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EMBO J。2001年4月2日；20(7): 1774–1784.
数字对象标识：10.1093/emboj/20.7.1774
预防性维修识别码：项目经理145463
PMID：11285240

核因子TDP-43和SR蛋白促进在体外和体内CFTR第9外显子跳跃

伊曼纽尔·布拉蒂,1 蒂洛·德克,2 伊丽莎白·祖卡托,1 弗朗科·帕加尼,1 毛里齐奥·罗曼诺,1,三和弗朗西斯科·巴拉勒1,4
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

人类囊性纤维化跨膜电导调节器（CFTR）第9外显子的选择性剪接受以下因素的联合调节顺式-作用元件分布于外显子和两侧的内含子（IVS8和IVS9）。一些研究已经在IVS8内含子3′剪接位点中确定了一个由多态性（TG）m（T）n重复序列组成的调控元件。目前，还没有发现识别这种元素的细胞因子。我们已经确定了TDP-43，一种以前没有描述过与RNA结合的核蛋白，是与（TG）m序列特异结合的因子。Hep3B细胞中短暂的TDP-43过表达导致外显子9跳跃的增加。伴随着SR蛋白的过度表达，这种效应更加明显。内源性TDP-43表达的反义抑制导致外显子9的内含物增加，为纠正CF患者外显子九的异常剪接提供了新的治疗靶点。该发现的临床和生物学相关性体内我们对一名携带TG10T9（ΔF508）/TG13T3（wt）基因型的CF患者的特征分析表明，该基因型导致了高比例的外显子9跳跃。

关键词：选择性剪接/CFTR外显子9/囊性纤维化/SF2/ASF/TDP-43

引言

囊性纤维化跨膜传导调节蛋白（CFTR）编码基因的RNA剪接突变已被描述为导致肺、汗腺、生殖道、肠道和胰腺等多个器官功能障碍，从而产生复杂的CF症状(威尔士的等., 1995). CFTR突变也可能与多种孤立的临床症状有关，如先天性双侧输精管缺如（CBAVD）(奇隆等., 1995;德克等., 1997)、鼻息肉病(欧文等., 1997)，支气管扩张(皮尼亚蒂等., 1995;吉罗东等., 1997)、支气管肺过敏性曲霉病(Cockrill和Hales，1999年)或特发性胰腺炎(科恩等., 1998;共享者等., 1998). 特别是，CBAVD的发生与编码mRNA的外显子9通过异常的选择性剪接过程丢失后产生的非活性CFTR蛋白有关(德拉尼等., 1993;强大等1993年).

因此，一些遗传学研究旨在确定顺式-人类CFTR基因第9外显子附近的作用元件可能解释了这种不寻常的剪接过程。到目前为止确定的元件（图1A） 包括一个（TG）m（T）n多态性元件、最近在IVS9中发现的内含子剪接沉默子（ISS）以及两个外显子9增强子和沉默元件(Pagani等人，2000年). 最初，位于IVS8的3′剪接位点内的（T）n多态性位点的变异是与第9外显子剪接可变效率相关的第一个因素(Chu等人，1991年). 男性不育患者中T5等位基因的高比例（由梗阻性无精子症引起，如CBAVD）代表了特定多态性的发生与相关临床症状之间的一种更好的特征相关性(Chu等人，1993年;Chillon等人，1995年;Mak等人，1997年;Rave-Harel等人，1997年;Teng等人，1997年;Cuppens等人，1998年;Larriba等人，1998年). 尽管如此，T5等位基因效应具有部分外显率，因此有可能找到健康的纯合子携带者。最近，发现位于（T）n束上游的第二个基于（TG）m重复序列的多态性位点（在人类中为9到13个重复序列）影响外显子9剪接的效率(Cuppens等人，1998年). 特别是，来自CBAVD患者的T5 CFTR基因携带大量TG重复，而来自健康父亲的T5 CFR基因携带少量TG重复(Cuppens等人，1998年)表明该元素可能在T5等位基因的部分外显率中起作用。在之前的研究中，我们使用微基因系统具体分析了这两种基因的影响顺式-外显子9剪接的作用元件，我们的结果证实了（TG）m和（T）n重复序列相互协调工作(Niksic等人，1999年). 此外，携带TG13T3基因型的CF患者的鉴定和特征（在本研究中）表明，（TG）m（T）n变异不仅与CF的单症状形式有关，而且其极端变异也可能与胰腺充血性CF有关。因此，识别最终与这些元素结合的细胞因子是理解外显子9剪接复杂调控的关键一步。在本研究中，我们鉴定了HIV-1 TAR DNA结合蛋白（TDP-43）(Ou等人，1995年)作为一种与CFTR外显子9前体mRNA中TG元件结合的新因子，能够调节CFTR第9外显子选择性剪接。最重要的是，内源性TDP-43的反义抑制导致外显子9内含子上调，为纠正CF患者外显子九的异常剪接提供了新的治疗靶点。

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图1。(A类)影响CFTR外显子9剪接的内含子和外显子元件的示意图：IVS8中的（TG）m和（T）n多态性区域，IVS9中的内含子剪接沉默子（ISS），以及外显子增强子（E）和沉默子（S）序列。(B类)所用质粒的示意图表示：野生型（11ug/7u）和选择性删除（TG）m和/或（T）n重复序列（Δug/Δu）、（11ug/△u）和（Δu/7u）的突变体。(C类)使用HeLa核提取物与线性化的所有四种结构的均匀标记RNA进行UV交联分析Hin公司d三。箭头指示50–52 kDa复合体的位置。

结果

与第9外显子（TG）m元件结合的细胞蛋白的鉴定

为了鉴定与（TG）m和（T）n序列结合的细胞因子，我们制备了如图所示的质粒1B.野生型质粒包含CFTR第9外显子序列、剪接连接和部分带有TG11和T7重复序列的侧翼内含子（11ug/7u）。我们还制备了三个突变序列，其中我们依次删除了两个重复序列（Δug/Δu）、T7重复序列（11ug/△u）和TG11重复序列（△ug/7u）。这些配置先前在瞬时转染系统中显示，以提供不同比例的外显子9（+）和9（-）转录物（表我) (Niksic等人，1999年). 结构被转录在体外在以下人员在场的情况下[32P] 然后在具有HeLa核提取物的UV交联测定中使用UTP和等量的标记转录物。图1C表明，在可与标记RNA交联的众多蛋白质中，仅在含有（TG）m重复序列（11ug/7u和11ug/Δu）的RNA中观察到50–52 kDa近似分子量复合物，而在没有该序列的RNA中则无法观察到（Δug/7u与Δug/△u）。通过竞争实验测试了这种相互作用的特异性。正如预期的那样，通过增加冷11ug/7u和11ug/Δu RNA的数量，而不是等量的未标记Δug/7u及Δug/Δ的RNA，50-52 kDa复合物可以很容易地与标记的11ug/7uRNA竞争（图2A） ●●●●。此外，当我们使用来自小鼠CFTR序列的同源RNA转录物时，没有观察到竞争（图2B和C）。这一观察结果与小鼠基因组序列不包含（ug）11或（u）7重复序列(Niksic等人，1999年).

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图2。(A类)在HeLa核提取物存在的情况下，将冷11ug/7u、Δug/Δu、11ug/△u和Δug/7u RNA添加到标记的（11ug/7u）RNA后的竞争分析。冷/标记RNA的摩尔比为2、5和10。(B类)人体（11ug/7u）和小鼠（mEx9）构造的示意图。(C类)添加冷RNA后，使用标记的11ug/7u RNA与HeLa核提取物孵育进行竞争分析：11ug/7uRNA和通过切割mEx9合成的两个RNA生态RI（mEx9EcoRI）和Hin公司dIII（mEx9HindIII）。冷/标记RNA的摩尔比为2、5和10。箭头表示50–52 kDa复合体。

表一。

携带不同（TG）m（T）n构型的微小基因mRNA第9外显子排除率
（TG）m（T）n小基因构型%外显子9排除
TG11T7型10
TG11ΔT100
ΔTGT70
ΔTGΔT0

（微克）米重复序列对于获得50-52kDa复合物的结合既必要又充分

（ug）的标识米重复序列作为结合该复合物的必要和充分的靶序列，使用非常短的（ug）进行测试12顺序。图三A表示冷（ug）12RNA可以特异性地竞争标记为11ug/7u的50-52kDa复合物，而感冒（ucuu）三含有载脂蛋白AI基因组成性剪接第二外显子3′剪接位点的多嘧啶序列的RNA不能。事实上，该控制RNA不能结合50–52 kDa复合物，这表明该复合物通常不被聚嘧啶序列检测到。必须对这种可能性进行研究，因为载脂蛋白AII基因上下文中的（ug）重复序列在功能上似乎与连续的多嘧啶区等效(雪莱和巴拉勒，1987年)并可以促进分支点选择(柯立芝等., 1997). 此外，如果我们考虑该蛋白的表观分子量，其特性的一个可能候选可能是多嘧啶道结合蛋白（PTB），这是一个众所周知的剪接因子(穆利根等1992年). 然而，这种可能性也可能被排除在外，因为50–52 kDa复合体没有与（ucuu）竞争三RNA，包含三个（ucuu）基序，是PTB结合的首选SELEX结合基序(辛格等., 1995).

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图3。(A类)两种短竞争RNA的影响，（ug）12和（ucuu）三在存在HeLa核提取物和标记的11ug/7u RNA的情况下进行UV交联分析。冷/标记RNA的摩尔比为3、8和17。(B类)标记短（ug）的结果12RNA和在HeLa核提取物和冷（ug）存在下进行UV交联12和（ucuuu）三RNA。冷/标记RNA的摩尔比为2和5。箭头表示50–52 kDa复合体。

最后，图三B表明标记的RNA仅由（ug）组成12能够结合50–52 kDa复合物，该复合物具有与11ug/7u RNA结合的复合物相同的结合特性[即可以与冷（ug）竞争12RNA，但不是通过冷（ucuu）三RNA]。

TDP-43作为与（ug）重复序列特异结合的核因子的鉴定

为了鉴定与含有（ug）重复基序的RNA特异结合的蛋白质，我们建立了一个亲和纯化程序，该程序涉及合成（ug12RNA合成己二酸脱氢琼脂糖珠。作为对照，使用富含聚嘧啶序列（ucuu）衍生的第二种珠子三已使用。两种类型的珠子分别与HeLa核提取物孵育，结合的蛋白质在SDS-PAGE凝胶上进行分析，并用考马斯蓝染色。（ug）结合模式的比较12-和（ucuu）三-衍生珠（图4A） 表明这两种图案有许多共同的条带，还有一些（ug）12-和（ucuu）三-特定波段。特别是，在与50–52 kDa复合物相容的分子量范围内，43 kDa蛋白被（ug）特异性地拉低12RNA，但不是通过（ucuu）三RNA。另一方面，57kDa蛋白双链被（ucuu）特异性地拉下三RNA，与预期PTB分子量完全一致(吉尔等., 1991). 对切除的43 kDa带进行内部序列分析，得到一个17肽，在DDBJ/EMBL/GenBank数据库中搜索发现其序列与TDP-43的362-378残基完全相同(欧点等., 1995)，一种最初被报道与HIV-1 TAR DNA序列基序结合并抑制HIV-1转录的细胞蛋白，但尚未被报道与RNA结合。尽管如此，两个RNA识别基序（残基106-175和193-257）的存在证明了TDP-43可能与RNA结合的事实。

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图4。(A类)用（ug）衍生的己二酸脱氢叠氮微球进行下拉试验的结果（考马斯蓝染色）12和（ucuu）三HeLa核提取物孵育后的RNA。在距（ug）的车道上12-衍生珠-箭头表示（ucuu）通道中缺失的43kDa蛋白带三-衍生珠。右边的箭头表示（ucuu）中存在的57 kDa双绞线三与（ug）相对的车道12车道。(B类)TDP-43的完整氨基酸序列，开盒对应于切除的43 kDa带的测序肽。粗体和下划线序列突出了两个RRM共识主题。(C类)（左面板）纯化的重组蛋白及其与标记（ug）的反应性12紫外线交联分析中的RNA（右侧面板）。(D类)GST-TDP-43重组蛋白与标记的11ug/7u、Δug/7u和Δug/Δu RNA的反应性。

TDP-43作为GST融合蛋白的表达

为了验证TDP-43与（ug）的特定结合12我们扩增并插入其完整编码序列作为谷胱甘肽秒-用于细菌表达的pGEX-3X表达载体中的转移酶（GST）融合蛋白。图4C、 左侧面板显示亲合纯化的GST–TDP-43融合蛋白，预期分子量为70kDa。图4C、 右侧面板显示GST–TDP-43能够结合标记的（ug）12RNA和GST蛋白不能单独检测到结合。这种重组蛋白结合（ug）11然后使用11ug/7u、Δug/7u和Δug/Δu标记的RNA分析CF第9外显子上下文中的重复序列。图4D显示GST–TDP-43与使用HeLa核提取物获得的50–52 kDa复合物具有相同的结合模式（如图所示1C） ●●●●。

50-52 kDa复合物由TDP-43与RNA结合形成

50-52 kDa复合物和TDP-43之间的明显分子量差异最初通过使用涂有多克隆抗TDP-43血清的琼脂糖A/G珠进行免疫缺失分析来解决。在进行UV交联分析之前，我们使用这些珠子从总HeLa核提取物中免疫贫化TDP-43。HeLa核提取物中TDP-43的耗尽导致50-52 kDa复合物的消失（图5A、 上面板），并且在耗尽步骤后执行的蛋白质印迹表明TDP-43有效地从核提取物中去除（图5A、 下部面板）。然后，我们使用抗TDP-43抗血清及其预免疫血清作为对照进行免疫沉淀实验。图5B表明，在与标记的11ug/7u RNA的核提取物（但不是来自Δug/Δu对照）进行UV交联后，50–52 kDa条带可以被抗TDP-43抗血清特异性免疫沉淀。应该注意的是，除了50–52 kDa复合体外，还可以观察到微弱的额外45 kDa带。有趣的是，该条带的出现取决于紫外线交联分析中使用的HeLa核提取物的数量（图5C） 随着核提取物含量的增加，这一现象变得越来越明显。数据如图所示5C可能表明我们正在检测由TDP-43和一个仍然没有特征化的50-52 kDa蛋白质组成的蛋白质复合物。或者，这一发现可能表明，RNase切割RNA-蛋白质复合物的效率根据与（TG）m基序结合的TDP-43的量而变化。事实上，之前有报道称，RNase处理紫外线交联RNA–蛋白质复合物会使可变数量的残余核苷酸与蛋白质结合，从而改变其分子量。例如，紫外交联后的分子量变化是SR蛋白家族几个成员的共同特征(拉姆查泰辛等., 1995)被认为是在紫外线交联后不可逆地结合RNA，并保护其大部分延伸部分免受核糖核酸酶降解。间接证据如图所示5在D中，向总核提取物中添加越来越多的重组GST–TDP-43融合蛋白可以有效竞争50–52 kDa复合物与标记的11ug/7u RNA的结合。重要的是要注意，添加GST–TDP-43不会竞争其他蛋白，结果表明，尽管没有正式证据，但50-52kDa复合体中含有TDP-43。

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图5。(A类)（上面板）标记的11ug/7u RNA在18µg HeLa核提取物（NE）和18µgTDP-43免疫缺失核提取物（NE-TDP-43）存在下的反应性。（下面板）证明TDP-43发生免疫耗竭的western blot分析。(B类)使用抗TDP-43血清（及其免疫前血清作为对照）在与18µg核提取物UV交联的11ug/7u和Δug/Δu标记RNA上进行免疫沉淀实验。(C类)标记的11ug/7u RNA与越来越多的核提取物进行紫外线交联后的免疫沉淀。箭头表示50–52 kDa免疫沉淀产物，星号表示第二条免疫沉淀带。(D类)紫外线交联标记的11ug/7u RNA与GST–TDP-43单独作用（50 ng），与核提取物单独作用（18µg），核提取物与GST-TDP-43的增加量混合作用（分别为10、25和50 ng）。50–52 kDa复合物和GST–TDP-43蛋白用箭头表示。(E类)重组GST–TDP-43（101–261）的示意图（顶部），其表达和纯化（左侧面板），及其与合成5′末端标记（ug）的反应性12经过（+）和（-）RNase处理的紫外线交联后的RNA（右面板）。在第三条车道（–/+），这两条车道混合在一起，并在同一条车道上装载。只有10%的未处理样本装载在（–）和（–/+）车道上。（+）车道中标记材料的数量较低是由于合成物（ug）标记5′端的损失12RNase消化后。

为了直接测试残余RNA结合对TDP-43迁移的影响，我们表达了43 kDa TDP-43重组变异体GST-TDP-43（101–261），以促进迁移转移的可视化（图5E、 顶部和左侧面板）。然后使用合成的5′末端标记（ug）进行UV交联分析12存在或不存在RNase处理的RNA寡聚物。结果表明，考马斯染色中的43kDa重组蛋白（图5E、 当它与核糖核苷酸不可逆结合时，在50–52 kDa范围内迁移（图5E、 右侧面板）。RNase处理后，部分向低分子量转移（图5E、 右面板），尽管它从未达到最初的43 kDa。在负（–）和正（+）泳道中装载的样品（–/+）的混合最终表明，核糖核酸酶消化有一个极限产物，小于50–52 kDa的范围，但高于原始的43 kDa蛋白[并且与（ug）左右的序列兼容8完全防止核糖核酸酶消化]。应注意，合成5′末端标记（ug）12我们只能看到5′端受到保护的分子。这些实验为紫外交联分析后TDP-43在50–52 kDa范围内的显著分子量变化提供了直接的功能证据。

转染试验中TDP-43和SF2/ASF的过度表达导致CFTR第9外显子跳跃

评估TDP-43–（ug）的功能重要性米在CFTR外显子9选择性剪接的相互作用下，用不同的CFTR第9外显子杂交微基因变体转染Hep3B细胞。图6A显示了在内含子8-外显子9连接处用不同多态重复序列制备的杂交小基因的示意图。几种变体，包括在胰腺充血性CF患者中发现的TG13T3等位基因（见下文），与编码TDP-43或剪接因子SF2/ASF的质粒在Hep3B细胞中同时共转染，此前已证明这种质粒可诱导CFTR外显子9跳跃(尼西姆-拉菲尼亚等., 2000;帕加尼等., 2000)或两者兼而有之。图6B、 左面板显示，外显子9排除的比例严格依赖于多态性位点的组成，与（TG）m多态性数直接相关，与（T）n多态性数反向相关。事实上，在没有过表达因子的情况下，高（TG）m重复出现了最高水平的外显子排除，范围从55%（TG11T3）到86%（TG13T3）。最重要的是，TDP-43的过度表达导致所有四种测试变体中CFTR外显子9（–）mRNA的数量增加。为了更好地定义CFTR外显子9的调控，我们还共同表达了SF2/ASF，它结合到内含子9的不同区域，即ISS(帕加尼等., 2000). SF2/ASF和TDP-43与表现出最低外显子排除率（TG11T5）的杂交小基因的过度表达导致抑制作用增强，表明这两个因子在外显子两侧的结合具有加性效应。由于第9外显子排除率高，无法检测到任何显著的加性效应，因此未与其他微基因进行共转染。作为对照，我们还对含有纤维连接蛋白EDA外显子的杂交小基因进行了联合转染实验(穆罗等., 1999)以及CFTR和TDP-43或SF2/ASF构造。结果（图6B、 右面板）显示，TDP-43没有影响EDA外显子的剪接模式[缺乏任何（TG）m结构]，而SF2/ASF如前所述，产生了EDA外隐子内含物的增加(克拉默等., 1999). 最后，TDP-43和TG13T5小基因数量增加的联合转染证实，外显子9内含物的抑制作用遵循剂量依赖曲线，考虑到基础排斥的高水平，在3和5µg数据点上具有统计学意义（图6C） ●●●●。值得注意的是，大量的TG和少量的Ts导致外显子9（+）和9（-）形式之间出现额外的条带（图6B、 用箭头表示）。该条带的序列分析表明，它是由位于外显子9的一个隐秘AG受体位点产生的。该产品从未在健康人中报告过，也未在T5患者或T3等位基因患者的淋巴母细胞中检测到（见下文）。它的缺失可能是由于小基因结构的独特序列背景造成的，但尚不能排除其在CF患者某些受影响组织中的最终存在。

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图6。(A类)杂交小基因hCF-（TG）m（T）n的示意图。最小α-珠蛋白启动子和SV40增强子由5′端的小箭头指示，多态性位点（TG）m（T）n由灰色圆圈指示，α-珠蛋白、纤连蛋白EDB和人CFTR外显子分别由黑色、阴影和白色方框指示。RT-PCR分析中使用的引物由叠加箭头指示。(B类)左面板，在存在过度表达TDP-43或SF2/ASF的质粒的情况下，选择的小基因变体的表达。外显子9的阳性（+）和阴性（-）带显示出来。箭头表示来自隐秘的3′剪接位点的异常剪接产物。下图中报告了单独或在SF2/ASF（500 ng）、TDP-43（3µg）或两者同时存在的情况下，每个构造的外显子排除百分比。右面板，TDP-43和SF2/ASF过度表达对纤维连接蛋白EDA外显子的影响。(C类)左面板，TG13T5小基因上TDP-43（0.5–5µg转染质粒）数量增加时，第9外显子排除的剂量-反应曲线。以重复形式进行的四个独立转染实验的平均值显示为标准误差（右侧面板）。星号表示统计显著性(P（P）<0.05). M、 分子量标记（1kb）。

针对TDP-43 mRNA的反义寡核苷酸瞬时转染诱导CFTR第9外显子内含

通过western blotting（未显示）测试的不同细胞系中发现的高水平内源性TDP-43可能是过度表达TDP-43对CFTR选择性剪接影响低的原因。测试其功能的另一种方法是通过在TDP-43序列的不同区域设计几个反义硫代磷酸（PS）寡核苷酸来抑制TDP-43的表达（图7A） ●●●●。然后将PS-oligos与TG13T5小基因一起转染到Hep3B中。结果显示，三个寡核苷酸（TIO86、TIO155、TIO1318）的最终微基因转录本中，第9外显子内含物持续显著增加，而当我们使用对照寡核苷酸FN56时，未观察到外显子9内含物和/或TDP-43内源性水平的变化（图7B） ●●●●。有趣的是，最有效的PS-oligos是TIO155和TIO1318，它们被设计为包含一个与GGGA基序互补的序列，最近被认为比其他位点更容易被反义寡核苷酸所利用(图等., 1998). TIO1318的剂量-反应分析表明，抑制作用取决于寡聚物浓度，并且根据western blot分析，TDP-43内源性水平伴随逐渐降低（图7C、 上下面板）。

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图7。转染TG13T5小基因的Hep3B细胞中TDP-43的反义抑制。(A类)使用了四个PS-寡脱氧核苷酸（TIO7、TIO86、TIO155和TIO1318）的示意图。用3µg TG13T5小基因和每个PS或对照寡核苷酸（FN56）以1µM的最终浓度共同转染Hep3B细胞(B类，左侧面板）。还包括TG13T3对照（pRc/CMV）。报告了外显子9内含物水平（右侧面板）。(C类)寡核苷酸TIO1318的剂量-反应曲线范围为0.1至5µM（上面板），以及内源性TDP-43水平的western blot（下面板）。

TDP-43和SF2/ASF mRNA在人体组织中的分布

通过northern印迹法对TDP-43在正常人体组织中的分布进行了详细分析。以前的研究表明，它在多种人体组织中表达(欧点等., 1995). 为了证实和扩展这一观察结果，我们对来自正常人体组织的样本使用了polyA（+）northern印迹。图8A（上部面板）显示，在所有存在的人体组织中都可以检测到特定的TDP-43转录物（2.8 kb）。获得了类似的结果（图8A、 中间面板），当我们使用特定探针检测SF2/ASF的3.0 kb转录本时(Ge公司等., 1991). 通过计算SF2/ASF和TDP-43信使核糖核酸与GAPDH水平的比值，试图对这些值进行归一化（图8A、 下部面板）。由于GAPDH水平的可变性（尤其是在心脏和胃肌肉中），定量显示SF2/ASF和TDP-43的相对表达水平在不同组织中有很大差异，如图所示8B.特别是，TDP-43和SF2/ASF在胰腺、胎盘、肺、生殖道和脾脏中的表达较高（除最后一个外，其他组织都是单症状CF和CBAVD中受影响最大的组织）。

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图8。(A类)对从16种不同人体组织中提取的mRNA进行TDP-43（上面板）、SF2/ASF（中面板）和GAPDH（下面板）的Northern blot分析。箭头表示TDP-43的主要2.8 kb mRNA物种特征和SF2/ASF的3.0 kb mRNA。(B类)标准化TDP-43 mRNA水平（黑框）和SF2/ASF水平（阴影框）的图形表示。

TG13T3极端多态性的体内意义

（T）n和（TG）m元件的多态性变异，特别是T5等位基因，与CF单症状形式的可变外显率有关(Chu等人，1993年;Chillon等人，1995年;Mak等人，1997年;Rave-Harel等人，1997年;Cuppens等人，1998年;Larriba等人，1998年)也可以调节其他CFTR基因突变的影响顺式(Kiesewetter等人，1993年). 由于TG13T3配置导致转染试验中外显子跳跃的比例特别高，因此确定与该等位基因相关的临床表型很有意思。事实上，对100名至少有一条非ΔF508染色体的德国CF患者进行突变筛查后，在一名19岁男性患者中发现了T3等位基因，该男性患有轻度CF，其特征是反复感染的肺部症状、汗液氯化物浓度升高和胰腺饱足。他的CFTR基因序列没有显示外显子突变和TG13T3（wt）元件的存在在trans中TG10T9（ΔF508）位于第二个等位基因上（图9A） ●●●●。对内含子8-外显子9连接处多态性变体和外显子10突变ΔF508的分离分析证明ΔF50 8和TG13T3位于不同的等位基因上（图9A） ，因为受影响的患者从父亲那里遗传了TG10T9（ΔF508）等位基因，从母亲那里遗传了TG13T3（wt）变异体，而健康的姐妹没有携带TG10T8（ΔF508）或TG13T3等位基因。在来自随机供体的另外100条非CF染色体中没有观察到TG13T3（wt）等位基因，这表明它代表了一种罕见的突变事件。通过分别位于外显子8和外显子11上的引物的RT-PCR扩增，评估了爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）转化的患者淋巴细胞中外显子9跳跃的比例（图9B） ●●●●。RT-PCR产物在变性聚丙烯酰胺凝胶上分离后的半定量分析表明，四个物种TG10T9（ΔF508），9（-）：TG13T39（-，表明杂合子患者中的T3等位基因允许其淋巴母细胞中约6%的正常剪接（这一结果与在体外转染）（图9C） ●●●●。在另一组实验中（未显示），患者的非ΔF508 cDNA使用外显子10内F508野生型序列特异的反向引物选择性扩增。两个等位基因特异性RT-PCR产物的定量证实，第9外显子跳跃占患者cDNA的96±3%。总之，这是迄今为止报道的自然发生的（TG）m（T）n变体的最高外显子跳过量，从而解释了该患者的CF表型。从TG11T7/TG10T7基因型个体建立的对照淋巴母细胞系在同一分析中显示18±1%的外显子9跳跃比例。

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图9。(A类)对一条染色体上携带TG13T3（wt）等位基因，另一条染色体携带TG10T9（ΔF508）构型的胰腺充血性CF患者进行家谱和测序分析。(B类)跨越CFTR cDNA外显子8–11的RT–PCR产物，从CF患者TG13T3突变和TG10T9（ΔF508）等位基因杂合子（通道1）和对照个体TG11T7和TG10T 7等位基因（通道2）杂合子中获得，在2%琼脂糖凝胶上分离。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后测定的两个等位基因的每个CFTR转录本中第9外显子排除的百分比如下所示。车道3，无模板；M、 1 kb标记。(C类)外显子9跳跃的半定量分析。使用ALF测序器在变性聚丙烯酰胺凝胶上分离CF患者（上部）、对照个体（中部）和阴性对照个体（下部）的RT-PCR产物。使用Fragment Manager软件量化荧光信号。峰1和3对应于TG10T9（ΔF508）等位基因的扩增9（–）和9（+）片段，而峰2和4对应于非ΔF50.8等位基因扩增9（-）和9。

讨论

在本研究中，我们报告了TDP-43的鉴定(Ou等人，1995年)作为反式-作用因子与人CFTR第9外显子3′剪接位点附近的（TG）m多态重复区结合并诱导外显子跳跃。这种细胞蛋白最初被描述为结合HIV-1 TAR DNA元件的富含多嘧啶的区域，并作为转录抑制剂发挥作用。TDP-43从未被描述为影响剪接过程，其确切的细胞功能仍然难以捉摸(Ou等人，1995年). 我们的分析表明，TDP-43参与了50–52 kDa复合物的形成，该复合物组装在CFTR外显子9的3′剪接位点的（TG）m元件上。转染实验中该蛋白的过度表达抑制了CFTR外显子9的剪接，并且随着（T）n重复数的减少，这种抑制作用变得更加明显，这一结果与先前关于（TG）m（T）n相互依赖性的研究一致(Niksic等人，1999年;Pagani等人，2000年). 相反，通过反义PS-寡脱氧核苷酸处理抑制培养细胞中TDP-43的表达会导致外显子9识别的增加。这一结果尤其重要，因为TDP-43可能是一些CF患者的新治疗靶点。

（TG）m序列和相邻（T）n多态性区域在调节人CFTR外显子9选择性剪接中的重要性一直是一些遗传学和分子研究的主题，因为这种特征多态性的某些等位基因与CF的单症状形式有明确的关联(Chu等人，1993年;Chillon等人，1995年;Rave-Harel等人，1997年;Cuppens等人，1998年). 考虑到第9外显子跳跃产生非功能性CFTR蛋白(Delaney等人，1993年;Strong等人，1993年)第8内含子3′端（TG）m重复序列的存在可能被认为是干扰CFTR前体mRNA成熟过程的干扰因素提示该区域的引入可能是一个更复杂事件的一部分，在进化过程的早期，该（TG）m元件与人类外显子9的3′剪接位点相邻(Rozmahel等人，1997年;哈萨克斯坦语和莫兰语，1998年). 为了支持这一假设，我们最近对小鼠外显子9两侧的小鼠内含子进行了测序，结果表明，它们缺少两个内含子调控元件，并且与人类内含子相比，长度也大不相同(Niksic等人，1999年). 本文的结果表明，（TG）m–TDP-43复合物对3′剪接位点的干扰影响可以通过长的聚嘧啶（T）n来消除，这可能会使（TG）m重复序列与3′剪接位点隔开。这个体内T5等位基因与某些临床实体（如梗阻性无精子症或轻度CF）的相关性表明，这种“掩盖效应”因T重复次数减少而加剧的重要性，这一研究报告强调了胰腺充血性CF患者TG13/T3（wt）等位基因的重要性。事实上，我们的在体外和体内研究表明，新的TG13T3等位基因导致迄今为止报道的自然发生（TG）m（T）n变异的外显子跳跃程度最大，足以解释该患者的CF表型。

考虑到TDP-43尚未具有特定的细胞功能，我们缺乏任何迹象表明TDP-43与剪接机制之间可能存在联系，而剪接机制在某些阶段一定会受到该蛋白的影响。考虑到（T）n区与（TG）m区的附近反式-可能受TDP-43影响的作用剪接因子是U2AF65(Valcarcel等人，1996年)已知其与3′剪接位点附近的多嘧啶束相互作用。现在，进一步的工作旨在澄清这个问题，以及（T）n区域的功能是否可以调节这种相互作用，为我们解释（TG）m和（T）n区域在外显子9剪接上的相互依赖性提供了可能的解释。

最后，对不同人体组织中TDP-43和SF2/ASF mRNAs水平的测量表明，这两种蛋白质在胰腺、肺和生殖道中都很丰富，这三个器官已知特别受CF影响。在这方面，值得注意的是，报道的SF2/ASF蛋白在大鼠组织中的分布也证实了其优先表达于胰腺、肺和生殖道(花村等., 1998). 事实上，在我们的瞬时转染系统中，SF2/ASF和TDP-43的过度表达会对外显子9的识别产生额外的抑制作用，这使得我们很容易推测，在患者中，这两个因素可能会协同作用，降低9（+）转录物。可以预见，在这两种因子表达最丰富的器官中，这种协同抑制作用将更加显著。不同个体相同组织中TDP-43和SF2/ASF浓度的潜在变异性也为解释T5等位基因部分穿透提供了一个可能的分子基础，以及为什么CF患者的生殖道、胰腺和肺部受累情况不同，即使他们有相同的突变。然而，在该外显子附近和内部发现的调控区域的复杂性表明，在获得影响该过程的相互作用的完整图片之前，还需要进一步的工作。

材料和方法

质粒构建与RNA转录

包含人类和小鼠CFTR基因组区域的野生型和突变构建物已在前面描述过(Niksic等人，1999年;Pagani等人，2000年). 质粒（ucuu）三和（微克）12通过退火获得以下正、反义引物：5′-TCCTCTCTCTCTTTCTCTCCAGG-3′，5′-CCTGAGAAGAGAGAGGA-3′，5’-TGTGTGTGTTGTGTGTGT-3′和5′-ACA CACACACAC-3′，并用克拉我和克莱诺的口误。用适当的限制性内切酶消化，使所有质粒线性化。前面已经描述了冷标记RNA的转录、核提取物的制备和UV交联分析(Pagani等人，2000年). 在所有UV交联实验中，除非特别说明，否则每个反应中使用的核提取物数量为18µg。竞争对手的摩尔数在每个图例中都有描述。将样品装载在10%SDS–PAGE凝胶上，随后将其干燥并暴露于Kodak X-Omat AR胶片中12-24小时。

TDP-43亲和纯化

1纳米（ucuu）三或（微克）12将冷RNA（～7.9µg）置于含有0.1 M NaOAc pH 5.0和5 mM钠的400µl反应混合物中米-周期（Sigma）。反应混合物在室温（RT）黑暗中培养1小时。将RNA用乙醇沉淀并重悬于500µl pH 5.0的0.1 M NaOAc中。然后，将400µl己二酸脱氢叠氮琼脂糖珠50%浆料（Sigma）在10 ml 0.1 M NaOAc pH 5.0中洗涤四次，每次洗涤后在3000 r.p.M.下造粒3分钟。最终清洗后，将300µl 0.1 M NaOAc pH 5.0添加到珠子中。然后将浆液与经周期性处理的RNA混合，并在旋转器上在4°C下培养12小时。然后将带有结合RNA的珠子制成丸，在2 ml 2 M NaCl中洗涤三次，在3 ml缓冲液D中洗涤三遍（20 mM HEPES–KOH pH 7，6.5%v/v甘油，0.1 M KCl，0.2 mM EDTA，0.5 mM二硫苏糖醇）。将其与0.6 mg HeLa细胞核提取物在30°C、650µl最终体积中孵育20 min，在1000 r.p.m.下离心造粒3 min，并用含有4 mM MgCl的5 ml缓冲液D洗涤5次2最后离心后，将60µl SDS–PAGE样品缓冲液加入珠粒中，并在90°C下加热5分钟，然后加载到10%SDS–PAGE凝胶上。Eurosequence B.V.（荷兰格罗宁根，NL9747 AG，Nijenborgh 4）对从SDS-PAGE凝胶上切下的考马斯染色带进行内部序列分析。

重组TDP-43作为GST融合蛋白的表达

采用5′-ATGTCTGAATATATTCGGGTAACCGA-3′和5′-CTACATCCCCAGCAGAACTA-3′正向和反向引物，对HeLa总RNA进行RT-PCR后PCR扩增TDP-43的全编码序列。TDP-43（aa 101–261）的中心部分使用以下反向和正向寡核苷酸进行扩增：5′-CAGAAAACATCCGATTTA-3′和5′-CTATTCGCATGTGATG-3′。两种PCR产物都克隆到Sma公司质粒pGEX-3X（Pharmacia）的I位点及其重组蛋白用谷胱甘肽表达和纯化秒–按照制造商的说明，使用Sepharose 4B珠（Pharmacia）。

TDP-43的免疫沉淀和免疫缺失

根据标准方案，通过免疫一只3个月大的兔子（新西兰株）获得TDP-43多克隆抗血清。在IP缓冲液（20 mM Tris pH 8.0，300 mM NaCl，1 mM EDTA，0.25%NP-40）中RT培养1 h后，抗体随后与蛋白质A/G PLUS–琼脂糖珠（圣克鲁斯生物技术）结合。然后将珠子分为20µl小份，并在室温下与不同的UV交联样品孵育2小时（最终体积为1 ml IP缓冲液）。在添加SDS-加载缓冲液之前，每个样品用1 ml IP缓冲液清洗五次，并加载到10%的SDS-PAGE凝胶上。通过在100µl最终体积的10 mM Tris（pH 7.4）、100 mM NaCl、2.5 mM MgCl中加入72µg的总HeLa核提取物进行免疫去除2，0.5%Triton X-100缓冲液，带抗TDP-43 A/G珠。在RT培养1小时后，通过3000转/分离心5分钟分离耗尽的提取物。去除上清液的部分（25µl）用于随后的UV交联和western印迹。根据标准方案，使用稀释度为1:2000的兔抗TDP-43血清进行Western blotting，并使用ECL（Amersham）进行开发。

TDP-43和SF2/ASF的Northern印迹

Northern blot分析在商用人类聚（A）上进行+北部斑点（Clontech）。TDP-43的探针被统一标记生态RI–Nde公司I DNA片段，对应于其编码区的59–165残基。通过扩增整个cDNA编码序列获得SF2/ASF探针。每个印迹在68°C下杂交并在标准条件下清洗。然后使用Camberra Packard即时成像仪量化mRNA水平，并使用GAPDH探针对每条车道上不同的RNA负荷进行标准化。

TDP-43和SF2/ASF的过度表达及反义实验

已经描述了hCF-（TG）m（T）n小基因、SF2/ASF编码质粒和纤维连接蛋白EDB小基因(帕加尼等2000年). TDP-43的哺乳动物表达载体是通过在pRc-CMV载体中亚克隆2743 bp TDP-43 cDNA序列获得的（德国柏林资源中心和初级数据库）。对瞬时转染DOTAP（Roche Diagnostic）的Hep3B细胞进行微基因表达分析。用空白对照载体pRc/CMV将每个样本中转染的DNA总量取为6µg（如果包括EDB小基因，则取7.5）。转染48小时后，对总RNA进行RT-PCR-32P] 将dCTP加入PCR混合物中，将产物装入6%天然聚丙烯酰胺凝胶中，干燥后暴露于即时成像仪中。对每个剪接带的计数进行C/G含量的校正。实验重复进行，至少重复三次。利用MWG-Biotech合成了反义PS-寡脱氧核苷酸：TIO7（5′-ACCAAGCGCAGCCAGCCACA-3′）、TIO86（5′-CCGAATATATCAGACACATCT-3′）、TIO155（5′-GAGAGCCCCCATC-3′）和TIO1318（5′-CTGTACACACACGCCA-3′）和FN56（5′-GTCACCCGCACTCGATATCCAG-3′。Hep3B 70-80%融合细胞与3µg小基因hCF-TG13T5和不同数量的PS-寡脱氧核苷酸通过DOTAP共转染。转染后28小时，提取总RNA，蛋白裂解物（30µg）用于western blot分析。

TG13T3突变的特征

通过常规盐析程序从患者和家属的EDTA血样中提取基因组DNA。如前所述，通过SSCP分析和直接测序对CFTR基因进行突变筛选(德克等., 1997). EBV转化建立淋巴母细胞系(奈泽尔，1986年). 使用5µg总RNA和荧光标记引物进行RT-PCR：正向5′-CAGAAGTAGTGATGGAGAATGTAAC-3′（外显子8）、反向5′-GTTGACCACTCCACTCAGTGTGATC-3′（外显子11）或5′-TTCATA GGAAACCAAAG-3′（外显子10，密码子508特异）。进行35个PCR循环，在62°C下退火1分钟，在72°C下延伸75秒，在94°C下变性45秒。对于外显子9跳跃的半定量分析，使用ALF测序器在8%或10%变性聚丙烯酰胺凝胶上分离RT-PCR产物，并使用Fragment Manager软件（Pharmacia）量化荧光信号。

致谢

我们衷心感谢CF家族参与本研究，感谢PD医生K.M.Keller提供的临床信息。我们还要感谢Sabine Borgmann和Regina Bendix在建立和维护淋巴母细胞系方面提供的帮助，感谢Javier Caceres表达SF2/ASF的质粒，感谢Michela Zotti和Cristiana Stuani提供的娴熟的技术援助。E.Z.得到了AIRH的资助。这项工作得到了Telethon Onlus基金会E1038资助。

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文章来自欧洲分子生物学组织由以下人员提供自然出版集团