跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
EMBO J。2001年4月2日；20(7): 1640–1650.
数字对象标识：10.1093/emboj/20.7.1640
预防性维修识别码：项目经理145457
PMID：11285228

代谢性谷氨酸组I（mGluRI）调节神经营养素的分泌，Trk受体活化通过磷脂酶C信号通路介导

马可·卡诺萨,1,2,三 安妮特·加特纳,1 加布里埃尔·坎帕纳,1,2 稻垣直树,4和汉斯·托恩1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

神经营养素（NTs）在调节活动依赖性神经元可塑性方面发挥着重要作用。在这种情况下，NT分泌的部位和程度至关重要。在这里，我们证明了磷酸脂肪酶C（PLC）的激活和随后钙的动员2+由Trk和谷氨酸受体激活启动的NT分泌对细胞内储存至关重要。酪氨酸残基在所有Trk受体的细胞质域中高度保守，其突变分析表明，在培养的海马神经元和nnr5细胞中激活PLC-γ是动员Ca的必要条件2+从细胞内储存，调节NT分泌的关键机制。谷氨酸介导的NT分泌也有类似的信号机制，其部分依赖于PLC的激活，通过代谢性受体引导钙的动员2+通过三磷酸肌醇从内部储存。因此，PLC介导的信号转导途径是Trk和mGluRI介导的NT分泌的共同机制。

关键词：腺病毒/BDNF/Ca2+存储/海马神经元/NGF

引言

神经营养素（NTs）是由神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、神经营养素3（NT3）和神经营养素4/5（NT4/5）组成的神经营养分子基因家族，与一个共同受体（p75）具有几乎相同的亲和力NTR公司)对酪氨酸激酶受体（Trks）具有高选择性。NGF优先结合TrkA、BDNF和NT4/5结合TrkB，NT3结合TrkC。NTs调节胚胎发育期间特定神经元种群的存活和分化以及成年期特定神经元功能的维持（参见博思韦尔，1995年;Lewin和Barde，1996年). 然而，越来越多的证据表明，神经干细胞在调节活动依赖性神经元可塑性方面也发挥着重要作用(Thoenen，1995年;Bonhoeffer，1996年;大提琴和马菲，1996年;McAllister等人，1999年). NTs对突触传递的调节作用由突触前和突触后机制介导。在动力学前，神经递质增强活性介导的神经递质释放(Lohof等人，1993年;Knipper等人，1994a,b条;Lessmann等人，1994年;Blöchl和Sirrenberg，1996年;Gottschalk等人，1998年;Y.X.Li等人，1998年). 动态后，BDNF通过以下途径增强传输N个-甲基-d日-天冬氨酸（NMDA）受体(Levine等人，1995年,1998;Suen等人，1997年)并通过γ-氨基丁酸（GABA）减弱传播A类受体(Tanaka等人，1997年). 最近，Kafitz等人（1999）证明NTs也在毫秒内激活耐河豚毒素钠通道，导致重复动作电位的启动。在一个相对简单的组织器官中体外系统，即海马脑片，已经证明BDNF对长时程增强（LTP）的形成至关重要(Korte等人，1995年;Patterson等人，1996年). 纯合和杂合BDNF缺陷小鼠的LTP均受损，这表明CA3/CA1海马系统中LTP的形成需要临界量的BDNF。外源性给药(Patterson等人，1996年)或BDNF的局部重新表达(Korte等人，1996年)可以恢复LTP。这些高选择性效应是如何在一个完整的生理系统中引发的体内取决于相应Trk受体在当地可获得的NT数量。除了了解活性依赖性NT合成的机制外（参见Lindholm等人，1994年;Shieh等人，1998年;Tao等人，1998年)，了解NT分泌的机制和部位至关重要。在以前的实验中，已经证明海马神经元分泌NT是由神经元活动调节的，并通过兴奋性神经递质谷氨酸和乙酰胆碱介导(Blöchl和Thoenen，1995年,1996;Canossa等人，1997年;Griesbeck等人，1999年). 最近，很明显，NTs也调节自己的分泌(Canossa等人，1997年;Krüttgen等人，1998年). 两种神经递质(Blöchl和Thoenen，1995年;Griesbeck等人，1999年)和NT(Canossa等人，1997年)通过激活相应受体以类似的时间进程启动NT分泌。在使用特定受体拮抗剂的基础上，谷氨酸被认为通过离子性α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（AMPA）受体和代谢性谷氨酸受体（mGluRs）而非NMDA受体诱导NT分泌(Blöchl和Thoenen，1995年,1996). 所有Trk受体均可触发NT介导的NT分泌：在海马神经元中，通过TrkB和TrkC受体(Canossa等人，1997年)并通过TrkA受体在大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞中(Krüttgen等人，1998年). 虽然钙的动员，但导致NT分泌的信号转导级联反应几乎一无所知2+内源性储存似乎是导致调节NT分泌的所有途径的共同分母(Blöchl和Thoenen，1995年,1996;Griesbeck等人，1999年).

本研究的目的是阐明NT和谷氨酸导致NT分泌的信号转导途径。为此，我们首先使用在所有Trk受体中高度保守的细胞内结构域酪氨酸残基上突变的TrkA受体构建物(殷纳加奇等., 1995). Trk受体的激活导致特定酪氨酸残基的磷酸化。这些酪氨酸残基启动衔接分子（如SHC和SNT）的结合和磷酸化，以及磷脂酶C-γ（PLC-γ）和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3-K）等酶的激活（参见卡普兰和米勒，2000年). 我们证明Trk介导的NT分泌依赖于导致Ca的PLC-γ磷酸化2+从细胞内储存释放。此外，我们证明由mGluRI介导的谷氨酸诱导的NT分泌也是PLC激活和随后钙释放的结果2+从细胞内储存。

结果

PLC-γ介导nnr5细胞NT分泌的证据

我们通过探索细胞质域中单个酪氨酸残基的功能重要性，分析了TrkA介导的NT分泌信号通路。以前，通过用苯丙氨酸系统地替换酪氨酸残基（Y499、Y594、Y643、Y704、Y726、Y732、Y760或Y794），已经产生了一组TrkA受体突变体(殷纳加奇等., 1995). 在初步实验中，我们瞬时转染了nnr5细胞，这是PC12细胞的变体(绿色等., 1986)那辆p75快车NTR公司受体，但没有Trk受体(勒布等., 1991)，具有不同的TrkA受体突变体。我们获得的证据表明，苯丙氨酸替代Y794可消除NGF介导的BDNF分泌。所有其他突变体中的个别酪氨酸被苯丙氨酸取代，都不会干扰NGF介导的BDNF分泌。为了进一步证实Y794在NT介导的NT分泌中所起的作用，我们产生了稳定表达野生型或突变TrkA构建体的nnr5细胞（图1A） ●●●●。我们使用了替换野生型Y794的构建物（Y794F），或者只保留Y794（Re794Y）和残基Y679、Y683和Y684，这些残基是假定的自磷酸化位点，是受体酪氨酸激酶活性所必需的(斯蒂芬斯等., 1994). 我们选择了稳定的克隆（nnr5-TrkA、nnr5-Y794F和nnr5-Re794Y），这些克隆表达的受体蛋白水平与用抗pan-Trk抗体进行的western blotting评估的受体蛋白的水平相同（图1B） 。将细胞暴露于100 ng/ml NGF中0、5或10分钟，并使用抗磷酸酪氨酸抗体通过western blot测定受体磷酸化水平。野生型TrkA显示弱酪氨酸激酶活性（图2A） 在无NGF的情况下（0分钟）。然而，接触NGF 5分钟和10分钟后，信号强烈增加。Y794F突变体显示出类似的酪氨酸磷酸化模式。“拯救突变体”Re794Y在NGF暴露5分钟和10分钟后显示出清晰的酪氨酸磷酸化信号，尽管其明显弱于野生型和Y794F突变体。酪氨酸残基Y794已由Obermeier公司等. (1993)作为PLC-γ的结合位点。将不同稳定转染的nnr5克隆暴露于100 ng/ml NGF后，用抗磷酸酪氨酸抗体对细胞进行裂解和免疫沉淀。对沉淀物进行蛋白质印迹，并通过特异性抗PLC-γ抗体进行评估。在nnr5-Re794Y克隆中，NGF暴露后的PLC-γ磷酸化与野生型克隆中的一样强。相反，NGF不能在nnr5-Y794F克隆中诱导任何PLC-γ磷酸化（图2B） ●●●●。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为cde144f1.jpg

图1。野生型TrkA和受体突变体在nnr5细胞中的稳定表达。(A类)野生型TrkA受体和选定受体突变体的细胞溶质域示意图。Y794F代表一种TrkA受体，其中PLC-γ结合位点通过用苯丙氨酸取代酪氨酸残基Y794而失活，而在Re794Y中，除Y794外，所有酪氨酸残基都被苯丙氨酸所取代。酪氨酸残基Y679、Y683和Y684对受体的自磷酸化至关重要，并在所有突变体中保持。(B类)野生型（nnr5-TrkA）和突变TrkA受体（nnr5-Y794F和nnr5-Re794Y）的Western blot在nnr5细胞中稳定表达。检测野生型受体和突变体的表达水平。我们选择的克隆，通过检测抗pan-Trk抗体，显示出相当水平的受体蛋白。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为cde144f2.jpg

图2。比较稳定转染nnr5细胞和腺病毒转染海马神经元中野生型和突变TrkA受体的受体酪氨酸和PLC-γ磷酸化。(A类)nnr5-TrkA、nnr5-Y794F和nnr5-Re794Y克隆中NGF介导的酪氨酸磷酸化。用100 ng/ml NGF刺激每个克隆0、5或10分钟，并检测受体酪氨酸磷酸化。野生型和突变受体通过抗pan-Trk抗体从细胞裂解液中进行免疫沉淀，样品用SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离。用抗磷酸酪氨酸抗体检测蛋白质印迹。给予NGF 5或10分钟，在野生型和受体突变体中产生显著的酪氨酸磷酸化。(B类)nnr5克隆中NGF介导的PLC-γ酪氨酸磷酸化。用100 ng/ml NGF刺激单个克隆0或5分钟。用琼脂糖连接的抗磷酸酪氨酸抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀，并用特异性抗PLC-γ抗体进行蛋白质印迹分析。NGF处理5分钟足以诱导nnr5-TrkA和nnr5-Re794Y克隆的PLC-γ磷酸化，而nnr5-Y794F克隆在NGF存在或不存在的情况下均未显示PLC-β磷酸化信号。(C类)用TrkA和Re794Y受体转导的培养海马神经元中NGF介导的酪氨酸磷酸化。用100ng/ml NGF刺激转导的神经元0分钟和5分钟，并测定受体酪氨酸磷酸化。western blot按（A）进行。NGF在野生型受体和突变体中产生显著的酪氨酸磷酸化。(D类)用Re794Y转导的培养海马神经元中NGF-和BDNF-介导的PLC-γ酪氨酸磷酸化。用100 ng/ml NGF或BDNF刺激感染Re794Y腺病毒的培养海马神经元0或5分钟。海马神经元的裂解物通过琼脂糖结合的抗磷酸酪氨酸抗体进行免疫沉淀。如（A）所述，通过western blotting鉴定PLC-γ磷酸化。NGF和BDNF诱导的PLC-γ酪氨酸磷酸化程度相似。

为了评估选择性PLC-γ磷酸化和NT介导的NT分泌之间是否存在因果关系，我们研究了在不同克隆中，NGF是否以及在多大程度上可以在没有或存在PLC-β磷酸化的情况下促进BDNF分泌。由于在nnr5细胞中缺乏可检测的BDNF表达，我们使用腺病毒载体（AdCMV-BDNF）表达BDNF。转导后，将细胞置于灌注室中，每隔5分钟收集一次灌注液。通过双位点酶联免疫吸附试验（ELISA）对每个组分中的BDNF进行定量。NGF诱导的BDNF分泌与NGF磷酸化PLC-γ的能力密切相关。NGF诱导nnr5-TrkA和nnr5-Re794Y分泌BDNF，但在nnr5-Y794F细胞中没有（图三). 然而，所有的克隆都评估了分泌BDNF对高K的反应+（50毫米）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为cde144f3.jpg

图3。nnr5-TrkA、nnr5-Y794F和nnr5-Re794Y的高钾和NGF介导的BDNF分泌。以0.1 ml/min的流速灌注细胞。每5分钟收集一次分馏物。收集两个组分后，用50 mM KCl进行第一次刺激，并收集另外四个组分。恢复30分钟后，用100 ng/ml NGF刺激细胞。用双位点ELISA测定BDNF浓度。刺激后立即出现BDNF浓度增加（以pg/ml表示）。峰值浓度出现在以下部分。刺激开始与BDNF分泌峰值之间的5分钟延迟是由于灌注系统的死容量所致。NGF诱导nnr5-TrkA和nnr5-Re794Y细胞分泌BDNF，但不诱导nnr5或nnr5-Y794F细胞分泌。给出的值代表平均值±SE(n个 = 6).

PLC-γ信号转导通路也负责海马神经元中NT介导的NT分泌

在海马神经元中，NGF不启动NT分泌(卡诺萨等., 1997)由于缺乏功能性TrkA受体(艾贝尔等., 1998). 这种实验情况为分析TrkA介导的信号通路提供了机会。我们构建了腺病毒载体，携带野生型TrkA（AdCMV-TrkA）或突变受体Y794F（AdCMV-Y794F）和Re794Y（AdCMV-Re794Y）的cDNA。这些病毒的使用，加上AdCMV BDNF，需要双重感染程序。由于我们没有可靠的抗TrkA特异性抗体用于免疫组织化学分析，我们估计了不表达任何Trk受体的nnr5细胞的双重转导程度，因此抗pan-Trk抗体可以专门用于识别野生型TrkA和不同突变体。用Re794Y构建物转导的Nnr5细胞在质膜上显示出主要信号（图4B、 中间面板）。相反，BDNF显示了特征性的不连续散射图案（图4B、 左面板），反映其在内质网（ER）和高尔基体中的定位(加特纳等., 2000). 对于双转导的AdCMV-BDNF/AdCMV-TrkA或AdCMV-BNF/AdCMV Y794F nnr5细胞，获得了类似的细胞内分布模式（数据未显示）。BDNF和野生型TrkA或Y794F和Re794Y突变体的表达强度因细胞而异，但对清晰双染细胞的定量评估显示双重感染水平为～90%。重要的是，双感染的nnr5细胞显示出相同的BDNF分泌特性（图4A） 稳定转染的nnr5细胞（图三). 在腺病毒转导的海马神经元中，NGF对TrkA野生型受体及其突变体Re794Y进行5分钟介导的酪氨酸磷酸化，其比率与在nnr5细胞中获得的比率相似（图2C） ●●●●。此外，Re794Y被证明足以通过内源性TrkB受体将NGF介导的PLC-γ磷酸化诱导至与BDNF介导的磷酸化水平相当的水平（图2D） ●●●●。PLC-γ磷酸化与NGF通过激活内源性TrkB受体（图5B） 。表达野生型TrkA或Re794Y突变体的培养海马神经元对NGF的反应显示BDNF分泌增强，而用AdCMV-Y794F转导的神经元则没有。这些实验是在“静态”条件下进行的（见材料和方法），目的是排除“静态”和“灌注”条件之间存在差异的可能性，这一方面已经由格里斯贝克等. (1999).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为cde144f4.jpg

图4。腺病毒转导的nnr5细胞。(A类)用AdCMV-Re794Y和AdCMV-BDNF双重转导的nnr5细胞分泌BDNF的时间进程。灌注如图所示三50 mM KCl和100 ng/ml NGF随后的两次刺激通过30分钟的恢复期分开。每5分钟收集一次组分，并通过ELISA测定BDNF浓度。所示值为平均值±SE(n个 = 4). (B类)与AdCMV-BDNF和AdCMV-Re794Y联合转导的nnr5细胞中BDNF及Re794Y突变体的表达。通过杂交瘤上清液（9E10）检测BDNF和Re794Y的表达，该上清液识别添加到BDNF C末端结构域的myc表位，并使用抗pan-Trk抗体检测Re794Y的C末端。通过共焦显微镜分析细胞。这些图片表示沿着给定的x–y平面。BDNFmyc感染的nnr5细胞显示出BDNF在内质网和高尔基体内定位的不连续染色模式特征（绿色）。用抗pan-Trk抗体获得的染色主要定位于质膜（红色）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为cde144f5.jpg

图5。表达TrkA、Y794F和Re794Y受体的培养海马神经元分泌BDNF。(A类)用100 ng/ml NGF在“静态”条件下刺激用AdCMV-TrkA、AdCMV-Y794F和AdCMV-Re794Y转导的海马神经元10分钟。NGF诱导的BDNF分泌只发生在表达野生型TrkA和Re794Y受体的神经元中，而不发生在Y794F或绿色荧光蛋白（GFP）控制病毒感染的神经元中。给出的值为平均值±SE(n个 = 10). (B类)NT4/5通过内源性TrkB或NGF通过转导的Re794Y诱导的BDNF分泌的时间过程。在用100 ng/ml NT4/5刺激之前、期间和之后灌注细胞并收集部分。第二次刺激是通过服用100 ng/ml NGF开始的。NT4/5激活内源性TrkB受体，NGF激活TrkA受体突变体Re794Y。给出的值为平均值±SE(n个 = 6).

PLC-γ酪氨酸磷酸化与IP相关三积累和钙2+从细胞内储存释放

在以前的实验中，已经证明NT分泌依赖于完整的细胞内钙2+钙的储存和释放2+从他们那里(Blöchl和Thoenen，1995年,1996;卡诺萨等., 1997;格里斯贝克等., 1999). 因此，PLC-γ活化与NT分泌之间最可能的关系是d日-肌醇1,4,5-三磷酸（IP三)以及随后的Ca动员2+通过激活IP从ER三受体(Obermeier公司等., 1996;廷霍费尔等., 1996). 在nnr5-Re794Y细胞中，NGF（100 ng/ml）诱导3倍的IP三增加（18.8±0.1 pg/106细胞对5.5±0.05 pg/106单元格）。相反，在对照nnr5细胞中，NGF没有诱导任何IP三基面以上的地层。NGF介导的钙2+通过Ca评估ER的动员2+成像程序，使用Ca2+荧光剂Fura-2。在感染携带Re794Y突变体的腺病毒的海马神经元中，BDNF或NGF均可诱导细胞内Ca2+Ca中的信号2+-添加10µM高亲和力钙的游离培养基2+螯合剂BAPTA（图6A） ●●●●。根据之前的实验(卡诺萨等., 1997)，无Ca2+向天然的、未转导的培养海马神经元施用NGF后获得信号（图6A） ●●●●。观察到的胞浆Ca增加2+由于钙的释放2+观察到通过用咖啡因和他普司加林的组合预处理来消耗这些储存物阻断了NGF-和BDNF介导的Ca2+AdCMV-Re794Y感染海马神经元的信号传导（图6B） ●●●●。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为cde144f6.jpg

图6。细胞内钙的变化2+表达Re794Y受体的海马神经元中的浓度。(A类)非转导的海马神经元（对照）和Re794Y转导的神经元负载Fura-2/AM。细胞内Ca的变化2+浓度由340和380nm激发波长下的荧光比率确定。在缺乏细胞外钙的情况下2+（BAPTA），表达TrkA受体突变体的海马神经元显示NGF介导的[Ca2+]我这与BDNF通过内源性TrkB受体作用获得的结果无法区分。这是八个独立实验的典型例子。(B类)细胞内钙耗竭的影响2+通过thapsigargine和咖啡因在随后的Ca中存储2+BDNF或NGF发出信号。在缺乏细胞外钙的情况下2+（BAPTA），咖啡因/塔普西格尔津引发了强烈的、持续的钙2+钙耗尽产生的信号2+商店。随后的BDNF和NGF给药没有引起可检测的Ca2+信号，与未经咖啡因和thapsigargine处理的海马神经元形成鲜明对比。这是三个独立实验的典型例子。

PLC-γ介导的BDNF分泌依赖于钙2+从完整细胞内钙释放2+商店

在显示NGF诱导细胞溶质钙增加后2+在表达Re794Y结构的海马神经元中，我们接下来评估了PLC-γ介导的Ca的作用2+释放启动NT分泌。在之前的实验中，我们已经证明BDNF通过内源性TrkB受体发挥作用，可以在缺乏细胞外钙的情况下调节海马神经元分泌NGF2+以类似于神经递质介导NT分泌的方式(卡诺萨等., 1997). 高亲和力钙的一种膜透性形式2+螯合剂BAPTA-AM通过隔离细胞溶质钙而阻断NGF的分泌2+，表明Ca2+细胞内储存物的释放在NT介导的NT分泌中至关重要。这一解释现在得到了进一步的支持，即PLC-γ的选择性激活在Ca2+-自由条件。我们比较了感染AdCMV-Re794Y的细胞对NT4/5或NGF的反应（图7A） ●●●●。去除细胞外钙2+从灌注培养基中提供10µM高亲和力钙2+螯合剂BAPTA不能阻止NGF介导的BDNF分泌（图7A） ●●●●。然而，使用可渗透膜的Ca进行预处理2+螯合剂BAPTA-AM以类似于用咖啡因和thapsigargine进行预处理清空储存物的方式消除BDNF的分泌（图7A） ●●●●。nnr5-TrkA和nnr5-Re794Y克隆也获得了类似的结果（图7B） ●●●●。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为cde144f7.jpg

图7。对完整钙的依赖性2+在海马神经元中储存NT介导的NT分泌。(A类)细胞外钙缺乏时海马神经元BDNF的分泌2+（BAPTA）、BAPTA-AM对细胞内钙的螯合作用以及细胞内钙耗尽后2+通过咖啡因和thapsigargine进行储存。如图所示，对同时感染AdCMV-BDNF和AdCMV-Re794Y的培养海马神经元进行灌注三在正常钙中用100 ng/ml NT4/5刺激5分钟后2+，在Ca中用100 ng/ml NGF进行第二次刺激2+-游离培养基或含有钙的培养基2+螯合剂BAPTA-AM（10µM）。去除细胞外钙2+（BAPTA）不影响NGF诱导BDNF分泌的能力。然而，NGF对BDNF分泌的影响通过用细胞可渗透的BAPTA-AM预处理海马神经元30分钟而被消除2+含有咖啡因（3 mM）和毒精（10µM）的商店可消除NGF介导的BDNF分泌。给出的值代表平均值±SE(n个 = 6). (B类)钙的作用2+来自nnr5-TrkA或nnr5-Re794Y克隆的BDNF分泌中。与海马神经元的作用类似，在缺乏细胞外钙的情况下，NGF诱导nnr5克隆分泌BDNF2+（BAPTA）。相反，螯合细胞内钙2+BAPTA-AM或耗尽细胞内钙2+储存咖啡因/他培加精可阻止NGF介导的BDNF分泌。给出的值代表平均值±SE(n个= 7).

mGluRI介导NT分泌的证据

我们现在探讨了PLC信号转导通路的激活是否也可能与谷氨酸介导的NT分泌有关的问题。众所周知，mGluRI特异性地耦合到PLC介导的IP三生产(Frenguelli等人，1993年). 因此，这种信号转导途径有助于进行更详细的分析。我们首先在灌注室中分析了成年大鼠海马脑片内源性BDNF的分泌。以5分钟的级分收集灌注液，并通过双位点ELISA测量BDNF浓度。服用50µM 1S公司,3R（右）-1-氨基环戊烷-1,3-二羧酸（t-ACPD）是mGluRI和II受体的激动剂，刺激5分钟后导致内源性BDNF分泌增加（图8). 我们在感染AdCMV BDNF的游离海马培养物中获得了类似的分泌模式（图9A） ●●●●。为了证明mGluRI的特异性激活与BDNF分泌有关，我们用特异性mGluRI抑制剂1-氨基吲哚-1,5-二羧酸（AIDA）预处理海马神经元。已经证明，这种抑制剂降低了IP的生成三在海马脑片中由t-ACPD（100µM）诱导而不影响II组受体的激活(Moroni等人，1997年). 同意减少知识产权三累积，用500µM AIDA预处理20分钟，导致t-ACPD介导的BDNF分泌强烈减少（图9B） 。因此，t-ACPD的作用严格依赖于完整钙2+商店。事实上，添加了塔普西格尔津和咖啡因（图9C） 自身启动BDNF分泌(Griesbeck等人，1999年)，在细胞外钙的存在下，阻断t-ACPD诱导的BDNF分泌2+因此，mGluRI介导的海马脑片和转导海马神经元中BDNF分泌是通过激活mGluR受体启动的，导致IP三-介导钙2+从细胞内储存中动员。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为cde144f8.jpg

图8。自然、非转导海马脑片BDNF分泌的时间进程。对急性海马脑片进行灌注，并在连续5分钟内收集部分。BDNF浓度通过ELISA测定。在30分钟的恢复期后，首先用50µM谷氨酸刺激，然后再用100µM t-ACPD、AMPA或NMDA刺激。给出的值为平均值±SE(n个 = 4).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为cde144f9.jpg

图9。谷氨酸分泌BDNF的信号转导途径分析。(A类)谷氨酸受体激动剂在培养海马神经元中启动BDNF分泌。海马神经元原代培养物感染AdCMV-BDNF 36–48小时。在60分钟的平衡时间后，在“静态”条件下，在10分钟内收集的培养基中测定分泌的BDNF的基本水平。用谷氨酸（50μM）、AMPA（100μM）或t-ACPD（100µM）刺激神经元10分钟，导致培养液中BDNF浓度增加。NMDA没有影响。(B类)用AMPA和mGluRI受体的特异性拮抗剂CNQX（50μM）和AIDA（500μM）分别预处理海马神经元，测试AMPA和t-ACPD的作用。(C类)钙的影响2+储存于AMPA和t-ACPD介导的BDNF分泌。在海马神经元中，用他必佳（10µM）和咖啡因（3 mM）治疗可启动BDNF的分泌，但可阻断AMPA和t-ACPD诱导的BDNF随后的分泌。给出的值代表平均值±SE(n个 = 6).

BDNF分泌是由AMPA介导的，而不是NMDA谷氨酸受体介导的

在之前的实验中(Blöchl和Thoenen，1996年)，已经证明谷氨酸介导的NT分泌可能被AMPA受体的拮抗剂所损害，而不是NMDA受体的拮抗剂所损害。我们现在使用AMPA和NMDA受体的特异性激动剂，并证明AMPA的选择性激活，而非NMDA受体也介导了海马脑片BDNF分泌的3-4倍增加（图8)和培养的神经元（图9A） ●●●●。AMPA的刺激作用是由AMPA受体的选择性激活引起的，而不是间接的反式-mGluRI的激活。事实上，选择性AMPA受体拮抗剂6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮（CNQX）只能阻止AMPA诱导的BDNF分泌，而不能阻止t-ACPD诱导的BDNF分泌（图9B） 。相反，AIDA只能阻止t-ACPD诱导的BDNF分泌，而不会影响AMPA的刺激作用（图9B） 。与mGluRI类似，AMPA受体介导的BDNF分泌被细胞内钙的耗竭所阻止2+商店（图9C） ●●●●。

讨论

利用nnr5细胞和培养的海马神经元作为分析系统研究TrkA介导NT分泌的信号转导途径

细胞内酪氨酸残基突变的TrkA受体(殷纳加奇等., 1995)用于确定导致nnr5细胞和培养海马神经元分泌BDNF的信号转导途径。野生型TrkA和所选突变体在nnr5细胞中稳定表达（表达p75的缺陷PC12细胞NTR公司但没有Trk受体）(勒布等., 1991). 这些细胞在服用NGF后被测试其调节BDNF分泌的能力。p75的存在NTR公司单独使用不足以诱导NGF分泌BDNF（图三). 这些数据与我们之前的观察结果一致(卡诺萨等., 1997)，但与克鲁特根等. (1998)在PC12细胞中，NT分泌不仅通过TrkA受体刺激获得，还通过激活p75获得NTR公司即在TrkA受体被阻断后。这些不一致的结果很可能是由所使用的不同PC12细胞的不同性质所解释的。

为了验证在nnr5细胞中获得的结果，我们利用了海马神经元不表达可检测水平的功能性TrkA受体这一事实(艾贝尔等., 1998)因此，它们对NGF没有任何反应。然而，在转染TrkA后，NGF促进了海马神经元的分化，如刺激纤维生长所反映的(艾贝尔等., 1998). 因此，培养的海马神经元代表了一个有效的细胞系统，具有适当的上下文特性，可以通过（转导的）TrkA受体及其突变体研究信号转导。腺病毒基因转移（图5)在海马神经元中完成野生型TrkA和相应突变体的表达。NGF激活TrkA受体分泌的BDNF量与NT4/5通过激活内源性TrkB受体介导的BDNF量相当（图5). 根据在nnr5细胞中获得的结果，通过TrkA受体和相应突变体的PLC-γ激活途径的信号转导也被证明对海马培养物中NGF介导的BDNF分泌至关重要。

钙2+信号传导和调节NT分泌

在以前的研究中，已经证明谷氨酸启动的NT分泌受到调节(Blöchl和Thoenen，1995年,1996;格里斯贝克等., 1999)NTs激活Trk受体(卡诺萨等., 1997)由钙的释放介导2+来自细胞内储存而非钙2+大量涌入。这代表了一种与传统神经递质和大多数神经肽的活性介导分泌截然不同的机制(霍克费特等., 1980;Thureson-Klein和Klein，1990年;马泰奥利和德卡米利，1991年;苏霍夫，1995年;Berridge，1998年)，提出了有关NT的储存/释放室及其分泌机制的相关问题。在本研究中，我们重点研究了从Trk和谷氨酸受体激活到细胞内钙释放的信号转导途径2+以及随后的NT分泌。在海马神经元和nnr5细胞的原代培养中，PLC-γ结合位点Y794介导的信号转导被证明对TrkA受体介导的NT分泌至关重要（图三和​和4A）。4A） ●●●●。PLC-γ与Y794的结合通过磷酸化导致PLC-β活化，然后磷酸化裂解磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸生成IP三.IP（IP）三动员钙2+通过激活IP从细胞内内质网存储三受体，如所示Obermeier公司等. (1996)在NIH 3T3细胞中。在这里，我们证明，在稳定转染“拯救突变”Re794Y（nnr5-Re794Y）的nnr5细胞中，NGF产生的IP增加三与野生型TrkA受体相似。NGF介导的IP三通过Re794Y的产量与钙相关2+细胞内内质网储存释放和钙2+动员与NGF介导的BDNF分泌相关，支持IP之间因果关系的概念三产量，Ca2+从细胞内储存和NT分泌动员。为了提供IP参与的最直接证据三在NT分泌形成过程中，我们试图通过紫外线激活细胞膜通透性形式的笼状IP来证明海马神经元分泌NT三(W.H.李等., 1998). 然而，打开神经元内IP所需的紫外线闪光强度三产生可检测的钙2+信号本身导致不含笼内IP的海马神经元大量分泌BDNF三（O.Griesbeck和M.Canossa，未发表的结果）。因此，Ca与2+动员和NT分泌必须依赖药理学证据，即调节的NT分泌被药理学上消耗的Ca阻断2+用咖啡因/毒精或通过向细胞内注入高亲和力钙来储存2+螯合剂BAPTA-AM（图7). 在所有这些实验条件下，受刺激的BDNF分泌减少。相反，细胞外钙的缺乏2+不干扰NTs的调节分泌。由于PLC-γ活化不仅导致IP的形成三，也包括二酰甘油，进而激活蛋白激酶C（PKC）(吉川等., 1989;西冢，1992年)，我们通过用特异性PKC抑制剂预摄取海马神经元来评估这种信号转导途径的可能参与。然而，这并不干扰NGF介导的BDNF分泌（数据未显示）。

特别令人感兴趣的是谷氨酸介导的NT分泌，因为谷氨酸是中枢神经系统中最显著的兴奋性神经递质。我们已经证明，mGluRI的激活导致海马脑片和培养海马神经元分泌NT，与50 mM钾介导的分泌相当（图8和​和9A）。9A） ●●●●。相反，mGluRI的特异性抑制剂显著减少了谷氨酸介导的NT分泌，尽管没有完全消除。mGluRI是一种G蛋白偶联受体，激活PLC，导致IP三形成(Frenguelli等人，1993年)和随后的Ca2+通过激活IP从细胞内储存中释放三受体。虽然谷氨酸介导的NT分泌是由mGluRI介导的，但之前的实验是由Blöchl和Thoenen（1996）证明AMPA受体抑制剂也减少了谷氨酸介导的NGF分泌。在目前的实验中，我们已经证明，AMPA受体的选择性激活物也能诱发NT分泌，而这不是由mGluRI的交叉激活引起的。必须结合先前的研究来考虑AMPA受体介导的NT分泌，此前的研究认为它是由钠内流介导的，鉴于钠的替代物为N个-甲基葡聚糖抑制谷氨酸介导的NGF分泌(Blöchl和Thoenen，1995年). 这种解释是错误的，因为更彻底的分析表明N个-甲基葡聚糖具有不依赖钠置换的阻断作用(霍纳，2000). 这排除了AMPA受体通过钠启动NT分泌的事实+流入，导致分泌机制尚未确定。Ca的动员2+内源性储存似乎是导致调节NT分泌的所有途径的唯一共同分母。如之前证明的谷氨酸(Blöchl和Thoenen，1995年)，AMPA介导的NT分泌依赖于完整的钙2+如观察结果所示，用他必佳和咖啡因预处理可阻止BDNF分泌（图9C） ●●●●。这表明，与mGluRI一样，AMPA触发导致Ca的细胞内信号通路2+从细胞内储存动员。然而，通过AMPA受体激活导致NT分泌的信号转导机制的阐明需要更详细的未来分析。

材料和方法

细胞系

大鼠nnr5细胞(绿色等., 1986)保存在含有5%胎牛血清（FCS；Gibco）和10%马血清（Boehringer Mannheim）的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）中，并在37°C和10%CO中培养2Nnr5克隆、Nnr5-TrkA、Nnr5-Y794F或Nnr5-Re794Y保持在G418（100 mg/l）选择下。Nnr5细胞和克隆以每片胶原涂层玻璃盖玻片（10 mm）100 000的密度进行电镀。在80%的汇合处，细胞在释放实验之前用体积减少为300µl的腺病毒载体感染8–12小时。

急性海马脑片

根据报告，从成年Wistar大鼠的海马中制备350µm切片，并将其放置在灌注室中Blöchl和Thoenen（1995年）。在回收阶段10分钟后，以0.1 ml/min的流速开始释放实验。

海马神经元的原代培养

根据以下内容，从E17 Wistar大鼠制备海马神经元扎夫拉等. (1990)从胚胎E17大鼠获得的分离海马神经元在完全培养基中生长5-7天。在我们的培养条件下，胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫细胞化学检测显示，只有2%的细胞来源于星形胶质细胞，GFAP是星形胶质细胞特异性标记物（数据未显示）。剩下的细胞表达微管相关蛋白2（MAP2），这是一种已建立的神经元标记物。神经元以每10 mm玻璃盖玻片200 000的密度镀膜，并涂上聚乙烯-数字图书馆-鸟氨酸（0.5 mg/ml），并在释放实验之前用体积减少为300µl的腺病毒载体感染36–48小时。

nnr5克隆的转染和选择

野生型TrkA的cDNA编码和克隆到哺乳动物表达载体（pEF-BOS）中的突变体，描述如下殷纳加奇等. (1995)用常规磷酸钙法瞬时转染nnr5细胞。为了获得稳定表达的克隆，将nnr5细胞与表达TrkA、Y794F或Re794Y的构建物以及表达庆大霉素抗性基因的载体共同转染。在G418（500 mg/l）存在下进行选择后，抗性菌落在含有100 mg/l G418的培养基中扩大。

重组腺病毒的构建

野生型TrkA或突变体Y794F和Re794Y的cDNA编码被亚克隆到Xba公司pXCJL1-CMV-BGH载体的I位点（由加拿大魁北克省C.Gravel提供）。通过在293细胞中同源重组获得重组复制缺陷病毒(McGrory等人，1988年;Graham和Prevec，1992年). AdCMV TrkA、AdCMV-Y794F和AdCMV-Re794Y分别含有编码TrkA、Y794F和Re794Y受体的cDNA序列。AdCMV-BDNF，之前在Canossa等人（1997年），包含小鼠前体BDNF的cDNA序列编码，在C末端标记有myc表位。AdVGFP包含Hin公司dIII–不是N1-EGFP载体的I片段（Clontech）。斑块试验估计的病毒滴度在10范围内10–1011成斑单位/ml。

灌注建立和释放实验的特点

将急性切片、培养的海马神经元或玻璃盖玻片上的nnr5细胞置于灌注室中，并按照以下描述进行灌注：卡诺萨等. (1997)用50 mM KCl替换灌注培养基中的50 mM NaCl或添加谷氨酸（50µM）、AMPA（Biotrend，100µM。在恢复阶段，使用几种抑制剂开始预处理：CNQX（Biotrend，50µM）、AIDA（Biotrend，500µM）、咖啡因（Sigma，3 mM）、BAPTA-AM（Molecular Probes，10µM）、BAPTA（Sigma，10µM）和他普司加碱（Alexis，10µM）。BDNF分泌也在“静态”条件下定量。在这些实验中，感染的海马神经元在Hanks缓冲液的组织培养板中平衡60分钟。在四个10分钟的基本收集值后，用几种刺激物刺激神经元10分钟。在每个样本中，BDNF的量通过ELISA测定。

酶免疫分析（ELISA）

BDNF浓度由双位点ELISA根据卡诺萨等. (1997)和科尔贝克等. (1999)ELISA显示BDNF的敏感性为0.5–1.0 pg/ml。

蛋白质印迹

将10 cm培养皿中的nnr5-TrkA、nnr5-Re794Y和nnr5-Y794F细胞与培养的海马神经元（5×106)感染AdCMV-TrkA、AdCMV-Re794Y或AdCMV-Y794F的人用100 ng/ml的NGF刺激0、5或10分钟，然后溶解。使用抗磷酸酪氨酸抗体结合琼脂糖（Upstate Biotechnology）或小麦胚芽凝集素（WGA）结合的Sepharose进行过夜免疫沉淀。然后用8%SDS–PAGE分离样品，并使用标准程序转移至Immobilon-P膜（0.45µm；Millipore）。在阻断非特定位点后，将膜与一级抗体（抗PLC-γ（4µg/ml；Upstate Biotechnology）或pan-Trk抗血清（由Mariano Barbacid提供1:1000）在4°C下培养过夜。用与辣根过氧化物酶（Dianova）结合的适当二级抗体孵育1小时后进行检测，随后转化化学发光底物（Pierce）。

知识产权三决心

知识产权三使用Biotrak测量[三H] IP（IP）三化验系统（Amersham）。

钙2+成像

游离细胞内钙2+浓度由钙测定2+根据卡诺萨等. (1997).

免疫组织化学和共焦显微镜

对于Re794Y和BDNFmyc的细胞内检测，将nnr5细胞与4%多聚甲醛固定在磷酸盐缓冲液中20分钟，并阻断渗透性和非特异性位点。将第一抗体在4°C下添加过夜；其他步骤在室温下进行。使用识别myc表位的杂交瘤（9E10）上清液（1:10）检测BDNFmyc。对于Re794Y，使用兔pan-Trk抗血清（1:500）。二级抗体为异硫氰酸荧光素结合的抗小鼠抗体和抗兔利萨明-罗丹明抗体（均为Dianova；1:150）。用共聚焦显微镜（Leica）分析免疫荧光。

致谢

我们感谢Jens Richter和Claudia Huber提供的出色技术援助，以及Michael Ashdown对手稿进行的语言修订。这项研究得到了德国联邦科学技术研究院（致H.T.）、RFTF-96l00203和AIRC、MURST ex 60%（致M.C.）和美国塔里敦Regeneron Pharmaceuticals的支持。

工具书类

  • Aibel L.、Martinzanca，D.、Perez，P.和Chao，M.V.（1998）海马神经元TrkA受体的功能表达。《神经科学杂志》。物件。,54，424–431。[公共医学][谷歌学者]
  • Berridge M.J.（1998）《神经钙信号》。神经元,21, 13–26. [公共医学][谷歌学者]
  • Blöchl A.和Sirrenberg，C.（1996）神经营养素通过Trk和p75刺激大鼠中脑神经元释放多巴胺Lntr公司受体。生物学杂志。化学。,271, 21100–21107. [公共医学][谷歌学者]
  • Blöchl A.和Thoenen，H.（1995）海马神经元释放神经生长因子（NGF）的特征：构成性和非传统钠依赖性调节途径的证据。《欧洲神经科学杂志》。,7, 1220–1228. [公共医学][谷歌学者]
  • Blöchl A.和Thoenen，H.（1996）海马神经元原代培养中细胞存储室和神经生长因子（NGF）的组成性和活性依赖性释放位置的定位。分子细胞。神经科学。,7, 173–190. [公共医学][谷歌学者]
  • Bonhoeffer T.（1996）神经营养素与新皮质的活动依赖性发育。货币。操作。神经生物学。,6, 119–126. [公共医学][谷歌学者]
  • Bothwell M.（1995）神经营养素和神经营养素受体的功能相互作用。每年。神经科学评论。,18, 223–253. [公共医学][谷歌学者]
  • Canossa M.、Griesbeck，O.、Berninger，B.、Campana，G.、Kolbeck，R.和Thoenen，H.（1997）神经营养素释放的神经营养素：活动依赖性神经元可塑性的含义。程序。美国国家科学院。科学。美国,94, 13279–13286.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Cellerino A.和Maffei，L.（1996）神经营养素在视觉皮层发育和可塑性中的作用。掠夺。神经生物学。,49, 53–63. [公共医学][谷歌学者]
  • Frenguelli B.G.、Potier，B.、Slater，N.T.、Alford，S.和Collingridge，G.L.（1993），海马CA1神经元树突中的代谢性谷氨酸受体和钙信号。神经药理学,32, 1229–1237. [公共医学][谷歌学者]
  • Gärtner A.、Shostak，Y.、Hackel，N.、Ethell，I.M.和Thoenen，H.（2000）海马神经元中神经营养素6活性依赖性分泌的超微结构鉴定和定位。分子细胞。神经科学。,15，215–234。[公共医学][谷歌学者]
  • Gottschalk W.、Pozzo-Miller，L.D.、Figurov，A.和Lu，B.（1998）发育中海马中脑源性神经营养因子对突触传递和可塑性的突触前调节。《神经科学杂志》。,18, 6830–6839.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Graham F.L.和Prevec，L.（1992）基于腺病毒的表达载体和重组疫苗。生物技术,20, 363–390. [公共医学][谷歌学者]
  • Green S.H.、Rydel、R.E.、Connolly、J.L.和Greene，L.A.（1986）具有低亲和力但非高亲和力神经生长因子受体的PC12细胞突变体既不响应也不内化神经生长因子。《细胞生物学杂志》。,102, 830–843.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Griesbeck O.、Canossa M.、Campana G.、Gärtner A.、Hoener M.C.、Nawa H.、Kolbeck R.和Thoenen H.（1999）NGF和BDNF的分泌特性是否存在差异？神经营养素在活动依赖性神经元可塑性中调节作用的意义。微型计算机。Res.技术。,45, 262–275. [公共医学][谷歌学者]
  • Hökfelt T.、Johansson，O.、Ljungdahl，A.、Lundberg，J.N.和Schultzberg，M.（1980）肽能神经元。自然,284, 515–520. [公共医学][谷歌学者]
  • Höner M.C.（2000）钠在重新修复的神经营养素活性依赖性分泌中的作用。《欧洲神经科学杂志》。,12, 1–11. [公共医学][谷歌学者]
  • Inagaki N.、Thoenen，H.和Lindholm，D.（1995）TrkA酪氨酸残基参与NGF诱导的PC12细胞突起生长。《欧洲神经科学杂志》。,7, 1125–1133. [公共医学][谷歌学者]
  • Kavitz K.W.、Rose，C.R.、Thoenen，H.和Konnerth，A.（1999）神经营养素通过TrkB受体引起快速兴奋。自然,401, 918–921. [公共医学][谷歌学者]
  • Kaplan D.R.和Miller，F.D.（2000）神经系统中的神经营养素信号转导。货币。操作。神经生物学。,10, 381–391. [公共医学][谷歌学者]
  • Kikkawa U.，Kishimoto，A.和Nishizuka，Y.（1989）蛋白激酶C家族：异质性及其影响。每年。生物化学评论。,58, 31–44. [公共医学][谷歌学者]
  • Knipper M.，Da Penha Berzaghi，M.，Blöchl，A.，Breer，H.，Thoenen，H.和Lindholm，D.（1994a）大鼠海马中乙酰胆碱与神经营养因子神经生长因子和脑源性神经营养因子之间的正反馈。《欧洲神经科学杂志》。,6, 668–671. [公共医学][谷歌学者]
  • Knipper M.，Leung，L.S.，Zhao，D.和Rylett，R.J.（1994b）NGF对成年大鼠海马谷氨酸能突触的短期调节。神经报告,5, 2433–2436. [公共医学][谷歌学者]
  • Kolbeck R.、Bartke，I.、Eberle，W.和Barde，Y.A.（1999）野生型和神经营养素基因突变小鼠神经系统中的脑源性神经营养因子水平。神经化学杂志。,72, 1930–1938. [公共医学][谷歌学者]
  • Korte M.、Carroll，P.、Wolf，E.、Brem，G.、Thoenen，H.和Bonhoeffer，T.（1995）缺乏脑源性神经营养因子的小鼠海马长期增强功能受损。程序。美国国家科学院。科学。美国,92, 8856–8860.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Korte M.、Griesbeck，O.、Gravel，C.、Carroll，P.、Staiger，V.、Thoenen，H.和Bonhoeffer，T.（1996）病毒介导的基因转移到海马CA1区可恢复脑源性神经营养因子突变小鼠的长期增强作用。程序。美国国家科学院。科学。美国,93, 12547–12552.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Krüttgen A.、Möller，J.C.、Heymach，J.V.和Shooter，E.M.（1998）神经营养素通过调节分泌途径诱导神经营养素的释放。程序。美国国家科学院。科学。美国,95, 9614–9619.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Lessmann V.、Gottmann，K.和Heumann，R.（1994）BDNF和NT-4/5增强培养海马神经元中的谷氨酸能突触传递。神经报告,6，21-25。[公共医学][谷歌学者]
  • Levine E.S.、Dreyfus、C.F.、Black、I.B.和Plummer，M.R.（1995）脑源性神经营养因子通过突触后酪氨酸激酶受体快速增强海马神经元的突触传递。程序。美国国家科学院。科学。美国,92, 8074–8077.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Levine E.S.，Crozier，R.A.，Black，I.B.和Plummer，M.R.（1998）脑源性神经营养因子通过增加N个-甲基-d-天冬氨酸受体活性。程序。美国国家科学院。科学。美国,95, 10235–10239.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Lewin G.R.和Barde，Y.A.（1996）《神经营养素的生理学》。每年。神经科学评论。,19, 289–317. [公共医学][谷歌学者]
  • Li W.H.、Llopis，J.、Whitney，M.、Zlokarnik，G.和Tsien，R.Y.（1998）《细胞发酵笼式INSP》三酯表明Ca2+穗频率可以优化基因表达。自然,392, 936–941. [公共医学][谷歌学者]
  • Li Y.X.，Zhang，Y.O.，Lester，H.A.，Schuman，E.M.和Davidson，N.（1998）脑源性神经营养因子在培养海马神经元中诱导的神经递质释放增强。《神经科学杂志》。,18, 10231–10240.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Lindholm D.、Berzaghi M.D.、Cooper，J.、Thoenen，H.和Castren，E.（1994）脑源性神经营养因子和神经营养素-4增加大鼠海马中神经营养素-3的表达。国际神经科学发展杂志。,12, 745–751. [公共医学][谷歌学者]
  • Loeb D.M.、Maragos，J.、Martin-Zanca，D.、Chao，M.V.、Parada，L.F.和Greene，L.A.（1991）。trk原癌基因在突变NGF-无反应PC12细胞系中拯救NGF反应。单元格,66，961–966。[公共医学][谷歌学者]
  • Lohof A.M.，Ip，N.Y.和Poo，M.M.（1993）神经营养素NT-3和BDNF对发育中神经肌肉突触的促进作用。自然,363, 350–353. [公共医学][谷歌学者]
  • Matteoli M.和DeCamilli，P.（1991），神经递质释放的分子机制。货币。操作。神经生物学。,1, 91–97. [公共医学][谷歌学者]
  • McAllister A.K.、Katz，L.C.和Lo，D.C.（1999）《神经营养素和突触可塑性》。每年。神经科学评论。,22, 295–318. [公共医学][谷歌学者]
  • McGrory W.J.、Bautista，D.S.和Graham，F.L.（1988）一种简单的技术，用于将早期区域I突变挽救为感染性人类腺病毒5型。病毒学,163, 614–617. [公共医学][谷歌学者]
  • 莫罗尼F。等.（1997）1-氨基吲哚-1,5-二羧酸（一种有效的mGluR1拮抗剂）的药理学特征。《药理学杂志》。实验治疗。,281, 721–729. [公共医学][谷歌学者]
  • Nishizuka Y.（1992）磷脂水解和蛋白激酶C激活的细胞内信号传递。科学类,258, 607–614. [公共医学][谷歌学者]
  • Obermeier A.、Halfter，H.、Wiesmuller，K.H.、Jung，G.、Schlessinger，J.和Ullrich，A.（1993）酪氨酸785是Trk-底物相互作用的主要决定因素。EMBO J。,12, 933–941.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Obermeier A.、Tinhofer，I.、Grunicke，H.H.和Ullrich，A.（1996）表皮生长因子和神经生长因子受体的转化潜能与其磷脂酶Cγ亲和力和信号激活呈负相关。EMBO J。,15, 73–82.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Patterson S.L.、Abel，T.、Deuel，T.A.S.、Martin，K.C.、Rose，J.C.和Kandel，E.R.（1996），重组BDNF可缓解BDNF基因敲除小鼠的基础突触传递和海马LTP缺陷。神经元,16, 1137–1145. [公共医学][谷歌学者]
  • Shieh P.B.、Hu，S.C.、Bobb，K.、Timmusk，T.和Ghosh，A.（1998）BDNF表达钙调节相关信号通路的鉴定。神经元,20，727–740。[公共医学][谷歌学者]
  • Stephens R.M.、Loeb，D.M.、Copeland，T.D.、Pawson，T.、Greene，L.A.和Kaplan，D.R.（1994）Trk受体使用涉及SHC和PLC-γ1的冗余信号转导途径来调节NGF反应。神经元,12, 691–705. [公共医学][谷歌学者]
  • Südhof T.C.（1995）突触囊泡周期：蛋白质-蛋白质相互作用的级联。自然,375, 645–653. [公共医学][谷歌学者]
  • Suen P.C.、Wu，K.、Levine，E.S.、Mount，H.T.、Xu，J.L.、Lin，S.Y.和Black，I.B.（1997）脑源性神经营养因子快速增强突触后的磷酸化N个-甲基-d-天冬氨酸受体亚单位1。程序。美国国家科学院。科学。美国,94, 8191–8195.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Tanaka T.、Saito，H.和Matsuki，N.（1997）GABA抑制A类大鼠海马脑源性神经营养因子（BDNF）的突触反应。《神经科学杂志》。,17, 2959–2966.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Tao X.、Finkbeiner，S.、Arnold，D.B.、Shaywitz，A.J.和Greenberg，M.E.（1998），加利福尼亚州2+内流通过CREB家族转录因子依赖机制调节BDNF转录。神经元,20, 709–726. [公共医学][谷歌学者]
  • Thoenen H.（1995）神经营养素和神经元可塑性。科学类,270, 593–598. [公共医学][谷歌学者]
  • Thureson-Klein A.和Klein，R.L.（1990）神经元大致密囊泡的胞吐。细胞遗传学国际修订版。,121, 67–126. [公共医学][谷歌学者]
  • Tinhofer I.、Maly，K.、Ditel，P.、Hochholdinger，F.、Mayr，S.、Obermeier，A.和Grunicke，H.H.（1996）《微分钙》2+表皮生长因子和神经生长因子受体激活所诱导的信号传导。生物学杂志。化学。,271, 30505–30509. [公共医学][谷歌学者]
  • Zafra F.、Hengerer，B.、Leibrock，J.、Thoenen，H.和Lindholm，D.（1990）大鼠海马中BDNF和NGF mRNA的活性依赖性调节由非NMDA谷氨酸受体介导。EMBO J。,9, 3545–3550.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
文章来自欧洲分子生物学组织由以下人员提供自然出版集团