声波刺猬信号通过抑制Gli2的加工和降解调节其转录活性^†

细胞培养、转染、蛋白质分析和报告分析。

HEK293细胞、小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）（来自胚胎第13.5天[E13.5]胚胎）和鸡肢芽细胞的细胞培养条件和转染方法如前所述(56). 为了诱导Gli2和Gli3磷酸化、降解和加工，用双脱氧佛尔斯科林（ddFSK）（40μM）（对照）、佛尔斯科林（FSK）隔夜或冈田酸（OKA）（100 nM）单独或与环己酰亚胺（CHX）（10μg/ml）一起处理细胞，处理时间如图所示。对于ShhN诱导，细胞在无血清培养基中生长24小时，然后添加含有或不含ShhN蛋白的条件培养基（1/10[vol/vol]）16至24小时。为了确定Gli2多泛素化，用MG132（50μM）处理细胞3 h，在6孔板孔中用100μl变性缓冲液（0.5%十二烷基硫酸钠[SDS]，50 mM Tris[pH7.5]，0.5 mM EDTA，1 mM二硫苏糖醇）溶解。在100°C下培养5分钟后，用裂解缓冲液将裂解产物稀释10倍，然后进行共免疫沉淀，然后进行免疫印迹分析。使用亲和性Sepharose微球结合含有Gli结合位点的双链寡核苷酸，实现βTrCP与磷酸化Gli2蛋白的共沉淀(2,28)由以下寡核苷酸序列组成：A1 Gli结合位点为5′-TGG GCG AAG ACC ACC CAC AAT GA-3′（正义）和5′-ACC ATC ATT GTG GGT GGT CTT CG-3′（反义）；B1 Gli结合位点为5′-GAT CCG TGG ACC CAA GAC GAA ATT-3′（正义）和5′-GTA CAA TTT CGT CTT GGG TGG TCC ACG-3′（反义）；非特异性Gli结合位点为5′-GAT CAC AGA TAC ATC TCT CAG ACT GC-3′（义）和5′-GTA CGC AGT CTG AGA GAT TCT GT-3′（反义）。免疫印迹（抗Gli2抗血清）（1:1000稀释）和报告试验的结果如图所示。​图11如前所述(56). 报告者使用Gli3公司^X吨通过将0.25μg 8×Gli-binding site荧光素酶报告子和12 ng TK转染细胞，在24孔板中进行MEF-雷尼利亚萤光素酶和0.25μg pSRα-Gli1，小鼠Gli1表达构建体，或0.25μg pSRα-Gli1和0.5μg pSuper-Gli1 RNA干扰（RNAi）或pSuper-GFP构建体对照。通过用Dulbecco改良的Eagle’s培养基-N2补充剂培养细胞24小时，然后用ShhN条件培养基（1/10[vol/vol]）培养过夜或指定的时间量，完成Shh诱导。用于构建pSuperRNAi构建物的寡核苷酸如下：Gli1 RNAi-2（sense，5′-GAT CCC CCT CCA CAG GCA CAC AGG ATT TCA AGA GAA TCC TGT GTG CCT GTG GAG TTT TTA-3′；antisense，5′-AGC TTA AAA ACT CCA GCA CAC-AGG ATT-CTC TTG AAA CCA GCG GCA AAA TCC GTG GTG GTG-3′）和绿色荧光蛋白（GFP）RNAi（有义，5′-GAT CCC CGC TAC CTG TTC CAT GGC CAT TCA AGA GAT GGC CAT GGA ACA GGT AGC TTT TTA-3′；反义，5′-AGC TTA AAA AGC TAC CTG TTC CAT GGC CAT CTC TTG AAT GGC CAT GGA ACA GGT AGC GGG-3′）。

在单独的窗口中打开

图1。

Gli2和Gli3蛋白质的差异加工。（A） Gli2抗体的特性。从具有指定基因型的E10.5小鼠胚胎中制备蛋白质提取物，并用针对面板下方所示抗原的抗Gli2抗体（αGli2）进行免疫印迹。αGli2抗体仅在野生型或Gli2公司^勒兹基/+杂合胚胎，但不是Gli2公司^{利兹基/利兹基}纯合胚胎。（B） Gli2和Gli3在体内的处理方式不同。将从E10.5小鼠胚胎制备的蛋白质提取物与含有特异性（Gli-B1）或突变（mut）Gli结合位点的生物素化双链寡核苷酸孵育。与寡核苷酸结合的蛋白质被链霉亲和素结合的磁珠拉下。将反应混合物分成两半后，用αGli2和αGli3抗体进行免疫印迹检测蛋白质。全长和加工形式的Gli2和Gli3蛋白质（箭头所示）仅由Gli-B1而非Mut珠拉下。（C） 柱状图显示了Gli2或Gli3蛋白质全长与加工形式的比率。（D） Gli2-78是一种转录抑制因子。用Gli-dependent荧光素酶报告基因TK转染鸡肢体芽细胞微粒体-雷尼利亚（转染对照），以及如图所示的效应器结构。数据表示来自三个独立实验的归一化荧光素酶活性。

抗体生产和内源性Gli2和Gli3蛋白的检测。

用GST-Gli2-328-430（Covance，Inc.）免疫兔子，获得Gli2抗血清。将抗血清通过谷胱甘肽后，使用GST-Gli2-328-430融合柱亲和纯化抗体S公司-转移酶（GST）柱。

Shh突变体(12)E10.5的野生型小鼠胚胎在放射免疫沉淀缓冲液（用于直接印迹）或裂解缓冲液（富集Gli蛋白）中进行裂解。为了丰富Gli蛋白，2μg生物素化双链寡核苷酸包含Gli-B1或突变的Gli-B1序列(28)首先结合到与磁珠结合的链霉亲和素（新英格兰生物实验室）。生物素化的Gli-B1序列为5′-生物素-GAC GCG TGG ACC CAA GAC GAA ATT CAC A-3′（有义）和5′-TGT GAA TTT CGT CTT GGG TGG TCC ACG CGT C-3′（反义），突变的Gli-B1序列为5’-生物素-GAC GCG TGG-ATT ACC TAA GAA ATT-CAC A-3'（有义。将两到三个胚胎的蛋白质提取物与镁-β-亲和素结合的寡核苷酸在4°C下孵育1小时。用裂解缓冲液洗涤磁珠三次，并用含有1 M NaCl的相同缓冲液洗脱蛋白质。如前所述，使用亲和纯化的抗Gli2或抗Gli3抗体（1:200）进行免疫印迹(56)除了使用Gli2免疫印迹生物素结合抗兔免疫球蛋白G二级抗体和辣根过氧化物酶结合抗生物素三级抗体外（Jackson ImmunoResearch Laboratories）。

使用βTrCP进行RNA干扰实验。

如前所述，使用人βTrCP进行小干扰RNA（SiRNA）实验(16).

磷酸化诱导Gli2降解。

我们之前已经证明Gli3的加工依赖于六个PKA位点的磷酸化(56). 最近的两项研究表明，Ci处理需要PKA引发邻近PKA位点簇的多个CK1和GSK3位点的磷酸化(22,45). 我们发现，与Gli3和Ci一样，Gli2在转染细胞和胚胎中也被过度磷酸化（图。2B至D)尽管其磷酸化程度可能不同，因为培养细胞中的Gli2磷酸化是由刺激PKA活性的FSK或磷酸酶抑制剂OKA诱导的。磷酸化依赖于前四个PKA位点，这四个位点启动相邻GSK3和CK1位点的磷酸化，因为这些位点的突变消除了缓慢迁移的Gli2-185物种和体外磷酸化程度（图。2E和F).

在单独的窗口中打开

图2。

体内外Gli2蛋白磷酸化。（A） 图中显示了Gli2蛋白和氨基酸序列区域的示意图，包括PKA（粗体）和初级GSK3（圆圈）和CK1（盒装）磷酸化的S残基。一旦主要GSK3和CK1位点磷酸化，可能成为GSK3与CK1磷酸化最佳位点的Ser残基在代表残基的字符上用线表示。Gli2序列下方显示的三个Gli2突变体在PKA位点1-4（Gli2P1-4）、GSK3位点2-4（Gli2N2-4）或CK1位点1-4（Gli2C1-4）中包含S-to-A变化。（B） 免疫印迹显示，经FSK或OKA处理后，Gli2蛋白在原代鸡肢芽细胞中过度表达，其迁移发生改变。（C和D）Gli2被磷酸化。λ蛋白磷酸酶（λPPase）处理显示，来自转染细胞（C）或E10.5小鼠胚胎（D）的Gli2-185蛋白的缓慢迁移物种代表磷酸化形式。（E） 免疫印迹显示，Gli2的迁移速度比其突变体Gli2P1-4、Gli2N2-4和Gli2C1-4慢，这些突变体包含点突变，如图A（F）PKA引发的Gli2体外磷酸化所示。亲和纯化的GST或融合蛋白在非放射性ATP存在下与PKA或不与PKA孵育。去除PKA后，将蛋白质与CK1或GSK3孵育，或在未经处理的情况下孵育[γ]-³²P] ATP并通过放射自显影术检测（暴露3小时）。箭头指向仅由CK1磷酸化的GST-Gli2PR的弱信号，暴露6小时后很容易看到（数据未显示）。

为了确定Gli2磷酸化的重要性，我们通过用FSK或OKA培养转染鸡肢芽细胞的原代培养物来诱导Gli2的磷酸化。选择鸡腿芽细胞原代培养的原因如下。首先，这些细胞能够响应Shh信号并表达Gli2 RNA（参考文献56和数据未显示）。第二，尽管由于我们的Gli2抗体不能识别鸡Gli2蛋白（数据未显示），我们无法直接显示内源性Gli2被处理，但仍有可能Gli2在这些细胞中被处理，因为Gli3也被处理(56). 最后，这些细胞很容易被转染。FSK处理未导致检测到处理过的Gli2水平（图。​（图3A；第3页; 将车道2与车道3进行比较），即使它很容易导致Gli3处理（将车道5与车道6进行比较）。令人惊讶的是，OKA治疗导致Gli2-185水平在4小时内迅速降低（图。​（图2B）。2B型). 应该注意的是，在FSK处理条件下未检测到Gli2降解的原因可能是FSK处理可以以某种方式增加Gli2 RNA的水平（参见补充材料中的图S1）。为了确定Gli2-185减少的速度，我们在不同的时间点用OKA和CHX（蛋白质合成抑制剂）处理原代培养物。治疗1小时后，Gli2-185蛋白水平降低了近一半（图。​（图3B；3B公司; 比较3号线和2号线以及图表），随着治疗的继续，Gli2-185的水平下降得更厉害（图。​（图3B，3B公司，车道4）。OKA诱导的Gli2-185水平降低似乎是Gli2独有的，因为相同的治疗只会略微降低Gli3-190蛋白的水平（图。​（图3B，3B公司、右侧面板和图形）。有趣的是，即使全长Gli2蛋白水平降低了一半以上，加工的Gli2蛋白质仍然没有被检测到（图。​（图3B，3B公司，左侧面板）。这一结果可以用两种潜在机制来解释。一种解释是，全长Gli2蛋白在过度磷酸化后发生降解；另一种解释是，全长Gli2被处理，但处理后的Gli2肽太不稳定，无法检测到。为了区分这两种蛋白中哪一种更有可能，我们检测了Gli2-1-676在原代鸡肢芽细胞中的稳定性，发现它比全长Gli2蛋白更稳定（图。​（图3D）。三维). 因此，我们得出结论，磷酸化的Gli2-185蛋白会快速降解。

在单独的窗口中打开

图3。

磷酸化诱导的Gli2降解。如图所示（A、B和D），用Gli2、Gli3或Gli2-1-676转染鸡肢体芽细胞。转染细胞和未转染MEF（C）与FSK或对照药物ddFSK培养过夜（A）或与OKA和CHX培养不同时间点（B、C和D）。从处理过的细胞中制备蛋白质提取物，并使用7%的SDS-PAGE直接分离，用于用指示的抗体进行免疫印迹。对B组和C组中的Gli2-185和Gli3-190蛋白质水平进行量化，并在凝胶下方绘制。

为了排除OKA诱导的Gli2磷酸化和降解可能是由于Gli2过度表达造成的，并确定Gli2降解是特异性的，我们检测了经OKA和CHX处理后MEF原代培养物中内源性Gli2和Gli3蛋白的命运。由于MEFs中内源性Gli2蛋白的水平较低，我们在免疫印迹之前通过使用Gli结合珠的下拉实验富集了Gli2和Gli3（对照）蛋白。正如在鸡肢芽原代培养物中过度表达的全长Gli2和Gli3蛋白所示，Gli2-185蛋白的水平迅速降低，但Gli3-190蛋白的水平没有降低（图。​（图3C；3C公司; 将左侧面板与右侧面板进行比较）。即使OKA和CHX治疗将Gli2-185蛋白的水平降低到Gli2-185%初始量的四分之一左右，也未检测到Gli2-78蛋白（图。​（图3C，3C公司、左面板和图形）。Gli3的加工形态水平没有明显变化（图。​（图3C，3C公司，右侧面板）。因此，根据已知的Gli3处理的磷酸化要求，我们得出结论，磷酸化特异性诱导Gli2降解，并且Gli2的磷酸化也可能是在体内将Gli2-185加工成Gli2-78所必需的。

为了确定Gli2中的PKA、CK1和GSK3位点是否参与Gli2降解，我们将Gli2的降解速率与Gli2突变株Gli2P1-4（前四个PKA位点突变）、Gli2N2-4（三个GSK3突变）和Gli2C1-4（四个CK1突变）的降解速率进行了比较（图。​（图2A）。2安培). OKA和CHX处理转染细胞后，野生型Gli2的总体水平显著降低，磷酸化Gli2物种显著积累，但对这些Gli2突变体的磷酸化水平和程度影响甚微（参见补充材料中的图S2）。Gli2的降解必须由磷酸化引起，而不是由无意的药理学处理引起，因为在没有OKA和CHX处理的情况下对Gli2蛋白降解的脉冲追踪分析也表明野生型Gli2不如Gli2P1-4、Gli2N2-4和Gli2C1-4突变体稳定（见图补充材料中的图S2）。

磷酸化降低Gli2转录激活物功能。

为了测试磷酸化诱导的Gli2降解和/或加工是否影响Gli2作为转录激活剂的活性，我们通过使用基于鸡肢芽显微组分的报告基因分析将野生型Gli2的转录激活剂功能与Gli2P1-4、Gli2C1-4和Gli2N2-4突变体的转录激活剂功能进行了比较(56). 转染的野生型Gli2蛋白激活了一个Gli依赖型荧光素酶报告子，使其活性增加了近8倍，而三个Gli2突变体中的每一个都激活了报告子，活性增加了约12倍（参见补充材料中的图S2）。由于内源性Gli2在生理条件下被降解和/或加工，因此Gli2转录活性的增加在体内意义重大。因此，我们的数据表明，Gli2磷酸化对其作为转录因子的转录活性有显著影响。

Gli2降解依赖于βTrCP活性。

SCF^βTrCP复合物是一种泛素E3连接酶，它只通过βTrCP亚单位识别磷酸化的蛋白质底物，已被证明参与许多蛋白质的降解和加工(59). 由于Gli2降解依赖于磷酸化，而Ci处理需要Slimb活性，我们询问βTrCP是否参与Gli2的降解。选择HEK293细胞来解决这个问题，因为βTrCP-siRNA已被成功用于抑制这些细胞中βTrCP RNA的表达(16). 如图所示。​图4A，4A级当只有Gli2表达时，FSK处理诱导了高磷酸化Gli2物种的积累，但当Gli2和βTrCP同时表达时却没有这样做（比较通道4和通道3）。与这一发现一致，当βTrCP与Gli2磷酸化位点突变体Gli2P1-4、Gli2C1-4或Gli2N2-4在细胞中共表达时，βTrCP对任何突变体蛋白质的表达水平几乎没有影响（5到10道）。这些结果表明，βTrCP过度表达可以以磷酸化依赖的方式促进Gli2降解。

在单独的窗口中打开

图4。

Gli2降解需要βTrCP。（A） βTrCP的过度表达促进Gli2降解。在使用面板上所示的构建物进行转染后，HEK293细胞在不使用FSK或使用FSK培养过夜。分别用αGli2和αtubulin抗体免疫印迹法检测Gli2蛋白和tubulin。请注意，βTrCP的共表达消除了Gli2的过度磷酸化物种（用白色箭头表示；将通道4与通道3进行比较），但对Gli2突变体的水平几乎没有影响。（B） βTrCP RNAi抑制Gli2降解。将Gli2单独转染HEK293细胞（第2道）或与βTrCP siRNA或GFP siRNA（对照）一起转染（第3道和第4道），并用OKA和CHX处理。用αGli2抗体免疫印迹法测定Gli2的表达（上图）。βTrCP RNAi的有效性通过RT-PCR（两个下部面板）确定。

为了进一步验证βTrCP确实是Gli2降解所必需的，我们用靶向βTrCP1和βTrCP2的βTrCP（βTrCP-siRNA）或GFP（GFP-siRNA）与Gli2的siRNA共转染HEK293细胞。如前所述，我们的RT-PCR分析证实了βTrCP RNAi的有效性（图。​（图3B）3B公司) (16). 免疫印迹结果显示，βTrCP RNAi，而不是GFP RNAi，导致Gli2蛋白水平的增加（图。​（图3B），3B公司)表明βTrCP确实是Gli2降解所必需的。

βTrCP与磷酸化的Gli2蛋白直接相互作用。

尽管已经表明Ci处理需要Slimb(24)在Ci处理中，Slimb和磷酸化之间的相互作用尚不清楚。Slimb仍有可能通过未知因素间接参与Ci处理(35). SCF的许多其他蛋白质底物的研究^βTrCP复合物证明，βTrCP通过DSpGX2-4Sp基序识别磷酸化底物，其中Sp指磷酸丝氨酸，X指任何残基(8,30,31,60,61). SCF的绑定^βTrCP与底物的复合导致泛素酶和蛋白酶体对底物的多泛素化和降解。

由于Gli2蛋白在多个S残基上被PKA、CKI和GSK3磷酸化，并且Gli2降解需要βTrCP，因此我们假设βTrCP可以直接结合磷酸化的Gli2蛋白质。为了验证这一假设，我们检测了转染HEK293细胞中myc-mβTrCP与Gli2或Gli2P1-4、Gli2N2-4和Gli2C1-4突变体之间的蛋白质-蛋白质相互作用，因为这些细胞表达高水平的用于转染的Gli2构建体。仅当Gli2和myc-mβTrCP共表达时，与含有Gli-binding位点的双链寡核苷酸（Gli-bining beads）偶联的Sepharose beads才能共沉淀myc-m。​（图5A，5A级，底部面板；比较车道4和车道3）。类似地，myc抗体只能联合免疫沉淀野生型Gli2蛋白（图。​（图5A，5A级，底部第二个面板；比较通道4和通道6、8和10），表明βTrCP以磷酸化依赖的方式与Gli2相互作用。

在单独的窗口中打开

图5：。

βTrCP与磷酸化的Gli2直接相互作用。（A） βTrCP在体内结合磷酸化的Gli2。HEK293细胞转染了如面板所示的结构体。转染后一天，在细胞溶解之前，用FSK和MG132培养细胞过夜并培养3小时。两个上部面板显示使用所示抗体进行的直接裂解物免疫印迹。用抗myc抗体对裂解产物进行免疫沉淀，然后用抗Gli2抗体进行免疫印迹（底部第二个面板）或用含有特异或非特异性Gli-binding位点的双链寡核苷酸与Sepharose珠结合沉淀，然后用抗myc抗体进行免疫印迹（底图）。（B） βTrCP在体外与磷酸化的Gli2相互作用。在所示激酶体外磷酸化后，GST融合蛋白（见图。2A和F)用以下拉经体外翻译的myc-mβTrCP或myc-mαTrCPΔWD中的放射性标记物，然后通过放射自显影术检测。

为了确定Gli2和βTrCP之间的相互作用是否直接，我们检测了磷酸化GST-Gli2PR（GST和含有前四个PKA位点和相邻CK1和GSK3位点的Gli2片段之间的融合）体外下拉βTrCP蛋白的能力。βTrCP仅与单独由CK1或PKA、CK1和GSK3一起磷酸化的GST-Gli2PR相互作用，而不单独由PKA或GSK3相互作用（图。​（图5B，5亿，车道1至4）。单独被CK1磷酸化的GST-Gli2PR在体外也可以下调βTrCP，这一观察结果并不令人惊讶，因为我们发现CK1在体外可以弱磷酸化GST-Gli2PR，而不需要PKA引发（图。​（图2F，2英尺，车道4，数据未显示）。

为了进一步了解Gli2PR和βTrCP之间的相互作用，我们使用与所有三种激酶孵育的GST-Gli2MR-P1-4、GST-Gl2PR-C1-4和GST-Gly2PR-N2-4突变体进行了相同的结合实验。令人惊讶的是，只有GST-Gli2PR-N2-4不能结合βTrCP，而GST-Gl2PR-P1-4和GST-Gli2PR-C1-4都能结合βTrCR（图。​（图5B，5亿，车道5至7）。该结果与我们的体内结合结果一致，表明N2或S801和S840残基直接参与βTrCP结合，而PKA位点和CK1位点起启动作用（见下文）。应该指出，CK1的识别基序是SpX1-3S，Sp和受体S之间的两个残基比一个或三个残基更有效(15). 突变的四个CK1位点属于最优基序。当对位于Sp以外的一个或三个残基的丝氨酸进行计数时，即使是N2和N4也可以在体外被CK1磷酸化。因此，GST-Gli2PR-P1-4和GST-Gl2PR-C1-4仍然可以结合βTrCP就不足为奇了，因为CK1可以磷酸化许多S残基，包括不符合最佳CK1共识序列的N2-4位点，并且因为其中一些位点的磷酸化不依赖于体外PKA或GSK3位点的磷酸化度（图。​（图2F，2英尺，通道4和8，以及未示出的数据）。因此，我们的体外结合数据表明，βTrCP直接结合磷酸化的Gli2。

为了确定Gli2中的βTrCP结合位点，我们检测了单个PKA（指定为P1、P2、P3和P4）、GSK3（指定为N2、N3和N4）或CK1（指定为C1、C2、C3和C4）位点发生单一突变的Gli2蛋白与myc-mβTrCP的结合情况（图。​（图6A）。6A级). 我们一致发现P1、P2或P4突变显著降低了myc-mβTrCP结合，而P3突变似乎没有什么影响（图。​（图6B，6亿，车道3、4和6）。与这一发现一致，我们还发现C1、N2或N4突变显著降低了βTrCP结合（图。​（图6B，6亿，车道7、11和13），但C2、C3、C4或N3没有（图。​（图6B，6亿，8至10车道和12车道）。综上所述，这些数据表明该区域至少存在两个βTrCP结合位点，一个位于第一和第二PKA位点之间，另一个位于第三CK1位点（不包括）和第四PKA位点间。

在单独的窗口中打开

图6。

Gli2中βTrCP结合位点的鉴定。（A） Gli2图（见图。​图22标题）表示用于面板B的Gli2突变体。每个Gli2突变都包含序列中相应S残基的A残基替换。两条粗线划出面板B中绘制的两个βTrCP结合位点。图中显示了Gli2中βTrCP的结合位点与已知的βTrCP绑定基序之间的对齐。（B） Gli2中两个βTrCP结合位点的鉴定。将每个所示的Gli2构建物以及myc-mβTrCP转染HEK293细胞。如图所示，测定了Gli2蛋白和βTrCP之间的相互作用。​图5A5A级.

为了确定潜在的βTrCP结合基序，我们仔细检查了P1、P2、P4、C1、N2和N4位点周围的氨基酸序列，发现两个序列与已知的βTrCP-结合基序相似。第一个序列792STMSSAYTVS801以C1开始，以N2结束（图。​（图6A）。6A级). 当C1被磷酸化时，S795和S796残基都可能成为潜在的CK1靶点，尽管S796对CK1磷酸化不太理想(15). 磷酸化后，序列变成792SpTMSpSpAYTVSp电视台801，其中下划线序列类似于已知的βTrCP结合基序，因为Sp795残基和D残基一样带负电。第二个序列是831，从S831开始，到N4结束SSAD公司SYDPISTDAS844，其中下划线部分是CK2磷酸化的共有序列（S/TXXD/E）(38). 当S831被CK2磷酸化时，S835可能成为CK1磷酸化的位点，即使它不是最优的，而当位点N4或S844被GSK3磷酸化时S840可能被GSK2磷酸化。结果，序列变为831SpSADSpYDPISp公司TDASp844，其中带下划线的序列类似于已知的βTrCP结合基序DSpGX2-4Sp。

为了测试上述预测，我们将A残基引入位置795、796、831、835和840的单个S残基中，以创建Gli2（S795A）、Gli2。​（图6A），6A级)分别检测这些突变体与转染HEK293细胞中myc-mβTrCP的相互作用。正如预测的那样，myc-mβTrCP与Gli2（S795A）或Gli2。​（图6B；6亿; 将通道17和18与通道15进行比较）。同样，Gli2（S831A）、Gli2或Gli2突变体结合βTrCP的能力也显著降低（图。​（图6B，6亿，将21至23号车道与20号车道进行比较）。因此，我们的分析揭示了Gli2:792SpTM中的两个βTrCP结合基序（下划线）SpSpAYTVSp电视台801和831SpSADSpYDPISp公司TDASp844。

细胞中的Gli2蛋白是多泛素化的。

我们的发现是蛋白质磷酸化诱导Gli2降解，这需要SCF^βTrCP活性，与Gli2通过泛素化和蛋白酶体途径降解的概念一致。因此，我们测试了细胞中Gli2是否是多泛素化的。对过度表达Gli2（对照）、myc-ub（myc-tagged ubiquitin）（对照）或Gli2和myc-ub的HEK293细胞进行MG132（一种特异性蛋白酶体抑制剂）治疗。用抗Gli2抗体免疫沉淀Gli2，然后用抗myc免疫印迹检测泛素化蛋白，以检测Gli2的泛素化。只有当Gli2和myc-ub同时表达时，才检测到myc-ub蛋白，而只有Gli2或myc-ubs单独表达时，检测到myc-ub蛋白（参见补充材料中的图S3；将通道4与通道2和3进行比较）。Gli2的多泛素化依赖于磷酸化，因为Gli2P1-4、Gli2C1-4或Gli2N2-4突变体未检测到多泛素（参见补充材料中的图S3；比较通道6、8和10）。

Shh信号抑制Gli2降解和处理。

在飞行中，Ci处理被Hh信号抑制(4,10). 同样，Shh信号传导阻断脊椎动物中Gli3的蛋白水解过程(18,34,56). 为了确定Gli2加工是否受Shh信号调节，我们检测了野生型和嘘使用Gli结合珠沉淀Gli蛋白后，通过免疫印迹法检测突变小鼠胚胎。作为对照，我们还检测了同一沉淀Gli蛋白中两种形式的Gli3的水平，因为已知Gli3加工在Shh突变胚胎中受到抑制(34). 由于Shh突变胚胎比野生型胚胎小，Gli2蛋白水平也低于野生型胚胎（见下文），因此调整了Shh突变胚的蛋白裂解物数量，以提取足够数量的Gli2-78进行检测。年的Gli2-78水平嘘突变体略高于野生型胚胎（图。​（图7A；第7章; 比较车道3和2），而Gli3-83的水平嘘突变体显著高于野生型胚胎（图。​（图7A；第7章; 比较车道6和车道5），这与之前报告的一致(34). 对Gli2和Gli3蛋白带强度的定量分析表明，野生型胚胎中Gli2-185与Gli2-78的比值约为6.4比1，Shh突变体中为4.8比1，而野生型胚胎的Gli3-190与Gli3-83的比值为1.28比1嘘突变体（图。​（图7B）。7亿). 从这些结果中，我们得出结论，Gli2和Gli3蛋白的加工均受到Shh信号的抑制，但Gli2加工的抑制程度明显低于Gli3加工。

在单独的窗口中打开

图7。

Hh信号传导抑制Gli2的加工和降解，并在体内诱导Gli2的转录活性。（A和B）Shh信号对Gli2和Gli3处理的差异调节。如图所示，在Shh突变和野生型（WT）小鼠胚胎中富集和检测内源性Gli2和Gli3蛋白。​图11图例。面板B显示了Gli2-185与Gli2-78的比率（黑色条），Gli3-190与Gli3-83的比率（灰色条），以及嘘突变体和野生型（Shh突变体/WT）。（C和D）通过Shh信号稳定Gli2蛋白。上面的两个面板显示了Gli2-185蛋白水平的直接免疫印迹，α-微管蛋白作为E10.5野生型（WT）和嘘突变体(嘘^−/−)用或不用ShhN条件培养基处理的小鼠胚胎和指示细胞。下面的两个面板显示了相应细胞和小鼠胚胎中Gli2和actin mRNA的表达。Gli2蛋白和RNA的相对水平绘制在面板D中。（E）ShhN处理稳定了野生型MEF中的内源性Gli2-185蛋白。（F） Shh信号在体内诱导Gli2转录活性。Gli3公司^X吨突变体MEF被转染了一种依赖于Gli-荧光素酶的报告基因TK-雷尼利亚（转染对照），有或没有Gli1 RNAi-2构建物。显示接受ShhN处理的细胞。萤火虫荧光素酶活性数据来自三个独立的实验。

由于蛋白质磷酸化诱导Gli2快速降解，我们接下来确定Gli2降解是否也受Shh信号调节。在之前的实验中，调节来自Shh突变胚胎的蛋白质裂解物的量，以提取足够的Gli2-78蛋白质进行检测。尽管使用这种浓缩方法导致全长与加工的Gli2的比率几乎没有变化，因为同一裂解液中的两种Gli2同时被去除，这种方法可能会导致测定小鼠胚胎裂解液中Gli2-185蛋白的实际水平发生变化，因为从Shh突变和野生型胚胎中提取Gli2-185的过程必须在两个不同的试管中进行。为了测定Shh突变体和野生型胚胎中的Gli2-185水平，我们直接使用从E10.5野生型和嘘突变小鼠胚胎。野生型胚胎（包括嘘杂合子）比嘘突变胚胎（图。​（图7C，7摄氏度，上部面板，通道5和6，以及图。​图7D），第7天)尽管根据微管蛋白水平测量，装载了类似数量的蛋白裂解物（图。​（图7C，7摄氏度，从顶部开始的第二排面板，第5至6车道）。Gli2-185水平的差异应该是由Gli2蛋白的翻译后调节引起的，因为Northern blot分析表明Gli2公司mRNA表达不受嘘突变（图。​（图7C，7摄氏度，两个下部面板行，通道5和6，以及图。​图7D）。第7天). 值得注意的是，野生型胚胎裂解物中的两条不同的Gli2-185条带并不总是被检测到。尽管这与Shh信号可能调节Gli2磷酸化状态的观点一致，但Gli2-185潜在不同物种的分子性质仍有待确定。由于在野生型小鼠胚胎中，Gli2-185的水平是Gli2-78的六倍多，而且Shh信号只会略微降低Gli2-75的水平（图。7A和B)，野生型胚胎和Shh突变体之间Gli2-185水平的差异不能仅用Gli2-78转化为Gli2-185Shh信号导致Gli2处理减少来解释。综上所述，这些结果表明，除了Gli2加工外，Shh信号还调节Gli2蛋白的稳定性。

为了确定Gli2-185蛋白水平是否由Shh信号直接调节，在野生型MEF中检测了Shh刺激的Gli2稳定性，Gli3公司^X吨MEF和NIH3T3细胞。我们发现，Shh刺激导致两种细胞中Gli2-185蛋白水平增加两倍以上Gli3公司^X吨MEFs和NIH3T3细胞，尽管Gli2 RNA表达没有受到影响（图。7C和D). 然而，我们还发现，Shh处理在某种程度上导致野生型MEF中的Gli2 RNA水平略有增加，此外Gli2-185蛋白水平也有所增加（数据未显示）。因此，我们将野生型MEFs与含有或不含有ShhN的条件培养基在CHX存在下孵育，CHX阻断蛋白质合成。直接免疫印迹分析表明，在CHX和ShhN处理的细胞中，Gli2-185蛋白水平显著降低，但在CHX与ShhN治疗的相同细胞中，其变化不明显（图。​（图7E）。第七版). 综上所述，这些结果表明Shh信号传导稳定Gli2-185蛋白。

我们感谢Zhijian J.Chen（德克萨斯大学西南医学中心，达拉斯，德克萨斯州）构建小鼠βTrCP表达载体，感谢Philip A.Beachy（约翰霍普金斯大学医学院）和Kathryn Anderson（斯隆-凯特琳癌症中心）构建小鼠嘘和X吨突变小鼠。

A.L.J.是霍华德·休斯医学研究所的研究员。这项工作得到了康奈尔大学威尔医学院的启动基金和国家卫生研究院对B.W.的拨款（R01 GM70820）的支持。