算机网络}显示与缺乏缺口信号转导。一个克隆（*）穿过翅膀边缘（与背心室室边界一致）和显示了广泛的机翼切口。中的第二个克隆（箭头）叶片的背侧隔形成一条异常粗的静脉。(B类)的克隆秒⁻细胞表示N^{电子计算机网络}在救援人员在场的情况下浴缸-秒⁺转基因显示结构性缺口活动（箭头）。克隆与双背翅突起，两侧有相邻的几排背翅缘刚毛（此处，如C类，一个箭头指向镜像对称平面）。注意，在这个实验中，克隆的存在无法在边缘上打分鬃毛，因为浴缸-秒⁺本实验中使用的转基因包括黄色的⁺拯救正常（黑暗）的基因鬃毛上的色素沉着。然而，克隆对机翼叶片的其余部分仍然可能被划伤，因为黄色的⁺基因不能挽救色素沉着翼毛。(C类)的克隆N个^内部-表达秒⁻细胞（箭头）与双背翼突起相吻合在相邻的背行两侧有一条突变体细胞由邻近的野生型细胞形成的翅缘刚毛。

相反，N的本构活性^内部不需要早老素活性。的克隆秒⁻表达N个^内部自主表达切割（图。​（图22D类)。此外，它们与两种表型有关表明它们在体外表达Wg。首先，他们诱导相邻野生型细胞中的异位翼缘鬃毛（图。​（图22D类)。其次，它们与磁盘中的凸起有关上皮细胞提示翅膀过度生长，可能由克隆体在与其相关的成年翅膀上的行为翅膀组织的大突起和边缘的异位行克隆附近野生型细胞形成的鬃毛（图。​（图3三C类).

作为N的附加控制^{工程变更通知}实验，我们还生成了N^{工程变更通知}-表达秒⁻使用相同基因进行克隆上述配置，除了管蛋白α1-秒⁺(浴缸-秒⁺)转基因，其中恢复Presenilin活动（请参阅材料和方法)。我们发现恢复早老素活性可以恢复N活度^{工程变更通知}（图。​（图22C类和​和3三B类)确认无Notch变换放射性（单位：N）^{工程变更通知}-表达秒⁻细胞是由于缺乏早老素活性。

讨论

之前，我们表明早老素活性对于Notch胞内结构域的核通路野生型受体，N⁺，以及组成型活性跨膜形式，N^{工程变更通知},但不用于组成活性细胞溶质形式的核通路，N个^内部(18)。在这里，我们检查了本构转换活性对早老素的要求两个N的^{工程变更通知}和N^内部在里面几种不同的细胞命运决定果蝇属发展。转导通过表型输出进行测定，使用井无缺口或本构缺口转换的既定标准活动。在所有检查的案例中，我们发现需要早老素N的转化活性^{工程变更通知}，但不适用于N的^内部。这些观察结果，单位：结合我们之前的实验表明早老素N的核访问需要活动^{工程变更通知}但不是N^内部(18)，表明跨膜在这些决定中，分裂和Notch转导是耦合的。

我们检查的发育决定之一是神经/表皮在发展阶段的决策中，将SMC从专业人员中挑选出来集群。对于这个细胞命运的决定，我们发现N个^{工程变更通知}其需要早老素活性本构活性，以抑制SMC偏析。我们的结果与叶的直接冲突等人。(19)，谁报告N不需要Presenilin^{工程变更通知}活动在这个决定中。叶等人。也对SMC的抑制进行了评分分离以评估Notch信号转导活性。然而，他们的实验方法与我们的不同。叶等人。表示为N^{工程变更通知}在热休克的控制下野生型和秒⁻翼图像磁盘。然后他们将磁盘置于多次热冲击下激活启动子，并染色神经标记物以评估SMC分化。这种方法的准确性关键取决于发展阶段，因为SMC通常只在中晚期形成instar翼盘。在没有独立标记的情况下在发育阶段，他们选择的磁盘可能是年龄太小或因多次热休克而发育迟缓政体。相反，我们使用的方法是内部控制的：我们可以看出SMC规范在非突变区域是正常的在同一个磁盘上对突变克隆进行评分。

叶等人。(19)还报道了生化证据表明早老素介导的分裂事件发生在细胞外结构域，产生羧基末端跨膜片段类似物到现场2加工产品。这一发现与我们的根据N-GV分析推断，卵裂位点位于跨膜结构域(18)。我们尚未解决此差异直接参与本研究。然而，我们在果蝇属我们的N-GV检测反映了跨膜依赖早老素的卵裂事件(26)。此外，我们还有观察到任何单程跨膜蛋白都可以作为早老素依赖性裂解的底物，前提是胞外结构域相对较小(26)。确实有效底物包括仅由细胞外Myc标签、异源跨膜结构域和细胞内GV结构域，一个难以调和的观察结果对缺口上游的早老素有特殊要求跨膜分裂。

为了支持我们的观点，两项哺乳动物的生物化学研究单元格(20,21)还提供了需要早老素的证据对于跨膜分裂事件，而不是在上游叶建议的处理或贩运事件等人。(19)。两项哺乳动物研究都提供了蛋白质水解的证据等价于N的形式的处理^{工程变更通知}和缺乏PS1的细胞胞内结构域的释放受损活动。此外，一项研究表明，Notch基因的转录PS1缺陷细胞中靶基因HES1减少(21)，这是与我们的发现一致，信号转导和跨膜解理是相连的。然而，另一项研究(38)到达另一个结论是，尽管存在PS1缺陷细胞的分裂减少。

原始哺乳动物细胞培养中的一个潜在并发症实验是PS2的冗余活动。这个问题已经解决最近在小鼠细胞中进行了类似的实验缺乏PS1和PS2活性(17,39)。在双零位情况，Herreman研究等人。(22)和张等人。(23)已经表明槽口被废除。此外，Herreman等人。已显示HES1的转录在转染N个^{工程变更通知}再次证明了跨膜在本实验中，卵裂与信号转导相联系。

总之，对于中的几个典型的Notch介导的决策果蝇属这里检测到早老素依赖性跨膜卵裂似乎对Notch信号转导至关重要。我们总的来说，考虑到这一点，相信这种相关性通常是正确的系统检查，因缺乏早老素活性与缺乏的突变体基本相同LIN-12/Notch活动(14,17——19,39)。此外，如果解理产品-细胞内结构域通常与正常的信号转导，很难解释许多不同的实验系统中细胞内结构域模拟激活LIN-12/Notch的作用。事实上，解理模型最初是作为一种可能的方法提出的解释表达LIN-12/Notch的表型后果细胞内结构域(28).

我们注意到，我们的结果并不排除可能在某些情况下，LIN-12/Notch信号转导涉及不依赖于细胞内跨膜结构域与细胞核移位域名。然而，目前没有证据表明替代机制用于果蝇属.主体哺乳动物细胞培养系统中的证据也支持跨膜分裂对LIN-12/Notch信号的中心性转导。

致谢

缩写

脚注

参考文献