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美国国家科学院院刊。2006年3月7日；103(10): 3687–3692.
2006年2月27日在线发布。 数字对象标识：10.1073/pnas.0511155103
预防性维修识别码：PMC1450142型
PMID：16505370

大肠微RNA组

乔丹·M·康明斯,† 何一平,† 丽贝卡·莱利,† 雷·帕利亚里尼,† 路易斯·迪亚兹。,† 托比亚斯·斯霍布洛姆,† 奥马尔·巴拉德,‡ 齐维·本特维奇,‡ 安娜·E·萨夫兰斯卡,§ 艾曼纽尔·拉布利埃,§ 克里斯托弗·雷蒙德, 布莱恩·罗伯茨, 哈特穆特·朱尔,‖ 肯尼思·金兹勒,† 贝尔特·福格尔斯泰因,†††和维克托·维库列斯库†††
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补充资料

摘要

MicroRNAs（miRNAs）是一类在多细胞生物中具有重要调节作用的非编码小RNA。公共miRNA数据库包含321个人类miRNA序列，其中234个已通过实验验证。为了探索人类基因组中存在额外miRNA的可能性，我们开发了一种称为miRNA基因表达序列分析（miRAGE）的实验方法，并用它对人类miRNA进行了迄今为止最大的实验分析。通过对273966个人类结肠直肠细胞小RNA标签的序列分析，我们鉴定出200个已知成熟的miRNAs、133个新的miRNA*候选基因和112个以前未经特征化的miRNA1*形式。为了帮助评估候选miRNAs，我们中断了Dicer公司在三个人类结直肠癌细胞系中定位，并检测这些细胞中已知和新的miRNA。这些研究表明，人类基因组中包含的miRNAs比目前发现的要多得多，并为在人体组织中大规模实验克隆新的人类miRNA提供了一种途径。

关键词：结直肠癌，dicer，microRNA

MicroRNAs（miRNAs）是≈22-nt非编码RNA，由RNase III酶Dicer从较大（≈80-nt）的前体发夹加工成miRNA:miRNA*双工体(1–三). 这些双链体的一条链与RNA诱导沉默复合物（RISC）结合，而另一条链通常被降解(1). miRNA-RISC复合物靶向信使RNA进行翻译抑制或mRNA切割。关于人类基因组中编码的miRNAs的总数一直存在着相当大的争议。最初的估计，主要依赖于进化保守性，表明人类miRNAs多达255个(4). 最近的分析表明，有许多非服务的人类miRNA，并表明这个数字可能要大得多(5).

克隆和生物信息学方法都被用于识别miRNAs。直接miRNA克隆策略鉴定了许多最初的miRNA，并证明miRNA存在于许多物种中(6–16). 然而，这种方法的吞吐量很低，而且克隆方法似乎已经接近饱和(8). 生物信息学策略最近被用于识别根据各种序列和结构特征预测的潜在miRNAs(4,7). 然而，这样的基因预测可能并不指向所有合法的miRNAs，尤其是那些没有系统发育保守的，以及所有生物信息学预测需要独立的实验验证。

为了提高发现小RNA物种的效率，我们开发了一种称为miRNA基因表达序列分析（miRAGE）的方法。这种方法结合了直接miRNA克隆和SAGE的各个方面(17). 与传统的克隆方法类似，miRAGE从分离18-26碱基RNA分子开始，特异性连接子与之连接，并被反转录为cDNA(图1A类). 然而，随后的步骤，包括使用PCR扩增cDNA的复杂混合物、标签纯化、串联、克隆和测序，已经通过使用针对小RNA物种优化的SAGE方法进行。这种方法的优点是可以生成大的串联序列，用于在一个测序反应中识别多达35个标签，而现有的克隆协议平均每个反应分析大约5个miRNAs(8).

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miRAGE方法分离miRNAs。(A类)miRAGE方法示意图。该方法包括分离小RNA物种（红色卵形），然后结扎特殊的连接子（白色矩形），从而使用生物素化引物（蓝色圆圈）实现稳健的RT-PCR。通过与链霉亲和素涂层的磁珠（黄色椭圆）结合，酶切并去除连接物。已发布的标记被连接、克隆和排序。(B类)miRAGE标签的生物信息学分析。根据12 bp的内部核心序列将标签分组在一起。然后将每组中最具代表性的标签与各种RNA数据库进行比较。将与已知RNA序列不匹配的标签与人类基因组进行比较，并分析具有热力学稳定发夹结构的前体（参见材料和 方法更多详细信息）。

结果和讨论

miRAGE全基因组miRNA分析。

我们使用miRAGE分析了从四种人类结直肠癌和两种匹配的正常结肠粘膜样本中获得的273966个cDNA标签。将这些标签与现有的miRNA数据库进行比较，发现68376个标签与已知的miRNA序列相匹配。这是迄今为止发现的最大的人类miRNA序列集合，因为所有以前的人类miRNA克隆分析总计分析了<2000个miRNA分子。miRAGE检测到的miRNAs的表达水平在4个数量级以上（从23431个miR-21观察值到20个仅观察一次的miRNA），表明该方法可以检测到不同表达水平的miRNA。所识别的miRNA标签与公共miRBase数据库中的200个成熟miRNA相匹配(2)（表2，作为PNAS网站上的支持信息发布），其中52个在肿瘤细胞和正常结肠上皮之间的表达水平存在显著差异(P（P）<0.05，Fisher精确检验；表3，作为支持信息发布在PNAS网站上）。重要的是，在已经编目的miRNA中，这些结果为62个miRNA提供了新的实验证据，这些miRNA在这个数据库中的存在完全基于系统发育预测。

除了检测已知或预测的miRNA外，1411个miRAGE标签代表了100种以前未识别的miRNA*形式的已知miRNA（表4，作为支持信息发布在PNAS网站上）。miRNA*分子对应于最初的miRNA双链中存在的短寿命互补链，其生物学作用（如果有的话）尚未阐明。虽然已经推断所有miRNAs都存在miRNA*，但公共数据库中之前只报告了24个人类miRNA*。因此，这些分析为这些分子在人类细胞中的存在提供了更有力的证据。

新型miRNA的评估。

接下来，我们重点评估与已知miRNA不匹配的miRAGE标签是否代表新的miRNA物种。作为第一步，将miRAGE标签与现有的基因数据库进行比较，以排除与已知RNA匹配的序列，包括非编码RNA、mRNA和来自线粒体序列的RNA(图1B类). 然后对其余标签进行评估生物信息学它们假定的前体序列能够形成热力学稳定的发夹结构。miRAGE方法结合这些步骤有望满足Ambros最近提出的“表达”和“生物发生”标准等. (18)努力维护miRNA注释的统一系统。根据这些标准，共鉴定出168个标签，与推测的新miRNAs相对应。

新型miRNAs的验证。

在我们的研究过程中，这168个miRAGE标签中有35个是通过生物信息学和表达分析相结合而独立鉴定的(5). 这些发现为miRAGE方法的miRNA鉴定提供了一种单独的验证方法。几行证据表明，其余133个miRAGE标记中的大多数也与之前未标记的miRNAs相对应（表5，作为PNAS网站上的支持信息发布）。首先，确定黑猩猩、小鼠、大鼠、狗、鸡、河豚和斑马鱼基因组中每个标签前体结构的系统发育保守性。133个候选miRNAs中，共有32个具有保守的前体结构。此外，6个miRNA候选基因与已知miRNA的成熟miRNA序列具有显著同源性。尽管这些观察结果为进化上保守的新miRNA提供了支持，但不应将其余标签排除在合法miRNA之外，因为最近报告的大量人类miRNA与灵长类以外的物种缺乏同源性(5). 其次，81个新的候选miRNA由一个以上的miRAGE标记表示，或者通过使用miRNA微阵列在其他样本中独立检测到(5,19)（表6，作为PNAS网站上的支持信息发布）或定量实时PCR（表7和图7，作为PNASWeb网站上的支撑信息发布）。第三，15个候选的miRNAs定位于两个或多个miRNA的基因组簇，平均距离为10kb(图2). 这种物理接近性与最近关于miRNAs在人类基因组内聚集的报道一致(20). 第四，识别与特定miRNA相对应的miRNA*序列（具有特征性的3′末端）是一个强有力的指示，表明所讨论的小RNA物种是由诸如Dicer的RNase III酶处理的。在12个候选miRNA序列中观察到miRNA*标记。总共，133个新候选miRNAs中有89个至少有一个独立的证据支持其合法性(图3).

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人类基因组中miRNAs的聚类。对所有133个miRNAs进行分析后，确定了15个与其他已知或新的miRNA相近的miRNA。黄色方框代表候选的miRNAs，而白色方框代表已知的miRNAs。位置坐标基于国家生物技术信息中心基因组构建35/加州大学圣克鲁斯分校2004年5月的组装。

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133个候选人类miRNAs的验证。共有133个miRNA候选基因符合表达和生物发生标准（黑圈）。其他验证级别包括韧皮部遗传保守的前体结构（蓝色圆圈）、表达的多次观察（红色圆圈），基因组聚类（黄色圆圈）和相应miRNA*形式的观察（绿色圆圈）以及与已知miRNAs的强同源性（粉红色圆圈）。

作为验证候选miRNAs的单独实验方法，我们检查了这些小RNA的生成是否依赖于Dicer处理。这种分析的基本原理是基于这样一个事实，即Dicer缺失的细胞含有减少量的成熟miRNA(18). 然而，由于Dicer−/−脊椎动物细胞已被证明是不可被发现的(21)，我们试图生成一个显示低形态表型的Dicer突变株系。在针对Dicer N末端的小鼠研究中已经报道了这种突变(22). 因此，我们破坏了人类的外显子5Dicer公司通过使用AAV靶向构建物，从而中断N末端解旋酶结构域的一个非常保守的片段，同时保留RNase III结构域。这种方法成功地在三种不同的结直肠癌细胞系中破坏了解旋酶结构域(图4).

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大肠癌细胞中人类DICER1解旋酶结构域的破坏。(A类)内源性位点与AAV-Neo靶向结构一起显示，用于插入DICER1的外显子5。HA，同源臂；P、 SV40启动子；Neo，geneticin-resistance基因；R-ITR和L-ITR为左右反转终端重复；三角形，loxP站点。(B类)来自DLD1、HCT116和RKO结直肠癌细胞系的亲本（+/+）、杂合（+/Ex5）和纯合（Ex5/Ex5）克隆的PCR分析。用于PCR分析的引物（P1和P2）显示在A类.

从所有三个样本中选择miRNA基因的分析Dicer公司外显子5中断的细胞系（以下简称Dicer例5)与相应的亲本系相比，成熟miRNA的数量和miRNA前体的积累有所减少(图5A类和B类). 然后对HCT116野生型和HCT-Dicer进行miRAGE例5细胞来量化已知和新的miRNA水平的差异。在这两个细胞系中检测到的97个已知miRNA中，55个有差异表达，其中53个在Dicer中的miRNA水平平均降低了7倍例5细胞与野生型细胞的比较（表8，作为PNAS网站上的支持信息发布）。对168个候选miRNA的检测同样表明，在差异表达的6个候选中，Dicer中的miRNA水平平均减少了14倍例5单元格(表1). 这些观察结果与Dicer是已知和新miRNAs子集生物发生所必需的结论一致。

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miRNA在结直肠癌细胞中的表达Dicer公司中断。(A类)Northern blot分析显示Dicer中成熟miRNA减少，miRNA前体水平增加例5（Ex5）使用miR-21和miR-590探针与Dicer野生型（WT）细胞进行比较。(B类)如前所述，通过引物延伸定量PCR（PE-qPCR）测定已知miRNA的表达水平(33). 对于每个图形，显示成对比较，显示Dicer中的表达比率例5至每种细胞类型的WT克隆。

表1。

miRAGE对差异表达候选miRNAs的评估

姓名Dicer重量Dicer公司例5P（P）价值
miR-92b3810
miR-590型3020
miR-193b型1210.003415
miR-340型*1120.022446
miR-450型600.031242
miR-618型500.031244

Dicer野生型（WT）和Dicer中的数字e×5列表示在miRAGE库中观察到的规范化标记数。

结束语。

我们的研究提供了实验证据，证明人类基因组中包含的miRNAs数量比以前估计的要多得多(4). 为了确定使用miRAGE可能发现无特征miRNAs的速率，我们模拟了使用分析的标签子集可以检测到的miRNA物种的数量(图6). 尽管已知miRNAs的数量在分析≈50000个标签后明显趋于稳定，但新miRNA的数量似乎在≈270000个标签时呈线性增加。这些观察结果表明，许多新的miRNAs尚待鉴定。

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使用miRAGE发现已知和新的miRNAs。每个点代表已知或新的miRNA的平均数量(年轴），通过分析包含所示miRAGE标签数量的三个模拟子集确定(x个轴）。

因为我们的分析侧重于一种组织类型的细胞，所以对其他细胞和组织类型的类似分析也可能同样具有信息量。我们开发的工具，miRAGE和Dicer例5具有缺陷miRNA处理的细胞应该提供一种简便的方法来识别和验证新的miRNA。随着新的低成本测序方法的不断开发(23–25)，这种方法将对发现人类和其他生物体中存在的miRNAs简编变得越来越有用。

材料和方法

细胞培养和结直肠组织。

将结直肠癌细胞系HCT116、DLD1、RKO、CACO-2、SW480及其衍生物培养在添加10%FCS和青霉素/链霉素的McCoy的5A培养基中。从接受手术的患者中获取结直肠癌组织和匹配的正常结肠上皮的样本，并在手术切除后立即冷冻（<10分钟）。根据1996年《健康保险便携性和责任法案》（HIPAA）规定采集组织标本。

RNA、DNA和RNA/DNA寡核苷酸。

RNA和RNA/DNA寡核苷酸来自Dharmacon Research（科罗拉多州拉斐特）。脱氧核糖核苷酸前面有一个“d.”miRAGE 3′接头：5′-磷酸-UCUCGGAGGUACAUCUUdAdGdAdAdAdGdCdTdGdAdAdTdTdCdGdAdAdGdAdAdAN3-3′；miRAGE 5′连接子：5′-dTdTdTd_GdGdAdTdTd TdGdGd CdTdGd GdCdGdCd AdGdTdAdCdAdCd TdAdGd Gd Cd Td Td GdACUCGAGC；18-base RNA标准：5′-磷酸盐-ACGUUGCACUGAUCACC；26碱基RNA标准物：5′-磷酸盐-CCGGUUCAUCAGUCUAAGAAUCAUG。DNA寡核苷酸从Integrated DNA Technologies（加利福尼亚州圣何塞）获得。miRAGE逆转录引物：5′-TTTTCTGCTCGAATTCAAGCTTCT；LongSage PCR引物（正向）：5′-生物素TTTTTTT GGATTGTGGTGCAGTACA-3′；LongSage PCR引物（反向）：5′-生物素TTTTTTT CTGCTCGAATTCAAGCTTCT-3′。

miRAGE方法用于miRNA鉴定。

第1步：18-26-bp RNA的分离和连接。

按照制造商的方案，使用RNagents试剂盒（Promega）从细胞系/组织样品中分离出总RNA，但没有进行最终75%乙醇清洗。通过在两个15%聚丙烯酰胺TBE/尿素Novex凝胶（Invitrogen）上在180 V下电泳1 mg总RNA以及18和26碱基RNA标准物70分钟，分离出18至26碱基大小范围的RNA。18和26碱RNA标准物经过所有后续连接步骤，作为凝胶纯化的大小标准。用SYBR金核酸凝胶染色剂（分子探针）观察长度从18到26个碱基的RNA，从凝胶中切除，通过18号针孔离心管高速旋转粉碎，并通过在旋转式旋转器上在4°C的0.3 M NaCl中培养凝胶片5小时来提取凝胶。然后将内容物转移到Costar Spin-X离心管过滤器（VWR Scientific）中，旋入新鲜管中，进行乙醇沉淀（通过添加3体积的100%乙醇），并在水中重新悬浮。随后在50°C下用小牛肠碱性磷酸酶（NEB，Beverly，MA）将小RNA去磷酸化30分钟，提取苯酚/氯仿，沉淀re-EtOH，并在37°C下使用T4 RNA连接酶（NEB）连接miRAGE 3′Linker 1小时。在58至66个碱基RNA产物的凝胶纯化和EtOH沉淀（如上所述）后，用T4多核苷酸激酶（NEB）在37°C下磷酸化样品30分钟，提取苯酚/氯仿，EtOH沉淀，并连接（如上所述）到miRAGE 5′连接子。

第二步：标签扩增、分离、串联、克隆和测序。

在对98到106个碱基的RNA产物进行凝胶纯化后，使用miRAGE逆转录引物和SuperScript II RT（Invitrogen）在45°C下逆转录50分钟。随后，扩增、分离、纯化、串联、克隆和测序标签的程序与LongSAGE和数字核型分析中的程序几乎相同，只是miRAGE PCR产物的大小在110到118 bp之间，并且miRAGE标签（非双标记）是从XhoI内切酶（NEB）连接子中释放的。串联克隆的测序在Agencourt（马萨诸塞州贝弗利）通过合同测序进行。使用分成两份序列分析软件（CodonCode，Dedham，MA）和18-26-bp标签通过使用圣哲2000该软件包识别标签之间的断裂酶位点，提取干预标签，并将其记录在数据库中。

miRAGE标签的生物信息学分析。

第1步：将miRAGE标签与已知RNA进行分组和比较。

所有共享一组共11个（共12个）核心内部序列元素的标签被组装成包含所有相关成员的组。进一步分析每组计数最多的标签。分组辅助分析(我)消除罕见的测序错误和(二)去除微小的miRNA变体，因为已知miRNA同时显示5′和3′变异。随后将标签与已知RNA序列（miRNAs、mRNAs和rRNAs等）的数据库进行比较，使用爆炸，并从进一步分析中删除那些与已知序列匹配的标签。2005年9月1日，miRAGE获得的标签与公共数据库进行了比较。随后对这些数据库的添加和更改没有反映在数据分析中。

第二步：候选miRNAs的二级结构分析和发夹稳定性评分。

为了确定潜在的miRNA前体结构，将每个标签与人类基因组序列进行比较。对于具有完全匹配的标签，提取每个标签周围总共75bp（60+15bp）的侧翼基因组序列。由于每个标签有两个可能的前体（即标签可以位于假定发夹的5′或3′臂上），因此从每个标签位置的人类基因组中提取了成对的理论前体，并进行了以下分析。每对前体结构的二级结构和折叠自由能通过使用m折叠3.2(26,27)并与已知miRNAs的值进行比较。用于热力学评估的值是每个前体序列折叠的自由能（ΔG折叠)和ΔG的差值折叠两个可能的前驱体之间（ΔΔG折叠). 利用这些热力学分析对126个已知miRNAs的任意集合进行分析，结果表明，最大ΔG折叠为−22.6，并且没有带有ΔG的miRNAs折叠>−29.0，ΔΔG折叠< 5. 因此，为了使候选的miRNA前体结构被认为是合法的，它必须具备以下两个条件之一(我)ΔG折叠≤−29或(二)−29<ΔG折叠≤−22和ΔΔG折叠> 5. 如果两个前体都满足这些标准，则每对ΔG最低的成员折叠进一步考虑了。随后对到目前为止尚未排除的前体进行分析，以确定它们是否符合普遍接受的miRNA碱激发标准（碱激发涉及miRNA前22个核苷酸中的至少16个和发夹的另一个臂）(18).

步骤3：确定发夹保护。

我们使用加州大学圣克鲁斯分校phastCons数据库将所有候选miRNAs分类为“保守”或“非保守”(28). 这个数据库中有人类基因组中每个核苷酸的得分，这些得分与黑猩猩、小鼠、大鼠、狗、鸡、河豚和斑马鱼中特定核苷酸的保守性程度相对应。该算法基于一个系统发育隐马尔可夫模型，使用每个物种的基因组内最佳配对比对（基于爆炸)然后是八个基因组的多重比对。如果发夹茎中任何15-nt序列中的七个物种的平均相位cons保守性得分至少为0.9，则发夹被定义为保守性(5,29).

候选miRNA与现有miRNA同源性的测定。

生成100个随机的22个mer，并使用SSEARCH搜索算法与miRBase数据库进行比较，获得每个mer的期望值。E类随机生成序列的值范围为0.07至23。随后对所有133个miRNA候选基因进行分析，并用E类值<0.05被认为与现有的miRNAs具有同源性。

miRNA微阵列表达分析。

使用米尔Vana试剂盒（Ambion），用Cy3（胎盘和睾丸）和Cy5（前列腺和大脑）荧光染料标记。将成对的标记样品与双通道微阵列杂交。在μParaFlo微流控芯片上进行微阵列分析，每个检测探针包含与特定microRNA序列互补的编码片段核苷酸序列，以及将检测探针延伸至远离底物的长非核苷酸分子间隔区。通过加入不同数量的修饰核苷酸来平衡检测探针的熔化温度，这些核苷酸具有更高的结合亲和力。背景探针的最大信号水平为180。miRNA检测信号阈值被定义为最大背景信号的两倍。

定量RT-PCR（qRT-PCR）表达分析。

使用SuperTaq聚合酶（Ambion）和米尔Vana qRT-PCR miRNA检测试剂盒（Ambion）遵循制造商的说明。反应包含定制设计的寡核苷酸DNA引物（集成DNA技术），对36种新的假定miRNAs或米尔Vana qRT-PCR引物集针对hsa-miR-16、hsa-miR-24、hsa-milR-143或人类5S rRNA的特异性作为阳性对照。对于每组引物，100 ng FirstChoice人类结肠肿瘤/正常邻近组织RNA（Ambion）；含有50 ng HCT116、RKO和DLD-1细胞系总RNA的池；含有50 ng来自人脑、子宫颈、胸腺和骨骼肌（Ambion）的FirstChoice总RNA的水池；和无模板阴性对照进行测试。所有RNA均用TURBO DNA酶处理。qRT-PCR在ABI7000热循环器（Applied Biosciences）上进行，终点反应产物也在用溴化乙锭染色的3.5%高分辨率琼脂糖凝胶（Ambion）上进行分析，以区分正确的扩增产物（≈90 bp）和潜在的引物二聚体。

有针对性地干扰人类Dicer基因座.

使用AAV载体创建淘汰赛的策略如下所述(30,31). 靶向结构pAAV-Neo-Dicer公司以细菌人工染色体克隆CITB 2240H23（Invitrogen）为同源臂模板，通过PCR方法制备。在第5外显子中进行了靶向插入，该外显子是解旋酶结构域的一部分。如有要求，作者可提供载体设计和所有PCR引物序列的详细信息。稳定的G418抗性克隆最初是在有Geneticin（Invitrogen）的情况下选择的，然后在没有选择剂的情况下常规繁殖。

差异表达的测定。

使用Fisher精确检验（显著性阈值）对来自不同库的标签号进行标准化和比较P（P）=0.05）带Bonferroni校正(32).

补充材料

支持信息：

致谢

我们感谢Levy Kopelovich的有益讨论，感谢David Wong的序列分析和引物设计。这项工作得到了斯特朗癌症预防中心、国家癌症研究所癌症预防司、路德维希信托基金、皮尤慈善信托基金和国家卫生研究院拨款CA057345的支持。

缩写

微小RNA微小RNA
SAGE公司基因表达的系列分析
米拉吉微RNA SAGE
Dicer公司例5Dicer公司外显子5断裂株
qRT-PCR（定量RT-PCR）定量RT-PCR。

脚注

利益冲突声明：K.W.K.和V.E.V.从Genzyme获得研究资金，K.W.K.、V.E.V和Johns Hopkins University拥有Genzymen股票，这受到Johns Hopbins Uni大学政策的某些限制。K.W.K.和V.E.V.也是Genzyme的付费顾问。这项安排的条款由约翰·霍普金斯大学根据其利益冲突政策进行管理。

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文章来自美国国家科学院院刊由以下人员提供美国国家科学院