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EMBO J。2001年3月1日；20(5): 1033–1041.
数字对象标识：10.1093年12月25日至205.1033
预防性维修识别码：下午145500
PMID：11230127

Scythe和Reaper对Hsp70伴侣功能的可逆抑制

肯尼思·瑟斯,Jaewhan Song先生,1 理查德·森本理查,1和萨利·科恩布卢斯2
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摘要

由Hsp70分子伴侣家族介导的蛋白质折叠需要ATP和协同伴侣Hdj-1。BAG-1最近被鉴定为一种bcl-2相互作用的抗凋亡蛋白，与Hsp70的ATP酶结构域结合并阻止底物释放。虽然这表明细胞具有调节Hsp70介导的蛋白质折叠的潜力，但BAG-1的生理调节因子尚未确定。我们在这里报道，最初通过与强大的凋亡诱导剂Reaper结合而分离的凋亡调节因子Scythe与BAG-1具有有限的序列同源性，并抑制Hsp70介导的蛋白质重折叠。镰刀菌介导的Hsp70抑制被Reaper逆转，为伴侣活性的调节性可逆抑制提供了证据。由于镰刀在凋亡诱导中在收割者下游发挥作用，这些发现表明镰刀/收割者可能通过调节凋亡信号分子的折叠和活性来发出凋亡信号。

关键词：Hsp70抑制/镰刀/收割器

介绍

Hsp70伴侣蛋白促进适当的蛋白质折叠，防止蛋白质聚集，并协助组装多蛋白复合物。通过这种方式，Hsp70家族成员监测并抵消潜在有害错误折叠多肽的积累，特别是在细胞暴露于应激条件下后(Hartl，1996年). 由组成和诱导成员组成的Hsp70家族成员具有识别非天然蛋白质上暴露的疏水性斑块并促进其重新折叠的能力(拉索等1995年;鲁迪格等., 1997). 然而，除了Hsp70/Hsc70外，这种蛋白质折叠还需要ATP和“协同伴侣”。这些共同伴侣中研究最深入的是Hdj-1，它可以增强ATP水解和折叠蛋白底物的伴随释放(霍菲尔德等., 1995;米纳米等., 1996).

体外，纯化的Hsc70在ATP存在下释放非天然底物。然而，最近有报道称，Hsp70可以与体内BAG-1是一种蛋白质，即使在存在Hdj-1和ATP的情况下也能阻止折叠蛋白底物的释放(Hohfeld和Jentsch，1997年;Takayama等人，1997年;Demand等人，1998年;Stuart等人，1998年;Nollen等人，2000年). 事实上，BAG-1是第一个报道的Hsp70功能负调控因子，它与Hsp70、Hdj-1和底物形成三元络合物，使底物保持在部分折叠但可溶的状态(Bimston等人，1998年;Luders等人，2000a,b条). 实际上，在不抑制Hsp70介导的核苷酸水解的情况下，BAG-1将ATP水解与折叠底物的释放解偶联(Bimston等人，1998年).

尽管BAG-1在调节Hsp70功能中的生化作用是明确的，但其确切的生物学功能尚不清楚。最初作为一种bcl-2相互作用蛋白分离出来的BAG-1随后被证明与其他信号分子相关，包括Raf-1、PDGF受体的胞内结构域和一些类固醇激素受体(Takayama公司等., 1995;Zeiner和Gehring，1995年;巴尔代利等., 1996;王等., 1996;歌曲等., 2001). 有趣的是，在某些情况下，BAG-1的过表达被报道具有抗凋亡活性(Takayama公司等., 1995). 从结构上看，BAG-1没有任何特别引人注目的特点；然而，正如Reed及其同事最初描述的那样，BAG家族蛋白确实共享一个保守的C末端～50个氨基酸的基序，称为“BAG”结构域(Takayama公司等., 1999). 此外，BAG-1及其一些近亲具有与泛素高度同源的N末端结构域。这种同源性的功能意义尚不清楚。

我们最近分离出一种称为Scythe的凋亡调节因子，其N端与BAG-1的N端具有明显的泛素同源性(Thress等人，1998年). Scythe作用于Reaper的下游，Reaper是一种小蛋白（65个氨基酸），在苍蝇的凋亡调节蛋白筛选中被确定，黑腹果蝇遗传证据表明，无论是在发育过程中还是在DNA损伤后，Reaper都是细胞凋亡的重要介导者(White等人，1994年,1996). 尽管收割者同源物尚未在其他系统中被鉴定，但苍蝇收割者可以诱导人类细胞凋亡，并可以触发细胞凋亡的生化特征（线粒体细胞色素c（c）释放，caspase激活）爪蟾(Evans等人，1997年;麦卡锡和迪克西，1998年). 这些数据表明，Reaper-responsive通路高度保守。

使用重组Reaper作为亲和树脂，将Scythe纯化为高亲和力Reaper相互作用物(Thress等人，1998年). 由于镰刀的免疫耗竭爪蟾鸡蛋无细胞提取物可阻止Reaper诱导的细胞色素c（c）释放和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活，似乎Scythe在Reaper下游的凋亡诱导途径中发挥作用。进一步的研究表明，Scythe实际上是一种负性细胞凋亡调节因子，其作用是隔离一种尚未确定的线粒体细胞色素直接诱导剂c（c）释放(Thress等人，1999年). 在与收割者结合后，Scythe释放了该因子，导致线粒体细胞色素c（c）释放、caspase激活和完全凋亡。这一系列事件在一个半纯化系统中进行了重述，当Scythe的免疫沉淀物被广泛洗涤并与Reaper孵育时，释放出一种能够启动细胞色素的因子c（c）直接从纯化的线粒体释放。

在这里报道的实验中，我们表明BAG-1和Scythe之间的明显相似性（N-末端泛素结构域的存在，抗凋亡活性）可能不仅仅是表面现象。事实上，我们表明，Scythe和BAG-1一样，是Hsp70蛋白折叠活性的直接抑制剂。此外，Scythe中的BAG结构域介导了这种抑制。然而，虽然逆转BAG-1介导的Hsp70抑制的生理手段尚不清楚，但我们发现Reaper可以缓解Scythe介导的对Hsp70的抑制。这些数据首次证明了协同伴侣配体对Hsp70抑制的可逆性。

结果

镰刀与BAG家族蛋白具有结构相似性

由于Scythe和BAG-1在过度表达时都具有抗凋亡作用，并且与其他BAG家族蛋白共享一个N末端泛素样结构域，因此我们对Scyther也可能包含BAG结构域的可能性感兴趣。BAG家族成员以及人类和爪蟾Scythe蛋白揭示了两种物种的Scyther分子中存在的候选C末端BAG结构域（图1). 虽然BAG结构域在不同蛋白质中的总体相似性为～30%，但在所有BAG家族成员中发现的四个严格保守的残基也在Scythe中保守。

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图1。镰刀在结构上类似于BAG家族蛋白。(A类)几个BAG家族成员的域以及爪蟾以及显示泛素样基序（黑色）和C-末端“BAG”结构域（条纹）的相对位置的人类镰刀。BAG-3的完整开放阅读框架尚未完全排序。C.e.、。，秀丽隐杆线虫; S.p.公司。，葡萄裂殖酵母. (B类)（A）中蛋白质C末端BAG结构域的比对。深灰色和浅灰色阴影分别表示相同和相似的残留物。

Scythe以BAG域依赖的方式与Hsc70/Hsp70的ATP酶域结合

如上所述，BAG-1蛋白抑制Hsc70/Hsp70家族成员的蛋白质折叠活性的能力是不寻常的；这种抑制活性取决于BAG结构域的存在，BAG结构域为Hsc70/Hsp70蛋白提供了直接结合位点。Scythe上假定的BAG结构域的存在促使我们研究它是否也可能结合Hsc70/Hsp70蛋白。爪蟾鸡蛋提取物补充有放射性标记，在体外翻译Hsc70蛋白并用与谷胱甘肽连接的Sepharose珠培养S公司-转移酶（GST）或GST融合到Scythe的C末端一半（ScytheC312）。在造粒和大量洗涤后，通过SDS-PAGE检查这些树脂是否存在结合的Hsc70。如图所示2A、 Hsc70与Scythe树脂特异结合。同样，Sepharose-linked GST–Hsc70有效结合内源性爪蟾鸡蛋提取物中的镰刀，其水平与使用GST–Reaper作为诱饵获得的水平相当（图2B） ●●●●。为了证明内源性Scythe和Hsc70蛋白能够相互作用，我们从爪蟾鸡蛋提取物和抗Scythe血清免疫印迹样品。如图所示2C、 内源性Hsc70蛋白和Scythe蛋白共同免疫沉淀，而Scyther与对照抗体（抗Wee1）或蛋白a–Sepharose无关。

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图2。Scythe以BAG域依赖方式结合Hsp70/Hsc70。(A类) 体外翻译爪蟾将Hsc70（IVT Hsc70）添加到提取物中，并在4°C下培养30分钟。GST或GST–将固定在谷胱甘肽上的镰刀菌C312–Sepharose珠添加到提取物中，并再培养30分钟。然后用卵子裂解缓冲液（ELB）洗涤珠子三次，通过SDS-PAGE进行解析，并通过放射自显影术观察条带。(B类)GST或指示的GST融合蛋白固定在谷胱甘肽-Sepharose珠上，并在爪蟾鸡蛋提取物在4°C下放置1小时。然后用ELB洗涤珠子三次，用SDS–PAGE溶解，并用抗Scythe多克隆抗体进行免疫印迹。(C类)抗体爪蟾Wee1或Hsc70与蛋白A–Sepharose（PAS）珠结合，然后在爪蟾鸡蛋提取物在4°C下放置1小时。免疫沉淀物用ELB洗涤三次，用SDS-PAGE溶解，并用抗Scythe多克隆抗体进行免疫印迹处理。(D类)293T细胞转染3µg所示myc标记的人Scythe构建物（hScytthe）或仅转染亲本myc质粒（仅转染myc）。转染后36小时，裂解细胞，离心，上清液与单克隆myc抗体在4°C下孵育1小时。然后添加PAS珠，在额外培养1小时后，将珠粒化，在裂解缓冲液中洗涤三次，并通过SDS-PAGE解析结合蛋白。在西方转移后，用抗Hsp70/Hsc70单克隆抗体检测印迹。(E类)在（D）中处理的相同样品在平行SDS凝胶上运行，蛋白质用考马斯亮蓝染色。(F类)在4°C下，在存在全长Hsp70（FL Hsp70）或Hsp70的ATP酶结构域（ATP酶）的情况下，培养His-tagged Scythe、缺乏BAG结构域（His-Scythe-ΔC）的His-taged Scyther或His-tag BAG-1 1h。使用镍树脂回收His标记蛋白，并通过SDS-PAGE分离结合蛋白。在西方转移后，用抗Hsp70单克隆抗体检测印迹。

为了确定是否可以在完整细胞中的人类蛋白质之间观察到Scythe–Hsc70相互作用，用抗myc抗体从细胞裂解物中免疫沉淀转染到293T细胞中的全长myc标记的人类Scythe，并检查结合的Hsc70蛋白的存在。正如预期的那样，人类镰刀和内源性Hsc70可以像它们一样爪蟾对应物，共同沉淀。重要的是，正如关于BAG-1蛋白的报道，从Scythe中删除BAG结构域（hScythe-ΔC；删除Scythe-C末端81个氨基酸），而不是N末端泛素结构域（h Scythe-ΔN），完全取消与Hsc70的结合（图2D） 尽管突变蛋白和野生型蛋白的表达水平相同（图2E） ●●●●。总的来说，这些数据表明Scythe与Hsc70/Hsp70特异性结合，并且这种结合是由Scythe's C末端BAG结构域介导的。

由于Scythe与BAG-1蛋白一样，通过其BAG结构域与Hsc70结合，因此我们希望确定Scyther在与Hsc70/Hsp70的ATP酶结构域特异性相互作用的能力方面是否也表现得像BAG-1。因此，我们利用杆状病毒载体中产生的His-tagged Scythe和细菌产生的GST-tagged Hsp70蛋白进行了一系列结合研究。正如在293T裂解物中所看到的那样，全长Hsp70与全长Scythe有效结合，而Scythe-ΔC结合Hsp70的能力严重受损（图2F） ●●●●。重要的是，全长Scythe还能够与Hsp70的孤立ATP酶结构域结合，而从Scytthe中删除BAG结构域则完全消除了这种联系。这些数据与先前报道的结果一致，表明人类Scythe可以与Hsp70样蛋白Stch的ATP酶结构域中的短序列结合(凯等., 2000).

镰刀作为Hsp70伴侣活性的负调节器

在共伴侣/Hsp70相互作用物组中，BAG-1是唯一被报道负调控Hsc70/Hsp70-蛋白质折叠能力的蛋白质(Takayama等人，1997年;Bimston等人，1998年;Nollen等人，2000年). 鉴于Scythe和BAG-1之间的相似性，我们希望确定Scyther是否可能是BAG-1的功能性亲属，能够负向调节Hsp70的蛋白质折叠能力。通常，在体外蛋白质折叠分析检测Hsp70伴侣对变性测试底物的再折叠能力。这些分析似乎忠实地反映了活化剂和抑制剂对Hsp70活性的调节，尽管测试底物并非如此体内调制器的目标–Hsp70复合体(Takayama等人，1997年;Nollen等人，2000年). 因此，我们询问Scythe是否可以改变Hsp70重折叠变性β-半乳糖苷酶的能力。重组β-半乳糖苷酶在6M胍HCl中变性后，在有或无杆状病毒产生的Scythe蛋白的情况下，用纯化的重组Hsp70、ATP和共同伴侣Hdj-1在复性缓冲液中培养。在不同的培养时间后，使用比色底物分析样品的β-半乳糖苷酶活性o个-硝基苯-β-d日-吡喃半乳糖苷。如前所述，重组Hsp70/Hdj-1允许变性β-半乳糖苷酶的复性，酶活性恢复50%（图三). 然而，当以1:2摩尔比将全长Scythe与Hsp70添加到分析中时，Hsp70介导的变性β-半乳糖苷酶的重折叠被完全抑制（图三). 重要的是，缺乏BAG结构域（ScytheΔC）的Scytthe蛋白对复性分析没有明显的抑制作用（图三). 这些数据有力地表明，镰刀具有以前意想不到的能力，能够以BAG-1样的方式抑制Hsp70介导的蛋白质重折叠。

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图3。镰刀是Hsp70伴侣活性的负调节器。通过将未折叠的β-半乳糖苷酶（3.2 nM）稀释到含有ATP（1 mM）、Hsp70（1.6µM）的复性缓冲液中，检测全长人Scythe（FL hScythere，3.2µM和Hdj-1（3.2µM）。作为自发复性的对照，将变性β-半乳糖苷酶（3.2 nM）稀释到含有3.2µM牛血清白蛋白（BSA）的复性缓冲液中。

Reaper减轻Scyth介导的Hsp70抑制

尽管BAG-1蛋白明显抑制Hsp70的蛋白折叠活性，但其调控模式尚待阐明。据推测，BAG-1介导的Hsp70的抑制必须是被尚未发现的配体可逆的。由于Scythe最初被鉴定为一种Reaper配体，我们希望确定Reaper是否可以逆转Scyther对Hsp70介导的蛋白质折叠的拮抗作用。为了测试这一点，我们在在体外β-半乳糖苷酶复性试验。如图所示4A、 Reaper能够缓解Scythe对Hsp70重折叠的抑制，在1:4（Scythe:Reaper）摩尔比下逆转80%。目前尚不清楚该摩尔比是否反映了真正的复杂化学计量，因为细菌产生的Reaper蛋白中有很大一部分可能是不溶性/非功能性的。尽管如此，同样数量的Reaper对BAG-1介导的Hsp70抑制作用没有影响，这表明这种逆转是针对Scythe的（图4B） ●●●●。这些数据表明，Reaper结合提供了一种有效的方法来逆转Scythe对Hsp70功能的抑制。

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图4。Reaper特异性地解除Scythe介导的Hsp70抑制。(A类)实验如图所示三在Reaper（3.2–12.8µM）浓度增加的情况下，用3.2µM人Scythe重复，以检查Scythe-介导抑制Hsp70介导的复性的逆转。(B类)在存在或不存在12.8µM Reaper的情况下，观察到BAG-1（1.6µM）对复性的抑制作用，证明Reaper诱导的逆转对Scythe是特异性的。作为自发复性的对照，将变性β-半乳糖苷酶（3.2 nM）稀释到含有3.2µM BSA的复性缓冲液中。

收割者抑制镰刀和热休克蛋白70的物理结合

由于无法物理结合Hsp70的Scythe突变体（ΔC Scytthe）无法抑制Hsp70介导的蛋白质重折叠，我们推测收割者可能通过使Scythe-无法结合Hsp70-发挥作用。为了研究这个问题，我们使用重组Reaper、Scythe和Hsp70蛋白进行了一系列蛋白质结合研究。His-tagged Scythe与Hsp70在重组Reaper存在的情况下孵育。如图所示5A、 Reaper有效地抑制了Scythe–Hsp70的相互作用，而对BAG-1–Hsp70-关联的实质性影响要小得多。这些结果与Reaper逆转Scythe（而非BAG-1）对Hsp70介导的蛋白质重新折叠的功能效应的能力一致。当我们向293细胞的Scythe免疫沉淀物中添加重组GST-Reaper蛋白（而非仅添加GST）时，观察到Scythe-Hsc70结合的类似逆转（图5B） ●●●●。总的来说，这些数据表明，收割者与Scythe结合可以取代Hsc70并逆转Scythe-介导的对Hsp70功能的抑制。

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图5。收割者专门抑制镰刀和热休克蛋白70的物理结合。(A类)在复性缓冲液中与Hsp70（1µM）孵育His-Scythe（1μM）或GST-BAG-1（1μM）。复合物形成后，添加浓度增加的Reaper（0、2、4、8、10µM）。结合蛋白用Ni沉淀+-琼脂糖（His-半胱氨酸）或谷胱甘肽-Sepharose（GST–BAG-1），洗涤，用SDS–PAGE溶解，并用Hsp70单克隆抗体5a5进行蛋白质印迹处理。(B类)用5µg myc-tagged human Scythe（myc-hScyther）转染293T细胞。转染后36小时，细胞被裂解和离心，上清液与重组GST或GST-Reaper（GST-Rpr）在4°C下培养30分钟。随后，将裂解产物与单克隆myc抗体在4°C下孵育1小时。然后添加PAS珠，在额外培养1小时后，将珠粒化，在裂解缓冲液中洗涤三次，并通过SDS-PAGE解析结合蛋白。在西方转移后，用抗Hsc70单克隆抗体检测印迹。

BAG结构域是Scythe相关细胞色素c释放活性的螯合所必需的

如上所述，将重组收割者添加到爪蟾鸡蛋引发了许多细胞凋亡的生化标志，包括线粒体细胞色素c（c）释放、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活、核小体间DNA断裂和附加细胞核的断裂。如前所述，添加过量的重组Scythe到爪蟾鸡蛋提取物抑制Reaper诱导的细胞凋亡。因此，我们推测外源添加的Scythe蛋白可能会重新寻找细胞色素c（c）-收割者从内源性镰刀中分离出的释放因子。与这一解释一致，收割者从Scythe免疫沉淀物中释放的物质不再诱导细胞色素c（c）首次与重组Scythe蛋白孵育后释放(Thress等人，1999年). 为了确定Scythe与Hsc70相互作用的能力是否对其隔离细胞色素的能力很重要c（c）-释放因子（s），鸡蛋提取物中添加Reaper，与野生型人类镰刀或无法结合Hsc70的镰刀（ΔC镰刀）结合。在这些条件下，野生型蛋白（而非ΔC突变体Scythe）显著抑制caspase活化和线粒体细胞色素c（c）释放以响应收割器的添加（图6A和B）。重要的是，虽然ΔC Scythe不能与Hsc70结合并抑制Reaper诱导的caspase激活，但ΔC和野生型Scyther蛋白与Reaper的结合程度相似（图6C） ●●●●。此外，Scythe的BAG结构域似乎足以发挥这些作用，因为GST蛋白融合到从Scyther（Scythe-BAG）分离的BAG区域（Scyther-BAGc（c）释放（图6A和B）。这些数据表明，Hsc70结合和抑制Hsc70/Hsp70介导的蛋白折叠所需的BAG结构域也需要用于Reaper对内源性Scythe释放的凋亡诱导因子的有效再探索。

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图6。BAG-缺陷的人镰刀无法保护其免受Reaper诱导的凋亡。(A类)将重组Reaper（Rpr）蛋白（300 ng/µl）添加到爪蟾鸡蛋提取物与等量的重组全长人镰刀菌（FL hScythe）、BAG-缺陷人镰刀虫（ΔC hScyther）或人类镰刀菌的BAG结构域（Scythe-BAG）结合。在指定的时间，通过裂解人工半胱天冬酶底物DEVD-pNA，分析2µl等分提取物的半胱天蛋白酶活性。在卵裂后，用分光光度法测量释放的pNA。(B类)样品按照（A）进行处理，但15µl小份样品通过0.1µM微过滤器过滤，以去除颗粒成分，包括线粒体，并使用抗细胞色素对样品进行免疫印迹处理c（c）单克隆抗体。(C类)将固定在谷胱甘肽-Sepharose珠上的重组GST或GST-Reaper融合蛋白添加到爪蟾鸡蛋提取物，并在4°C下与等量的His-tagged全长人类Scythe（FL hScytthe）或BAG-deficient Scyther（ΔC hScythe）蛋白孵育。1小时后，将珠粒化，用ELB洗涤三次，再悬浮在SDS样品缓冲液中，并使用单克隆五氢抗体进行免疫印迹处理。

讨论

Scythe是一种Reaper-interacting蛋白，对Reaper诱导的细胞凋亡至关重要爪蟾鸡蛋提取物。在本报告中，我们证明Scythe也是Hsc70/Hsp70的调节剂，能够抑制伴侣介导的蛋白质折叠。收割者反过来会抑制镰刀的这种活动。这些发现提出了一种有趣的可能性，即蛋白质折叠的调节在Reaper控制细胞凋亡中起着重要作用。

镰刀菌介导的Hsp70阻遏的收割者逆转

虽然BAG-1先前被证明抑制Hsp70功能，但推测有一种配体能够与BAG-1–Hsp70–底物复合物结合，解离BAG-1并允许恢复蛋白质折叠(比姆斯顿等., 1998). 显然，如果BAG-1或类似分子被认为是蛋白质稳态的可行调节因子，那么Hsp70的抑制必须是可逆的。在本报告中，我们已经确定Reaper是一种能够逆转Scythe介导的Hsp70抑制的配体。与此相反，根据最初为BAG-1提出的假设方案，Scythe从Hsp70中被替换。有趣的是，收割者在一个不同于BAG结构域的位点（Scythe的235和312氨基酸之间）与Scythee结合；因此，Hsc70从Scythe的位移不是Reaper与同一位点竞争结合的结果（C.Holley、K.Thress和S.Kornbluth，未发表的观察结果）。相反，我们假设收割者促进Scythe的构象变化，导致Hsp70的分离。

Scythe–Hsp70与凋亡调节

Scythe介导的抑制Hsp70蛋白折叠与Scythe/Reaper调节细胞凋亡的能力如何相关？基于最初为BAG-1提议的模型（图7)我们假设细胞色素c（c）-Scythe隔离的释放因子（图中表示为“X”7)通过与Hsc70–Scythe复合物结合，保持在可溶的部分折叠状态。虽然我们还不知道细胞色素是否c（c）-释放因子与Scythe和Hsp70直接接触，与BAG-1一样，Scythe-结合到Hsp70的ATP酶域（图2F） ，使得Hsp70的底物结合域可能用于结合“X”或类似分子。此外，如果Scythe的机械功能与BAG-1相似，则Hsc70/Hsp70和“X”之间的接触可能是直接的。与收割者结合后，Scythe–Hsp70复合物离解；根据我们的模型，Hsp70因此解除了其抑制作用，然后继续折叠“X”，导致细胞色素c（c）释放、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活等。

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图7。收割器/镰刀功能模型。BAG-1与Hsp70的ATP酶结构域结合，并抑制其介导蛋白质折叠的能力。在假设的配体存在下，BAG-1从Hsp70中释放，促进天然底物的释放。就Scythe而言，我们假设发生了类似的一系列事件；然而，Reaper作为配体触发Scythe从Hsp70复合物中分离。根据这个推测模型，“X”以其天然形式释放，然后可以触发线粒体细胞色素c（c）释放和caspase激活。该图改编自Bimston等人（1998年）.

表面上，Hsc70似乎符合“X”本身的描述，即与Scythe结合并通过添加Reaper而解离的蛋白质。然而，多次实验都未能发现任何直接的细胞色素c（c）-重组Hsc70蛋白的释放活性（数据未显示）。考虑到细胞中Hsp70家族成员的丰富性，这并不奇怪。尽管如此，Scythe与Hsc70相互作用的能力似乎对其隔离细胞色素的能力很重要c（c）-释放因子；能够与Reaper相互作用的Scythe分子（数据未显示），但缺乏BAG结构域，在阻止Reaper诱导的细胞凋亡方面不能像过度野生型Scyther一样发挥作用。

虽然我们还没有确定Scythe相关的细胞色素c（c）-释放因子，迄今为止唯一被证明具有直接细胞色素的因子c（c）-释放活性是bcl-2家族的促凋亡成员(Desagher等人，1999年;Gross等人，1999年;清水等，1999年). 一些观察结果支持“X”可能确实是bcl-2家族成员。首先，细胞色素c（c）-Scythe释放的“X”的释放活性可以通过与重组bcl-xL孵育而消除，重组bcl-X L是一种抗凋亡的bcl-2家族成员，可以通过与其促凋亡对应物的异二聚体作用(查等人，1997年). 其次，我们最近在Scythe的C末端发现了一个相对保守的BH3结构域（M.Olson和S.Kornbluth，未发表的观察结果）。BH结构域（类bcl-2异二聚体结构域），其中有四种类型（BH1–伯克希尔哈撒韦4)，是否显示相邻序列对bcl-2家族成员的关联至关重要（参见Gross等人，1999年). 虽然含BH3的蛋白质本身可能是细胞色素c（c）-释放因子，单是Scythe似乎没有这种活性。因此，我们推测Scythe的BH3结构域是异源二聚体促凋亡bcl-2家族成员的对接位点。目前正在调查这种可能性。然而，由于bcl-2家族成员可能会形成更高阶的多聚体（例如，用于线粒体膜孔的形成），在这种情况下，结合Scythe-bound Hsc70的作用可能是组装更高阶复合物，而不是正确折叠单体“X”(亚当斯和科里，1998年;Lewis等人，1998年).

尽管我们的研究迄今仅限于分析果蝇属脊椎动物系统中的蛋白质（收割者）(爪蟾鸡蛋提取物），我们注意到Scythe及其BAG结构域的功能可能最终证明在苍蝇凋亡的背景下很重要。正如最近所述果蝇属基因组包含一个明显的Scythe同源物(Adams等人，2000年;Jasny，2000年). 此外，在初步研究中，我们发现在体外翻译的飞镰刀可以绑定到飞收割者（K.Thress和S.Kornbluth，未出版）。

通过调节Hsp70/Hsc70调节细胞信号

虽然Hsp70家族伴侣在细胞中大量存在，但BAG-1和Scythe等蛋白质可能赋予这些蛋白质底物特异性，以调节的方式促进蛋白质折叠/结合底物的组装。与Scythe/BAG样蛋白结合的Hsc70底物处于非活性或螯合状态，可以通过结合能够解离Scythe–Hsc70或BAG-1–Hsc70复合物的特异性配体来严格控制。Reaper能够逆转Scythe介导的对Hsp70蛋白折叠的抑制，而对BAG-1的类似抑制没有影响，这一事实突显了这些反应具有必要的特异性。如前所述，BAG-1结合许多细胞信号分子；目前尚不清楚Scythe在其结合伙伴中是否具有类似的多样性。此外，尚不清楚不同的配体是否对不同的BAG底物或Scythe底物复合物有不同的影响。尽管如此，以Reaper–Scythe–Hsc70为例的配体-共伴侣-Hsc70蛋白的调节网络为调节细胞增殖、细胞死亡或细胞应激反应关键的细胞信号分子的活性提供了一种新的方法。

材料和方法

爪蟾卵提取物的制备

为了诱导产卵，向成熟雌蛙注射100U孕马血清促性腺激素（PMSG）（Calbiochem）以诱导卵母细胞成熟，然后注射（3–28天后）人绒毛膜促性腺激素（HCG；USB）。在注射HCG后14至20小时，收获鸡蛋用于提取物生产。用pH值为7.8的2%半胱氨酸孵育，去除鸡蛋中的果冻外壳，并在改良的林格斯溶液（1 M NaCl、20 mM KCl、10 mM MgSO）中洗涤三次4，25 mM氯化钙2，5 mM HEPES pH 7.8，0.8 mM EDTA），然后在ELB中清洗[250 mM蔗糖，2.5 mM MgCl2，1.0 mM二硫苏糖醇（DTT），50 mM KCl，10 mM HEPES pH 7.4]。鸡蛋在400下通过低速离心进行包装克在添加抑肽酶和亮氨酸蛋白酶（最终浓度为5µg/ml）、细胞松弛素B（最终浓度5µg/ml）和环己酰亚胺（最终浓度50µg/ml）后，鸡蛋在10 000℃下离心溶解克15分钟。对于核形成，用去膜精子染色质（1000核/µl）和ATP再生系统（10 mM磷酸肌酸、2 mM ATP和50 mg/ml磷酸肌酸激酶）补充提取物。添加到提取物中的重组蛋白在XB缓冲液中稀释（50 mM蔗糖、100 mM KCl、0.1 mM CaCl2，1 mM氯化镁2，10 mM K–HEPES pH 7.7），并以300 ng/µl的浓度添加，除非另有说明。

GST融合蛋白的制备

全长爪蟾用5′-GATCTCTAGACATGTAAGGGACCAGCAGT-3′和5′-GACCTCGAGTAGTCAACCTCAATAGT-3′引物对Hsc70进行PCR扩增。PCR片段被克隆到Xba公司I–Xho公司表达载体Gex KG的I位点，Gex 2T（Pharmacia）的一种衍生物，包含额外的多连接子位点和聚甘氨酸插入物，并转化为Topp 1细菌菌株（Stratagene）。如前所述生产重组蛋白(Evans等人，1997年). 全长果蝇属与GST融合的镰刀菌（镰刀菌C312）的收割者和C末端312氨基酸以类似的方式产生，并按照Thress等人（1998年）如前所述，产生了人类BAG-1和Hsp70的GST融合物(Bimston等人，1998年).

人类镰刀菌蛋白的杆状病毒生产

用PCR扩增出全长人Scythe（FL-hScyther）和一个缺失C-末端81氨基酸的截短人Scythone（hScythe-ΔC），以获得C-末端His6标记并克隆到Xba公司I–Xho公司pFastBac载体的I位点。使用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统（Gibco）生产蛋白质。简言之，得到的hScythe-pFastBac供体质粒被转化为DH10Bac大肠杆菌细胞。大肠杆菌培养含有重组bacmid的细菌，并使用标准miniprep方案回收重组bacmid-DNA。使用CellFECTIN试剂（Gibco）将杆状病毒DNA转染SF-9昆虫细胞，在27°C下孵育48 h，然后收获重组杆状病毒颗粒。随后，SF-9细胞（2×106细胞/ml）用杆状病毒感染48小时，在磷酸盐缓冲盐水中洗涤两次，并通过在HBS中的双重均化裂解[10 mM HEPES pH 7.5，20 mMβ-甘油磷酸，150 mM NaCl，5 mM EGTA，0.1%Triton X-100，1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）和10µg/ml蛋白肽抑制素、糜蛋白酶抑制素和亮蛋白肽]。然后将赖氨酸盐在4°C下以10000r.p.m.离心10分钟，并将上清液与1ml Ni-NTA琼脂糖（Qiagen）在4°C下孵育30分钟。用50 vols的HBS清洗珠子，并用含200 mM咪唑的HBS洗脱五个组分，每个组分500µl。

细胞培养和转染

对FL hScythe、缺失N端87个氨基酸（hScytherΔN）或hScythΔC的hScytthe进行PCR扩增，并克隆到含有框架内C端myc标记的改良pcDNA3.1哺乳动物表达载体（Invitrogen）中。293T细胞保存在添加10%胎牛血清（Sigma）的Dulbecco改良Eagle's培养基中。电池（5×105)按照制造商的说明，将其置于60 mm的培养皿上，24小时后使用Fugene转染试剂（罗氏生化试剂）转染3µg适当的myc标记的hScythe构建物或仅载体DNA。

免疫沉淀

转染后36小时，在裂解缓冲液中收集细胞（10 mM Tris pH 7.5，50 mM NaCl，5 mM EDTA，1 mM PMSF，2%吐温-20，10%甘油），并将裂解液与抗myc单克隆抗体（Santa Cruz）在4°C下孵育2小时。将PAS珠添加到裂解液中，再培养1 h，造粒并在裂解缓冲液中洗涤三次。结合蛋白用样品缓冲液溶解并通过SDS-PAGE进行解析。将解析的蛋白质转移到PVDF中，用抗Hsp70/Hsc70单克隆抗体（亲和生物试剂）进行印迹，用HRP连接的山羊抗小鼠二级抗体进行培养，并使用ECL系统（Amersham）进行检测。

蛋白质重折叠分析

如前所述进行蛋白质复性分析(弗里曼等., 1996).

DEVDase分析

为了测量半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性，将每个样品的3µl与90µl分析缓冲液（50 mM HEPES pH 7.5，100 mM NaCl，0.1%CHAPS，10 mM DTT，1 mM EDTA，10%甘油）和比色底物Ac-DEVD-pNA（最终浓度200 mM；Biomol caspase-3分析系统）在37°C下培养。在不同的时间点，在LabSystems MultiSkan MS微量滴定板阅读器中在405 nm处测量吸光度。

致谢

感谢D.Lew对手稿的批判性阅读。这项工作得到了NIH对S.K.（ROI GM56518和ROI GM61919）的资助，R.I.M.S.K.是白血病和淋巴瘤协会的学者。

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文章来自欧洲分子生物学组织由以下人员提供自然出版集团