外源性细胞色素可以挽救凋亡中线粒体呼吸功能障碍的可逆成分c（c）

Fas信号阻断线粒体呼吸状态转换

添加ADP后，与过量碳底物和无机磷酸盐孵育的分离线粒体将从状态4呼吸转变为状态3呼吸（图2) (Chance和Williams，1955年). 状态4：当还原当量和无机磷过量时，会产生呼吸作用，但没有ADP可用于刺激呼吸。在状态4呼吸期间，膜电位较高，NADH被化学还原，耗氧量最小。添加ADP驱动F₁F类₀-ATP酶并导致状态3呼吸，此时膜电位降低，NADH氧化，耗氧量增加。一旦添加的ADP转换为ATP，呼吸恢复状态4。线粒体经历呼吸状态转换时，电子传递链、F₁F类₀ATP酶、ANT和线粒体内膜必须完好无损。呼吸状态转换可以通过吡啶核苷酸（NADH）荧光、耗氧量和线粒体膜电位（Δψ）进行实验监测_米).

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图2。线粒体氧化磷酸化和呼吸状态概述。缩写：UQ，泛醌；c、 细胞色素c（c）; IM，线粒体内膜；OM，线粒体外膜；Δψ_米线粒体膜电位；VDAC，电压依赖性阴离子通道；KCN、氰化钾；V（V）_氧气，耗氧量。

在含有无机磷酸盐的等渗呼吸缓冲液中添加碳底物（谷氨酸+苹果酸，一种复合I还原剂）来控制线粒体，导致吡啶核苷酸的快速化学还原，直到达到稳定状态（状态4）NADH水平（图三A） ●●●●。添加ADP会启动状态3呼吸，由于电子传输链功能完整，吡啶核苷酸会被暂时氧化，直到添加的ADP转化为ATP，此时状态4呼吸恢复。随后添加氰化物（KCN），抑制细胞色素c（c）氧化酶，导致吡啶核苷酸的进一步还原。投标^–/–注射抗Fas抗体90分钟后分离出的线粒体显示出NADH反应（图三B） 与对照野生型线粒体无明显区别（图三A） ●●●●。Fas激活后从野生型肝脏分离的线粒体在谷氨酸+苹果酸的作用下，NADH的减少减弱（图三C） ●●●●。然而，他们对ADP完全没有反应，表明出现了呼吸阻滞。通过添加氰化物来控制线粒体，模拟了这种抑制模式，其中添加碳底物导致吡啶核苷酸减少，但由于呼吸阻滞，ADP不再刺激氧气消耗或NADH氧化（图三D） ●●●●。碳底物对吡啶核苷酸的化学还原不需要络合物III和IV之间的电子传递，而ADP刺激的从状态4到状态3的转变（谷氨酸+苹果酸是碳源）需要完全完整的电子传递链。

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图3。Fas途径损伤的线粒体中NADH氧化还原转换丢失，类似于氰化物处理的线粒体(A类)在添加碳底物（5 mM谷氨酸+5 mM苹果酸）、ADP脉冲（100 nmol）和最终氰化物（KCN，1 mM）后，对注射盐水的野生型小鼠的线粒体进行NADH荧光监测。(B类)线粒体来自投标^–/–注射抗Fas抗体90分钟后，肝脏对碳底物（谷氨酸+苹果酸）和ADP产生反应，类似于（A）中的野生型对照。(C类)为野生型小鼠的Fas活化线粒体提供碳底物（谷氨酸+苹果酸）和随后添加的两种ADP（100 nmol），并绘制NADH荧光图。(D类)对照野生型线粒体在时间0时与氰化物（1 mM）孵育。进行碳底物（谷氨酸+苹果酸）和两次随后的ADP（100 nmol）添加，并监测NADH荧光。

我们接下来评估了是否重新添加细胞色素c（c）足以恢复Fas途径损伤的线粒体的呼吸状态转换。线粒体在含有过量碳底物（谷氨酸+苹果酸）的呼吸缓冲液中培养，并监测NADH氧化还原转变对ADP的反应。这些转变在未经处理的盐水注射小鼠的控制线粒体中表现强劲（图4A） ，但在Fas活化60分钟后获得的线粒体中变钝体内（图4B） Fas活化90分钟后线粒体中基本缺失（图4C） ●●●●。添加10µM外源性细胞色素后，对相同的线粒体制剂进行监测c（c）（图4D–F）。在添加细胞色素的情况下，控制线粒体继续经历典型的NADH转换c（c）（图4D） 表明外源性细胞色素c（c）不干扰完整线粒体的呼吸转换。添加细胞色素c（c）Fas活化60分钟后线粒体氧化还原跃迁增强（图4E） 。值得注意的是，外源性细胞色素恢复了Fas活化90分钟后线粒体缺乏呼吸转换c（c）（图4F） ●●●●。在这组实验中，线粒体呼吸由复合I碳底物谷氨酸+苹果酸支持，因为没有添加抗坏血酸。添加的细胞色素的分光光度分析c（c）发现它在实验缓冲液中被完全氧化。因此，外源性细胞色素c（c）被从复合物I向前完整的电子传输链还原。还原的细胞色素c（c）然后必须将其电子转移到细胞色素c（c）氧化酶恢复对ADP的反应。

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图4。外源性细胞色素拯救NADH呼吸转换c（c）最初用复合I碳底物（5 mM谷氨酸+5 mM苹果酸）培养新鲜分离的线粒体。在盐水注射后（A和D）或注射抗Fas抗体后60分钟（B和E）和90分钟（C和F）从小鼠体内获得肝线粒体。线粒体显示为不存在（A–C）或存在（D–F）10µM细胞色素c（c）. (A类)盐水处理小鼠的线粒体对添加的ADP（100 nmol）脉冲作出反应，经历典型的NADH呼吸转变。(B类)注射60分钟后，NADH氧化还原转变变缓，需要更长时间。(C类)治疗90分钟后，添加ADP没有反应，NADH水平也没有恢复。(D类)与（A）中的实验相同，只是它是在存在10µM细胞色素的情况下进行的c（c），表明盐处理的控制线粒体即使在细胞色素存在的情况下也继续进行NADH转换c（c）.细胞色素c（c）熄灭NADH荧光，因此年-axis在细胞色素存在下进行的实验中被重新标定c（c）（D–F）。(E类)添加细胞色素c（c）与（B）中的线粒体相比，加深状态3 NADH氧化还原瞬态并提高恢复。(F类)之前治疗90分钟后分离出的线粒体（E）没有经历NADH转换，但带有外源性细胞色素c（c），现在经历了强劲的氧化还原转变，表明呼吸链仍然可以被挽救。

为了进一步明确线粒体功能障碍及其纠正，我们连续监测了耗氧量和四苯基膦（TPP）的分布⁺)（图5). 火力发电厂⁺是一种亲脂阳离子，以能斯特方式分布于线粒体内膜，并提供有关膜电位的定性信息。盐处理小鼠的野生型线粒体（图5A） 和Fas激活投标-线粒体缺陷（图5B） 生成跨膜电位，以响应复合I碳底物谷氨酸+苹果酸的添加。他们还接受了快速膜去极化和增加耗氧量[呼吸控制比（RCR）=6.0]，以应对ADP的增加。相反，野生型小鼠Fas活化60分钟后分离的线粒体未能增强膜电位（图5C） ●●●●。随着ADP的加入，他们从状态4呼吸到状态3呼吸的转换减弱，并且未能恢复到较高的状态4膜电位。这些线粒体对第二次ADP脉冲没有反应，在添加ADP后氧消耗几乎没有增加（RCR=1.1）。当在外源细胞色素存在下重复相同的实验时c（c）（图5D） 线粒体能够产生状态4膜电位以响应添加的碳底物（谷氨酸+苹果酸），并且随着ADP的添加，线粒体经历了从状态4呼吸到状态3呼吸的转变。耗氧量曲线显示呼吸控制适度恢复（RCR=2.8）。野生型小鼠Fas活化90分钟后分离出线粒体（图5E） 添加碳基质未能提高膜电位，且呼吸控制不佳（RCR=1.3）。这种缺乏反应让人想起用氰化物处理后的线粒体（数据未显示）。添加外源细胞色素c（c）在添加碳底物（谷氨酸+苹果酸）后，Fas活化的线粒体恢复了其产生膜电位的能力（图5F） ●●●●。此外，膜响应ADP的脉冲而轻微去极化；伴随着耗氧量和呼吸控制的增加（RCR=2.5）。

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图5。外源细胞色素部分修复Fas诱导的线粒体呼吸和膜电位缺陷c（c）将新分离的线粒体（注射盐水或抗Fas抗体后）放置在耗氧量（灰色）和TPP的呼吸室中⁺同时测量浓度（黑色）。(A类)控制线粒体对添加的碳底物（5 mM谷氨酸+5 mM苹果酸）产生膜电位。添加ADP（100 nmol）后，线粒体暂时去极化并经历一次耗氧爆发（状态3呼吸），直到添加的ADP转化为ATP。这些线粒体继续对添加的ADP作出反应，表明呼吸控制完好。(B类) 投标^–/–注射抗Fas抗体90分钟后分离的肝线粒体也表现出对碳底物和ADP的高度呼吸控制和膜电位反应，与（A）中的正常野生型线粒体没有区别。(C类)注射抗Fas抗体60分钟后获得的线粒体对添加的碳底物（谷氨酸+苹果酸）表现出最小的反应性，但添加ADP后出现轻微的膜去极化。(D类)用10µM外源性细胞色素孵育Fas-pathway损伤的线粒体，如（C）所示c（c）时间为0。膜电位现在响应于碳基质以及ADP的两个脉冲。耗氧量对ADP脉冲也有反应，表明呼吸控制部分恢复。(E类)Fas活化90分钟后获得的线粒体显示膜电位，该电位不随谷氨酸+苹果酸的添加而增加。耗氧量和膜电位对ADP的增加没有反应，表明呼吸失去控制。(F类)用10µM外源性细胞色素孵育Fas-pathway损伤的线粒体，如（E）所示c（c）时间为0。膜电位现在随着谷氨酸+苹果酸的反应而增加，而膜电位则随着添加ADP后耗氧量的增加而降低，这表明通过添加细胞色素可以恢复呼吸控制c（c）在实验后期，在耗氧量减慢且膜电位适度恢复后，线粒体仍然能够对第二次ADP脉冲作出去极化反应。

相比之下，添加牛血清白蛋白并不能挽救呼吸转换，这表明挽救并没有反映非特异性蛋白质效应（数据未显示）。单独添加抗坏血酸也不能挽救这些转变，这表明恢复不是由于调节任何内源性细胞色素的氧化还原状态c（c）（未显示数据）。为了探讨线粒体呼吸功能障碍是否需要caspase活性，我们进行了在体外如前所述，纯化的肝线粒体暴露于tBID的实验(Wei等人，2000年)在存在或不存在zVAD-fmk（caspase抑制剂）的情况下，浓度（50µM）不抑制呼吸复合物。半胱氨酸天冬氨酸酶抑制并没有实质性改变细胞色素引起的呼吸缺陷c（c）释放。外源细胞色素的再添加c（c）并且NADH的补充在有或无半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂的情况下产生了可比的耗氧量恢复（图6). tBID治疗后的RCR（2.2）不受caspase抑制剂的影响。

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图6。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制不能防止tBID诱导的呼吸缺陷。从未经处理的野生型小鼠肝脏（MLM）分离的线粒体与320 pmol tBID/mg线粒体蛋白（黑线）或tBID加50µM zVAD-fmk（深灰色线）孵育，或在呼吸缓冲液中未经处理（浅灰色线）。用克拉克型电极测量耗氧量。通过添加200 pmol羰基氰化物开始解偶联呼吸米-氯苯腙（CCCP）/mg线粒体蛋白（株）。如有说明，20µmol NADH/mg线粒体蛋白和10µmol-细胞色素c（c）/添加mg线粒体蛋白。

这表明tBID不需要半胱氨酸天冬氨酸酶活性来诱导线粒体的呼吸缺陷。总之，这些实验表明，在Fas途径激活后60分钟，细胞色素的增加c（c）使线粒体呼吸功能得到实质性但仍不完全恢复。

Fas活化导致线粒体肿胀和形态改变

为了确定Fas激活后线粒体结构是否有明显改变，我们从注射了抗Fas抗体的小鼠获得了肝脏切片的透射电镜图像（图7A） ●●●●。我们还使用了高压电子显微镜（HVEM）断层扫描（图7B–D），它提供了有关线粒体隔室三维组织以及线粒体内外膜之间关系的宝贵信息(曼内拉等., 1994;弗雷和曼内拉，2000年). Fas激活90分钟后，肝细胞出现典型的凋亡核浓缩。Fas处理的细胞线粒体苍白肿胀，嵴结构部分缺失（图7A） ●●●●。许多线粒体出现水泡，基质不对称突出，内膜膨胀，管状嵴缺失（图7A–D）。线粒体形态没有完全破坏，因为层析重建显示内膜完整，这与之前关于Fas介导的凋亡的研究一致(克里普纳等1996年;费尔德曼等., 2000). 在Fas活化细胞的许多线粒体中，当内膜完全完整时，电子显微镜和断层扫描显示外膜部分断裂，露出内膜（图7C和D）。典型的是，肿胀的内膜区几乎没有嵴，这表明气泡是由局部基质肿胀和内膜展开引起的。

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图7。Fas损伤线粒体的电镜和层析重建(A类)抗Fas抗体治疗90分钟后，肝脏切片的代表性区域显示线粒体有大气泡（箭头）。(B类)带有气泡的线粒体半厚（0.22µM）切片的电子层析重建的横截面切片（6 nm厚）。(C类和D类)重建线粒体的两张表面渲染图，显示外膜破裂（红色），内表面膜破裂（IM），有大气泡（黄色）和选定嵴（绿色），IM空间有狭窄的管状连接（箭头）。

线粒体的分离

如前所述分离线粒体(总量等., 1999)并以10 mg/ml的浓度储存在隔离缓冲液（200 mM甘露醇、70 mM蔗糖、10 mM HEPES pH 7.5、1 mM EGTA）中的冰上，直至用于实验。线粒体蛋白质含量采用生物-Rad蛋白质测定法进行定量。

细胞色素c释放的蛋白质印迹分析

将分离的线粒体（0.4 mg/ml）置于呼吸缓冲液中（137 mM KCl，10 mM HEPES pH 7.2，2.5 mM MgCl₂)补充5 mM谷氨酸、5 mM苹果酸、3 mM钾₂高性能操作₄，并在室温（24°C）下搅拌10分钟。线粒体颗粒（P）和上清液（S）组分是通过在8000℃下旋转混合物获得的克持续5分钟。以低血压裂解的线粒体作为阳性对照；它们是按照前面的描述准备的(Lee等人，1994年)将0.2 mg线粒体置于375µl水中4°C下10分钟，然后将此体积与125µl 4×呼吸缓冲液结合。细胞色素c（c）用市售的抗细胞色素对这两个组分进行免疫印迹c（c）单克隆抗体（Pharmingen）。

外膜渗透性测定

如前所述，测量外层膜的完整性(Lee等人，1994年)通过测量细胞色素c（c）-依赖氧气消耗。外源添加抗坏血酸诱导的细胞色素c（c）必须通过外膜才能被细胞色素氧化c（c）线粒体内膜外表面的氧化酶。将线粒体（0.4 mg/ml）放置在含有0.5 ml渗透缓冲液（200 mM甘露醇，4 mM NaH）的呼吸室（见下文）中₂高性能操作₄pH 7.2，5 mM氯化镁₂，10 mM KCl）补充1 mM抗坏血酸和900µM ADP。细胞色素c（c）-添加0.6mg细胞色素启动依赖性氧消耗c（c）（Sigma）在室温（24°C）下。对照实验证实所有的细胞色素c（c）-诱导呼吸对1 mM KCN敏感，吸收光谱显示，库存细胞色素c（c）当与1 mM抗坏血酸孵育时，立即完全减少。假设24°C时氧气在水中的溶解度为245 nmol氧气/ml H₂O。

吸收光谱法

细胞色素c（c）在A处监测氧化还原状态₅₄₀使用吸光度分光光度计。细胞色素c（c）（0.6 mg）添加到含有500µl呼吸缓冲液的石英试管中。添加1 mM抗坏血酸会立即导致与连二亚硫酸钠相同的吸光度变化，这表明1 mM的抗坏血酸钠会立即完全减少细胞色素的数量c（c）.

耗氧量和TPP的测量⁺浓度

耗氧量和TPP⁺如前所述同时测量浓度(穆萨等., 1996,1997)在装有氧气和TPP的500µl搅拌呼吸室中⁺电极（微电极公司，新罕布什尔州伦敦德里）。火力发电厂⁺电极监测线粒体外浓度，因为阳离子以能斯特方式分布，所以TPP较高⁺镀液中的浓度反映了较低的膜电位。然而，由于线粒体基质体积似乎随着Fas激活而变化（图7和​和8），8)，我们没有正式计算毫伏单位。

实验在含有2 mM K的500µl呼吸缓冲液中进行₂高性能操作₄向缓冲液中添加线粒体（0.8 mg/ml），以5 mM谷氨酸+5 mM苹果酸为碳底物，通过添加ADP启动状态3呼吸。火力发电厂⁺在仪器中只使用实验缓冲液进行测量。TPP的三个脉冲⁺添加（最终浓度为30µM），每个脉冲都能实现稳态记录，从而能够校准TPP的电极记录⁺浓度。

在tBID和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂实验中，将1 mg野生型小鼠肝线粒体培养在含有5 mM谷氨酸和2.5 mM苹果酸的呼吸缓冲液中，在有无zVAD-fmk和有无tBID的情况下进行培养(Wei等人，2000年)在25°C下保持30分钟。然后在7000℃下对线粒体进行离心克在4°C下悬浮10分钟，再悬浮在10µl隔离缓冲液中，并立即用于呼吸室中的呼吸研究。未对非特定TPP进行更正⁺或用于电极漂移。

吡啶核苷酸荧光测量

如前所述，吡啶核苷酸（NADH）荧光测量在Perkin-Elmer LS50B分光光度计中进行，激发波长为366±10 nm，发射波长为455±10 nm(穆萨等., 1997). 这种荧光是对还原的吡啶核苷酸库的测量。实验在搅拌良好的石英试管中进行，温度为24°C。将线粒体（0.4 mg/ml）置于500µl呼吸缓冲液中，其中5 mM谷氨酸+5 mM苹果酸作为碳底物，2 mM K₂高性能操作₄.添加ADP后启动状态3呼吸。

线粒体侧面散射

90度侧面散射可用于测量孤立线粒体的体积(尼科尔斯和弗格森，1992年). 将线粒体（40µg/ml）置于含有500µl呼吸缓冲液（补充有5 mM谷氨酸、5 mM苹果酸和2 mM K）的搅拌试管中₂高性能操作₄; 使用Perkin Elmer LS50B分光光度计在520±2.5 nm处连续监测90°侧散射。

线粒体的钙缓冲能力

如前所述，用荧光法测定线粒体对钙的摄取(墨菲等1996年)使用钙指示剂Cacium Green 5N（Molecular Probes，Inc.）。简单地说，将线粒体（0.4 mg/ml）添加到24°C搅拌良好的石英试管中，该试管含有1 ml补充有5 mM谷氨酸、5 mM苹果酸、2 mM钾的呼吸缓冲液₂高性能操作₄和0.1µM钙绿5N。将试管置于分光光度计中，通过荧光监测线粒体外钙，荧光激发为506±2.5 nm，发射为531±5.0 nm。氯化钙₂用去离子蒸馏水制备原料。