上皮细胞通常是最初被呼吸道病毒感染的主要细胞类型，这种病毒-宿主细胞相互作用可导致抗病毒反应，如细胞因子诱导或凋亡，从而影响子代病毒向其他细胞或组织的传播。我们之前对上皮细胞的研究结果表明，副流感病毒猴病毒5（SV5）和一种激活抗病毒反应的工程P/V基因突变株感染副流感病毒猴子病毒5（抑制上皮细胞抗病毒反应）的结果存在显著差异(52). 呼吸道病毒也可以感染专业抗原呈递细胞（APC），这是一种在协调先天和适应性免疫反应中发挥关键作用的细胞类型(34,40). 这种病原细胞间的相互作用对病毒的免疫应答尤其重要，因为病毒是否抑制APC中的抗病毒反应，或APC是否抑制病毒感染，都可能是后续适应性免疫应答的重要决定因素(22,28). 在本研究中，我们探讨了在树突状细胞（DC）感染期间，上皮细胞中已建立的野生型（WT）和突变型SV5表型是否也明显，以及这些病毒是否对感染DC的功能有不同的影响。
DC是关键的专业APC，能够识别微生物产品以启动先天性和适应性免疫反应(5,44). DC可以通过激活抗病毒固有免疫反应来应对病毒感染，例如产生I型干扰素（IFN），这可以限制病毒的生长(7). 最重要的是，检测到病毒感染的DC也可以作为其他免疫细胞的有效激活剂。未成熟DC的病毒感染可触发一系列细胞信号事件，导致具有未成熟表型的DC转化为能够激活原始T细胞功能的成熟形式，包括增殖、细胞因子分泌和细胞溶解活性。这些DC成熟事件包括共刺激分子（如CD40、CD80和CD86）的细胞表面表达增加，抗原捕获受体下调，以及分泌免疫调节细胞因子（如白介素-12（IL-12）、白介素-6、IL-8和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的能力增加(5,44).
病毒感染的清除和长期适应性免疫的发展取决于感染时适当的先天性和适应性反应(6,7,22)，和DC在连接这两个免疫臂方面发挥着关键作用(5). 因此，病毒已经进化出限制DC激活的机制。例如，感染多种病毒可以阻止DC成熟或功能。例如单纯疱疹病毒(36,45)，巨细胞病毒(35)，牛痘病毒(14)、麻疹病毒(18,28,48)、拉沙热病毒(4)、汉坦病毒(43)、脊髓灰质炎病毒(51)和埃博拉病毒(8). 其中许多病毒通过限制细胞因子的产生或阻止共刺激分子的上调来阻止DC成熟。在许多副粘病毒的病例中，对上皮细胞和成纤维细胞衍生细胞系的广泛研究表明，病毒P/V/C基因编码的蛋白质可以对抗抗病毒反应（参考文献综述16,17,24、和29)但是，这些病毒拮抗剂在专业抗原呈递细胞（如DC）中可能在这方面发挥的具体作用尚不完全清楚。
对于SV5，病毒V蛋白已被证明在上皮细胞和成纤维细胞样细胞感染期间靶向STAT1降解(1,12)导致I型和II型IFN信令阻塞。最近，SV5 V蛋白也被证明在限制IFN反应的合成阶段发挥作用，因为在SV5感染后，干扰素调节因子3（IRF3）向细胞核的移位被阻断(20,42). SV5 V蛋白也可能在限制某些促炎细胞因子的诱导中发挥作用，因为虽然WT SV5是肺上皮细胞中IL-8和单核细胞趋化蛋白1的不良诱导剂，但V蛋白突变的重组SV5是这些宿主细胞基因的有效激活剂(57). 因此，SV5 V蛋白在对抗宿主细胞因子反应中发挥多重作用，参与干扰素诱导和信号通路的阻断(11,20,24).
我们之前描述了重组SV5（rSV5）突变体（rSV5-P/V-CPI）的特性−) (52)它被设计为编码六个P/V替换，这些替换破坏了SV5以STAT1为目标进行降解的能力(9). 然而，在上皮细胞中，rSV5-P/V-CPI−突变体被证明具有许多额外的意外表型，这些表型与WT rSV5非常不同。WT rSV5阻止IFN信令(12)是干扰素和其他细胞因子的不良诱导剂(11,20,57). 此外，WT rSV5感染可导致体外人类细胞的长期非细胞性感染(10,20,52). 相反，人类上皮细胞感染rSV5-P/V-CPI−与WT rSV5感染相比，导致病毒RNA和蛋白质过早升高，并且P/V突变产生的产量高于WT(52). 此外，感染rSV5-P/V-CPI的上皮细胞−分泌大量干扰素和其他抗病毒细胞因子(53,57). rSV5-P/V-CPI之间最显著的对比−由于组织培养细胞系和原代上皮细胞培养物感染了rSV5-P/V-CPI，因此WT SV5在细胞病变的程度上可见−凋亡导致细胞广泛死亡(52,54).
鉴于WT和P/V突变型SV5在上皮细胞中的显著差异，我们已经解决了WT和V/V突变型SV5在原发性人类DC感染期间抑制抗病毒反应的对比能力是否明显的问题。我们已经测试了一个一般假设，即激活宿主抗病毒反应的P/V突变副粘病毒比抑制这些宿主细胞反应的WT副粘病毒更能诱导DC成熟和功能。我们的结果对基于病毒P/V基因工程突变的更安全、更有效的重组副粘病毒载体的合理设计具有指导意义。
材料和方法
细胞、病毒和蛋白质印迹。
用Ficoll-Hypaque标准密度梯度离心法从随机选择的健康献血者中分离外周血单个核细胞（PBMC）(37). CD14号机组+根据制造商的规范（加利福尼亚州奥本市Miltenyi Biotech公司），使用CD14微球和磁性细胞分离器通过阳性选择分离细胞。通常，通过该方法分离的单核细胞的纯度为≥95%. 浓缩CD14+单元格（106在37°C和5%CO中培养6天2在由补充有10%胎牛血清的RPMI 1640（Gibco，Grand Island，NY）组成的培养基（CM）中，2mM我-谷氨酰胺、50 U/ml青霉素、50μg/ml链霉素、10 mM HEPES和0.1 mM非必需氨基酸（均来自马里兰州沃克斯维尔BioWhittaker）。CM包括10 ng/ml人白细胞介素-4（hIL-4）和10 ng/ml人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。第3天，用添加细胞因子的新鲜培养基替换一半培养基，使其达到上述最终浓度。
表达绿色荧光蛋白（rSV5-GFP）的WT rSV5和rSV5(19)如前所述恢复(39)来自Robert Lamb和Biao He（西北大学）善意提供的cDNA质粒。P/V突变体rSV5-P/V-CPI的恢复和生长特性−如前所述(52). 对于DC感染，病毒通过20%甘油垫离心（25000 rpm，6 h，SW28转子）纯化，再悬浮在含有0.75%牛血清白蛋白的Dulbecco改良Eagle's培养基中，并在CV-1细胞上滴定，如前所述(54).
对于SV5感染，在第6天收集细胞并在10天培养6细胞/ml，在含有10%胎牛血清和不同SV5病毒感染多重性（MOI）的磷酸盐缓冲盐水中37°C下放置1小时。将细胞制成颗粒，重新悬浮在1 ml CM中，并转移到24孔组织培养板中。在一些实验中，在CM中细胞再悬浮后，立即将脂多糖（LPS；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）添加到最终浓度200 ng/ml。在最终浓度104中和单位/ml。
对于Western blot分析，先前感染rSV5-GFP或rSV5-P/V-CPI的细胞−在1%十二烷基硫酸钠中溶解。如前所述，通过Western blotting分析等效细胞数(39)使用兔抗SV5 P蛋白、细胞STAT1蛋白（克隆554；Santa Cruz Biotechnology）或肌动蛋白（Sigma）的多克隆抗血清，然后使用辣根过氧化物酶结合二级抗体和增强化学发光。
细胞因子产生和细胞表面染色。
分泌的干扰素水平是通过水疱性口炎病毒（VSV）挑战生物测试测定的(52). 奥赛毒株是威克森林大学医学中心D.Lyles赠送的一份礼物。根据制造商的建议（新泽西州皮斯卡塔韦市PBL生物医学实验室），采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定IFN-α。所有其他细胞因子，即IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12 p70和TNF，通过炎症反应细胞计数珠阵列分析（BD Pharmingen，加州圣地亚哥）进行量化。为了检测表面标记物，DC根据制造商的建议用以下结合单克隆抗体染色：抗CD11c（B-ly6）、抗CD14（M5E2）、抗CD40（5C3）、抗CD80（L307.4）、反CD86（FUN-1）、抗HLA-A、B、C（G46-2.6）和抗HLA-DR（TU39）（均来自加利福尼亚州圣地亚哥BD Pharmingen）。使用Cell Quest软件（Becton Dickinson，San Diego，CA）在FACScan仪器上分析样品。成对学生的t吨试验用于确定显著性。
凋亡细胞的细胞计量分析。
细胞内活性caspase-3检测细胞凋亡。DC样品用Cytofix和CytoPerm固定并渗透（BD Pharmingen，加利福尼亚州圣地亚哥），然后用荧光素异硫氰酸盐（FITC）结合的多克隆抗caspase-3抗体（BD Pharmingen，加利福尼亚州圣迭戈）和CD11c-藻红蛋白-Cy5染色。在病毒感染时，胰蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK（明尼苏达州明尼阿波利斯研发系统公司）的浓度为100μM。样品通过流式细胞仪进行分析。成对学生的t吨检验用于确定显著性。
荧光显微镜。
感染或模拟感染的DC在感染后24小时（p.i.）采集，纺在盖玻片上，并用多聚甲醛固定。用含有DAPI（4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚；分子探针，尤金，OR）的安装介质清洗细胞，将其安装在玻璃载玻片上，并使用20×透镜使用尼康Eclipse荧光显微镜进行分析。使用QImaging数码相机拍摄图像，并使用QCapture软件进行处理。手动将样品之间的暴露时间设置为恒定。
T细胞增殖测定。
对6天大的DC进行模拟治疗，感染WT rSV5或rSV5-P/V-CPI−MOI为5，或用LPS（200 ng/ml）处理。24小时后，在与标记有5μM CFSE（5,6-羧基荧光素二醋酸酯-琥珀酰亚胺酯；分子探针，尤金，OR）的自体T细胞共培养前，对DC进行清洗和计数，DC/T细胞比为1:10。细胞在含有0.01 ng/ml毒性休克综合征毒素1（TSST-1）超抗原（毒素技术，佛罗里达州萨拉索塔）的96周圆底培养板中培养3天。选择0.01 ng/ml TSST-1浓度作为可检测到T细胞增殖的最低浓度。T细胞受体（TCR）Vβ2特异性CD4的增殖+流式细胞术检测T细胞CFSE强度降低。使用FlowJo软件（FlowJo、Ashland、OR）对数据进行分析和量化。被称为“除以百分比”的值是进入除法的人口的百分比。
结果
原始人类T细胞和DC感染WT rSV5和P/V突变株后的差异蛋白表达。
从随机选择的健康献血者的全血中分离出的PBMC被Miltenyi珠分为CD14阳性和CD14阴性人群（图。). CD14阴性人群主要由T细胞组成，这些T细胞在随后的实验中用于T细胞增殖分析（见下文）。对于CD14阳性人群，表面标记物分析显示，<1%的细胞表达表面CD11c或成熟标记物CD40、CD80和CD86（未显示）。这些CD14+然后用重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和IL-4培养细胞6天，这些条件可产生骨髓源性未成熟DC(46). 超过95%的未成熟DC群体是CD11c+（未显示）。
原代人T细胞和未成熟DC的SV5感染。（A） 用CD14珠筛选分离PBMC，并用流式细胞术分析未选择（顶面板）或选择（底面板）群体的表面CD14和CD11c表达。（B） T细胞或未成熟DC被模拟感染（M道）或在MOI为5时感染rSV5-GFP（S道）或P/V-CPI−（C车道）。在24小时p.i.时，制备细胞裂解物，并通过Western blotting分析SV5P蛋白或细胞肌动蛋白。（C） T细胞或未成熟DC被模拟感染或在MOI为5时感染rSV5-GFP或P/V-CPI−并在24小时p.i.通过显微镜检查细胞核（DAPI板）或GFP。面板表示等效的暴露时间。
为了确定WT和突变SV5感染原代T细胞的能力，细胞被模拟感染或在MOI为5时感染带有GFP基因的rSV5作为额外基因；该病毒已被证明具有WT生长和基因表达特性(19). 或者，DC感染了rSV5-P/V-CPI−也编码HN和L基因之间的GFP(52). 如图所示。Western blot分析感染T细胞的裂解产物未显示SV5蛋白表达。为了支持这一结果，对感染T细胞的显微镜分析显示，背景水平以上没有GFP荧光（图。). 这些数据表明，WT或P/V突变体SV5在体外不能有效地感染T细胞。
与缺乏SV5感染T细胞相比，未成熟DC被rSV5-GFP有效感染。这在图中所示的代表性捐赠者的结果中很明显。，其中SV5 P蛋白和其他病毒蛋白（见下文）在感染DC的裂解液中检测到，时间为24小时P.i−与rSV5-GFP相比，突变体的含量非常低（图。DC面板），并且通常仅在长曝光时间下才能看到。P/V突变蛋白表达水平低并不是由于细胞群中只有少量DC感染所致，因为发现所有DC在24小时P.i.时都表达GFP（图。). GFP荧光强度远低于感染rSV5-GFP的DC的荧光强度（图。)与上述蛋白质水平差异一致。
为了确定受感染DC中SV5蛋白表达的动力学，用WT rSV5或P/V突变体模拟感染细胞或在MOI为5的情况下感染细胞，并通过Western blotting分析在不同时间P.i.采集的裂解物的蛋白质积累。如图所示。感染WT rSV5-GFP的细胞中NP和P蛋白的积累量远远高于P/V突变株。在图中所示的示例中。，在24小时p.i.时，病毒和细胞蛋白损失，但这并没有重复出现。如图所示。对于来自两个具有代表性的供体细胞，DC在感染一系列带有WT rSV5和rSV5-GFP的MOI后表达了高水平的P蛋白，但感染了P/V-CPI−突变体导致蛋白质表达水平低得多。对于所有受试的供体，P/V突变蛋白的积累始终低于WT rSV5感染时的积累，尽管差异并不总是如图中所示的单个供体DC的差异那么显著。.
被SV5 P/V突变株感染的DC显示出低水平的病毒蛋白表达和低病毒产量。（A） 蛋白质表达的时间进程。从代表性供体分离的DC被模拟感染（M道）或在MOI为5时感染rSV5-GFP或P/V-CPI−突变体。在指定时间（h）p.i.收集蛋白质提取物，并通过Western blotting分析SV5 NP和p或细胞肌动蛋白。（B） 剂量依赖性蛋白表达。从两个代表性供体分离的未成年DC被模拟感染（车道M），在指定的MOI感染rSV5，或在MOI为5时感染rSV5-P/V-CPI−（车道CPI−)或WT rSV5-GFP（车道G）。用特异于SV5P蛋白的多克隆抗血清通过蛋白质印迹分析蛋白质提取物。（C） 病毒产生。在MOI为5的情况下，从8名个人供体中分离出的DC感染了WT rSV5或P/V-CPI−通过斑块试验测定突变体和24h后病毒产量。
24小时p.i.下后代WT rSV5的产量范围为～105至～106PFU/ml/106感染DC，比原型A549肺上皮细胞系低100到1000倍(52). 相反，P/V突变感染DC的病毒产量≤102PFU/ml/106细胞，为～106-比感染这种P/V突变的上皮细胞系的典型倍低(52)和10三-到104-比WT rSV5感染的DC所见的要低两倍。
综上所述，这些数据表明，rSV5在体外不会有效感染原代人类T细胞，但感染未成熟DC会导致高水平的蛋白质和病毒粒子生成。虽然未成熟的DC也可以被P/V突变株有效感染，但我们对DC的上述结果与之前对上皮细胞的结果存在显著差异，因为P/V突变高度限制于仅产生低水平的病毒蛋白和病毒。
WT rSV5和P/V突变株感染DC后STAT1和I型IFN水平。
WT SV5通过靶向STAT1降解来对抗IFN信号(12). 相反，我们之前的结果表明rSV5-P/V-CPI−在P和V蛋白的共享N末端区域包含六个氨基酸替换，已经失去了在上皮细胞中降解STAT1的能力(52). 如图所示。，所有供体的DC在SV5感染后均显示STAT1降解。一些个体供体的DC对SV5诱导的STAT1降解不太敏感，需要很高的MOI才能诱导完全降解。由于目前尚不清楚某些原代细胞对STAT1降解敏感性的可变性基础，因此本文所提供的数据是使用来自供体的DC得出的，该DC显示SV5在感染5-10个MOI后诱导STAT1的降解。如果是P/V-CPI−突变型STAT1水平在感染后并没有降低，通常比模拟感染样品中的STAT1浓度升高，如之前感染A549上皮细胞所示（由于IFN信号）。P/V突变不能靶向DC中STAT1降解，这与V蛋白突变一致(9,52)尽管突变感染DC中病毒蛋白的低水平表达也可能导致这种表型。
WT rSV5和P/V突变株感染DC后的STAT1和IFN水平。（A） STAT1水平。来自代表性供体的未成年DC被模拟感染（车道M）或在MOI为5时感染rSV5-GFP或P/V-CPI−变异病毒。蛋白质提取物用STAT1或细胞肌动蛋白特异性多克隆抗血清进行Western blotting分析，交叉反应性宿主蛋白。（B和C）I型干扰素水平。从单个供体分离的DC被模拟感染，感染rSV5或P/V-CPI−MOI为5时突变，或用LPS（200 ng/ml）处理。在24小时p.i.时，通过VSV激发试验分析上清液中的i型干扰素（B）水平，或通过ELISA分析干扰素-α（C）水平。数据是来自三个供体的平均值，标准偏差用条形表示。*，与WT SV5感染样本显著不同。
先前对人上皮细胞和成纤维细胞株的研究结果表明，WT SV5是一种I型干扰素的不良诱导剂(11,20,42)而P/V突变激活IFN分泌(52). 为了确定这些相同的特性是否也适用于人类DC，在用WT和P/V突变SV5感染未成熟DC后，对I型干扰素分泌进行了检测。对I型干扰素进行生物测定（图。)DC感染P/V-CPI−突变体分泌～80 U/ml干扰素/106而WT SV5感染的DC产生的水平与模拟感染或对照LPS处理细胞的水平非常相似。在ELISA中（图。)、P/V-CPI−突变体在24小时感染期间诱导约50 pg/ml IFN-α，而WT rSV5感染诱导的水平不高于对照样品的水平。LPS治疗的DC中缺乏IFN-α诱导，这与之前的结果一致，表明髓系DC表达Toll样受体4（TLR4），但当受到LPS攻击时，产生很少IFN-α(25). rSV5-P/V-CPI后IFN-α产量增加−感染与P/V突变体无法诱导STAT1降解一致(31).
DC的成熟和功能是通过感染rSV5 P/V突变株而不是WT rSV5而诱导的。
未成熟DC的病毒感染可导致宿主细胞反应，导致DC成熟，包括分泌免疫调节细胞因子，如IL-8和TNF-α，以及细胞表面分子，如CD40、HLA、CD80和CD86的上调(5,44). 为了确定rSV5感染是否诱导DC成熟，未成熟DC被模拟感染，在MOI为5时用WT rSV5或P/V突变株感染，或用LPS作为阳性对照。然后在24小时p.i.通过流式细胞术测定CD40、CD86、CD80和II类分子的水平，如图所示。LPS处理可有效上调这四个成熟标记物的细胞表面表达，使其水平比模拟处理DC高约2.5至3.5倍。相反，WT rSV5感染的DC未显示成熟标记的表达增加，在某些情况下，表面表达低于模拟感染细胞（如CD80和HLA）。感染P/V突变体对这四个细胞表面成熟标记有不同的影响。一些成熟标记物（如CD86和HLA）的表达增加到与LPS治疗后相似的水平，而其他标记物（例如CD40和CD80）在模拟感染DC上显著诱导，但与LPS对照组相比仍较低。如图所示。感染P/V突变株后，DC也被诱导分泌IL-6、IL-8和TNF-α，尽管分泌的细胞因子水平远低于LPS治疗的DC。与细胞表面成熟标记物一样（图。)WT rSV5感染未显著诱导DC分泌这些细胞因子。
P/V-CPI感染未成熟DC后成熟标记物增加−突变，但不含WT rSV5。来自个人供体的DC被模拟感染，在MOI为5时感染WT rSV5或P/V-CPI−突变，或用脂多糖处理。24小时后，用所示成熟标记蛋白的抗体对细胞进行染色，并用流式细胞术（A）进行分析。平均荧光强度（带标准误差）是相对于模拟样品的荧光强度表示的，来自四个供体DC的四个独立实验。CPI后共刺激分子的上调−与SV5感染后相比，变异感染具有统计学意义，如下所示P（P）值：对于CD40，P（P）=0.00034；对于CD80，P（P）= 0.0069; 对于CD86，P（P）= 0.0086; 对于HLA-DR，P（P）= 0.01. 或者，用细胞仪珠阵列分析无细胞上清液中所示的细胞因子（B）。数值为四个供体DC的三个独立实验的平均值±标准误差。
用P/V突变体感染未成熟DC诱导IFN而不导致STAT1降解的上述发现增加了病毒诱导的DC成熟依赖于通过STAT1途径的IFN信号传导的可能性。为了验证这一假设，我们测定了抗干扰素中和抗体对SV5诱导的DC成熟的影响。添加IFN-α和IFN-β特异性抗体可中和细胞外IFN（图。)但没有显著改变成熟标记CD80和CD86的水平（图。)或用WT或P/V突变体SV5感染的DC表面上的CD40和HLA（未显示）。同样，在中和细胞外干扰素的条件下，WT或P/V突变病毒感染诱导的细胞因子水平没有显著变化（图。). 由于P/V突变株的紫外线处理降低了病毒感染成熟DC的能力（未显示），我们的数据表明，P/V突变激活DC成熟的机制在很大程度上独立于IFN分泌，但依赖于病毒复制。
I型干扰素分泌在WT和P/V突变SV5感染后DC成熟中的作用。来自个人捐献者的DC被模拟感染或以5的MOI感染WT rSV5或P/V-CPI−突变体，用（带阴影的条）或不带（黑色条）的干扰素-α和干扰素β的中和抗体混合物孵育。24小时后，采集样本，通过VSV激发试验分析上清液中的I型IFN（a）水平。或者，用所示成熟标记蛋白的抗体对细胞进行染色，并通过流式细胞术（B）进行分析。平均荧光强度（带标准误差）表示为相对于模拟样品的荧光强度，来自四个供体细胞的四个独立实验。无细胞上清液也通过细胞计数珠阵列检测TNF-α和IL-6（C）。数值为三个供体DC的三个独立实验的平均值±标准误差。
原发性DC感染WT rSV5后会产生细胞病变效应，但P/V突变不会产生细胞病变。
在我们对DC感染的分析中，我们注意到，感染WT rSV5的未成熟DC表现出高水平的细胞病变效应，这在感染P/V突变株期间是看不到的。这在图中很明显。其中，感染WT rSV5的DC在流式细胞术分析中显示正向和侧向散射减少，这反映了细胞大小和粒度与细胞病变效应增加一致。相反，感染P/V-CPI的DC的正向/侧向散射−突变株与模拟感染或LPS处理的样本相似。
DC感染WT rSV5但不感染P/V-CPI后细胞病变效应和活性caspase-3增加−突变体。来自个人供体的DC被模拟感染，在MOI为5时感染WT rSV5或P/V-CPI−突变，或用LPS（200 ng/ml）处理。在p.i.24小时，通过流式细胞术分析细胞内活性caspase-3的水平。图A显示了绘制正向散射和侧向散射的代表性实验的结果。B组显示了FITC-抗caspase-3抗体染色水平的代表性实验结果(年轴）与藻红蛋白Cy5-抗CD11c抗体染色(x个轴）。C组显示了四名供体caspase-3染色升高的细胞的平均百分比。*，P（P）SV5-和CPI之间的值为0.026−突变感染样本。
为了确定WT rSV5是否激活了凋亡途径，分析了模拟感染和病毒感染细胞中是否存在活性caspase-3。如图中的典型示例所示。，模拟感染或LPS处理的细胞仅显示约4%至9%的细胞具有升高的活性胱天蛋白酶-3。相反，约34%的WT rSV5感染的DC显示活性caspase-3染色升高。rSV5-P/V-CPI感染−突变体仅导致约12%的DC显示高水平的活性caspase-3染色。来自四名个人捐赠者DC分析的平均值表明，约33%的WT rSV5感染DC人群的caspase-3活性升高，而模拟感染和rSV5-P/V-CPI的caspase活性均为约10%至15%−-受感染的细胞（图。). 因此，DC感染WT rSV5，但不感染P/V突变，导致细胞病变效应和凋亡途径激活。
添加胰蛋白酶抑制剂降低了感染WT rSV5的DC中的凋亡标记和细胞病变效应。这在图中很明显。其中DC与100μM Z-VAD-FMK孵育导致活性caspase-3水平降低（图。)流式细胞术检测到的正向/侧向散射剖面与模拟感染对照细胞的散射剖面相似（图。). 为了确定抑制细胞病变效应是否会导致SV5感染DC的成熟度增加，用WT rSV5或P/V突变株模拟感染未成熟细胞或在MOI为5时感染未成熟的细胞，然后用或不用100μM Z-VAD-FMK培养。细胞表面成熟标记物在24小时p.i.时进行分析，如图所示。在感染P/V突变的DC中，添加Z-VAD-FMK对表面成熟标记物CD40、CD80和HLA-DR的水平几乎没有影响。相反，在感染WT rSV5的DC中添加胰蛋白酶抑制剂，导致所有三个标记物的水平略高于对照处理的WT rSV5感染细胞。这些数据表明，WT rSV5感染后DC凋亡通路的激活在一定程度上促成了病毒诱导成熟标记物的低水平。然而，由于Z-VAD-FMK处理的病毒感染细胞的成熟标记物水平仍远低于对照LPS处理的DC（图。)这些数据表明，其他机制有助于SV5感染后DC的有限成熟。
Z-VAD-FMK治疗可降低SV5感染DC的活性caspase-3和细胞病变效应。（A） 活性半胱天冬酶-3水平。DC在MOI为5时感染WT rSV5或P/V-CPI−突变株，在流式细胞术分析caspase-3水平之前，用或不用100μM Z-VAD-FMK（胰蛋白酶抑制剂）孵育24小时。数据是来自三个捐赠者的三个单独实验的平均值±标准误差。SV5感染DC加用和不加用Z-VAD-FMK治疗的值有显著差异(P（P）=0.0001）成对t吨测试。（B和C）细胞病变效应和成熟标志物。按照A组所述处理模拟感染或感染DC，并通过流式细胞术分析正向和侧向散射（B）的变化。此外，通过流式细胞术（C）分析细胞表面成熟标记物水平。平均荧光强度（带标准误差）是相对于模拟样品的荧光强度表示的，来自四个供体的四个独立实验。
感染SV5 P/V突变株的DC是T细胞增殖的有效激活剂。
在体外共培养试验中测试SV5感染DC刺激T细胞功能的能力。来自个体供体的未成年DC被模拟感染，感染WT rSV5或P/V突变株，或用LPS治疗作为阳性对照。24小时后，DC与CFSE标记的自体T细胞在0.01 ng/ml TSST-1的存在下共培养3天，TSST-1是一种优先激活CD4的超抗原+携带TCR Vβ2链的T细胞。CD4的增殖+Vβ2+通过测量CFSE强度来检测T细胞。在这个实验中，成熟DC刺激增殖的T细胞在每次细胞分裂时都会失去CFSE荧光。
图显示了来自四个单独实验之一的CFSE染色的代表性实例。与WT rSV5感染的DC共培养的T细胞显示出高水平的CFSE，其染色模式与与模拟感染DC共培养T细胞的染色模式非常相似。相反，与P/V突变感染DC共培养的大部分T细胞显示CFSE强度降低。P/V突变感染DC的样本中CFSE染色的下降幅度大于模拟感染的样本，但小于LPS处理的样本。在四个单独的实验中，与P/V突变感染DC共培养的诱导分裂的T细胞百分比（分裂百分比）始终高于与WT rSV5感染DC共培育的T细胞的百分比（图中显示了两个示例）。). 然而，单个供体细胞之间的绝对百分比分割值有所不同（比较图中供体A和B的值）。). T细胞未被WT rSV5直接感染（图。)表明与WT rSV5共培养的样本中缺乏T细胞分裂不是由于SV5感染对T细胞本身的直接抑制作用。
感染P/V突变体而非WT rSV5的DC是T细胞增殖的有效激活剂。DC接受模拟治疗，MOI为5时感染WT SV5或P/V-CPI−突变，或用LPS（200 ng/ml）处理24小时，然后在0.01 ng/ml TSST-1超抗原存在下与CFSE标记的自体T细胞共培养。3天后，细胞被TCR Vβ2-APC抗体染色(年轴）和CD4的增殖+通过CFSE强度的变化测量细胞(x个轴）。（A） 单个供体DC的代表性CFSE染色结果。（B） 来自两个个人供体的样本中进行分裂的T细胞百分比（%）。
综上所述，这些数据表明WT rSV5是DC成熟途径的不良诱导剂，导致表面共刺激分子和细胞因子分泌的上调，并且这些感染的DC是T细胞增殖的不良激活剂。相反，SV5 P/V突变诱导一些DC成熟标记的表达增加，这些感染的DC是更有效的T细胞增殖激活剂。
讨论
副粘病毒SV5在该病毒家族中并不常见，因为它是人类上皮细胞和成纤维细胞源性细胞中宿主抗病毒反应的不良诱导剂。这一点从WT rSV5感染的研究中可以明显看出，该感染导致高水平的病毒产生，细胞病变影响最小，促炎细胞因子分泌有限(56)或I型干扰素(20,42,52). 相反，rSV5-P/V-CPI−突变体对上皮细胞和成纤维细胞衍生的细胞有高度的细胞病变，并且宿主抗病毒细胞因子和干扰素被诱导到高水平(52,56). 我们以前的结果表明，这些表型不仅限于组织培养细胞系，而且在很大程度上也适用于直接体外分离、传代最少的正常原代人上皮细胞的感染(54). 这里我们测试了rSV5-P/V-CPI的假设−与WT rSV5相比，该突变体是更有效的DC成熟和功能诱导剂。表本文总结了原发性DC的结果，并与我们之前对感染WT rSV5和P/V-CPI的上皮细胞的结果进行了比较−突变体。
表1。
| 参数 | 树突状细胞的价值
| 上皮细胞值
|
|---|
| 重量rSV5 | P/V-CPI指数− | 重量rSV5 | P/V-CPI− |
|---|
| 基因表达 | 高 | 低 | 高 | 较高的 |
| 病毒产量（PFU/ml）一 | ∼105-106 | <102 | ∼107 | ∼108 |
| IFN-α/β分泌b条 | <10 | ∼80 | ND（无损检测）e（电子） | 5,000-10,000 |
| STAT1状态c（c） | 降低 | 增加 | 降低 | 增加 |
| 细胞病变效应d日 | 30-50% | ∼12% | ND（无损检测）e（电子） | ∼20% |
来自八个个体供体的PBMC衍生的DC显示出WT rSV5的有效体外感染，具有丰富的病毒蛋白合成和子代病毒产生（表). P/V突变体在体外也能有效感染DC；然而，与WT rSV5相比，病毒蛋白表达和病毒生成较低。这是一个意外的结果，因为我们之前的上皮细胞数据显示rSV5-P/V-CPI−突变体表达高于WT水平的病毒mRNA和蛋白(52,53)单步生长周期的病毒产量比WT SV5高约1 log（表). 直接体外分离的原代人上皮细胞也可以观察到这些表型(54). 通过添加中和性抗IFN抗体（未显示），DC中P/V病毒基因的低水平表达没有恢复到WT表达水平，这表明P/V突变复制受到限制是由于不依赖于IFN信号的细胞内抗病毒途径。许多抗病毒基因产物被IRF依赖但不依赖IFN信号的途径激活(13). 我们的结果表明，不同的细胞内抗病毒途径在DC和上皮细胞中被P/V突变体选择性激活，或者相同的途径在这两种细胞类型中被激活，但在DC中对激活更敏感。
I型干扰素是通过感染带有P/V突变的DC而不是WT rSV5诱导的（表). 因此，WT rSV5限制IFN诱导的能力以及P/V突变情况下该功能的丧失是上皮细胞和DC共同的表型。IFN启动子的激活可能涉及包括细胞质RNA解旋酶RIG-I和MDA-5的途径(2,27,55)或一些在病毒感染期间被激活的Toll样受体(21,47). 某些类型的专业APC，如DC，具有高组成水平的IRF-7(26)通过产生高水平的IFN-α，使这些细胞对感染迅速作出反应，而不需要RIG-I或MDA-5介导的原代细胞合成IFN-β(三,31). 在成纤维细胞衍生的细胞中，SV5 V蛋白已被证明可以阻止IFN-β启动子在暴露于双链RNA后的激活(42)并通过MDA-5(2). 基于最近发现呼吸道合胞病毒和麻疹病毒在浆细胞样细胞感染期间阻止TLR介导的IFN合成(47)目前正在进行工作，以确定WT rSV5是否通过靶向IRF-7或TLR-激活途径来限制DC生产性感染期间的IFN诱导。
在一些实验系统中，分泌的I型干扰素可以诱导DC成熟(23,30). 这增加了以下可能性：WT和P/V突变病毒在IFN诱导、STAT1降解和DC成熟方面的差异可能存在机械联系。然而，在感染P/V突变株期间添加中和性抗IFN抗体并没有降低DC成熟标记物或细胞因子的水平（图。)表明P/V突变诱导的成熟不仅仅依赖于自分泌干扰素信号。我们的结果与感染流感病毒和仙台病毒的小鼠DC的结果相似(32)有人提出，感染DC的成熟是由于病毒的IFN诱导特性，但成熟本身不是由于分泌的IFN。
感染WT rSV5的小鼠DC与感染WT r SV5的人类DC的反应非常不同。我们以前的研究表明，小鼠DC的WT rSV5感染可有效上调成熟标志物CD40和CD86，并分泌促炎细胞因子，如IL-6和IL-12(41). 这与这里显示的人类DC的WT rSV5感染的结果形成对比，后者几乎没有诱导成熟标记物或细胞因子分泌的上调。WT rSV5诱导DC成熟能力的这些物种特异性差异与之前对小鼠、人上皮细胞和成纤维细胞感染WT SV5的结果一致(11)并且可能至少部分与WT rSV5对抗人类和小鼠细胞中抗病毒途径的不同能力有关(56). 在人类DC感染P/V突变株的情况下，抗病毒途径没有被有效阻断，DC表现出一些成熟表型。因此，用WT rSV5感染小鼠DC的结果与用rSV5-P/V-CPI感染人类DC的结果具有相同的特性−突变，即低水平病毒蛋白合成、诱导IFN合成和上调协同刺激标记物子集（CD40和CD86）。有趣的是，在这两个系统中（感染WT SV5的小鼠DC和感染P/V突变的人类DC），CD80成熟标记的DC表面表达增加是最小的。由于成熟DC表达CD80可能是刺激T细胞的重要因素(15,33)，有可能设计更多SV5突变体，以增强上调CD80表达和进一步刺激T细胞功能的能力。
本研究的一些显著发现是WT rSV5和P/V-CPI的细胞病变效应的对比−突变体（表)，因为当这两种病毒感染人类DC或上皮细胞时，这些表型在很大程度上被逆转。WT rSV5建立了人类上皮细胞的一般非细胞性感染，是宿主细胞死亡途径的不良诱导剂(10,20,52). 在感染WT rSV5的A549肺上皮细胞中，只有～2%的细胞群在p.i.晚期出现凋亡迹象(52). 相比之下，我们的rSV5-P/V-CPI−突变体是上皮细胞的高度细胞病变，大多数细胞群体在36 h p.i时显示凋亡迹象。与WT rSV5和p/V-CPI的联合感染研究−A549细胞的突变表明，WT rSV5可以阻止rSV5-P/V-CPI诱导的细胞圆形化、细胞体积损失和DNA断裂−，这是凋亡途径中的三个晚期事件(53). 然而，WT rSV5不能阻止线粒体膜电位的丧失，这是P/V突变引起的细胞死亡过程中的早期事件(53). 我们目前的发现是，WT rSV5感染的DC显示出活化的凋亡死亡途径的迹象，这表明（i）不同的凋亡途径在DC和上皮细胞中被激活，并且WT病毒在阻断DC死亡途径方面无效；或（ii）DC中共同通路的激活阈值低于上皮细胞。重要的是，我们对胰蛋白酶抑制剂的机理研究表明，半胱氨酸蛋白酶依赖途径的激活只能部分解释WT SV5感染后DC成熟不足的原因，并表明其他因素有助于WT SV 5阻止DC成熟。
我们对DC感染SV5 P/V突变株的结果表明，使用副粘病毒作为病毒载体可诱导适应性免疫反应。有人提出，携带病毒干扰素拮抗剂基因突变的重组负链RNA病毒可以代表新型病毒载体，其致病能力降低，但仍能激发适应性免疫反应(38,49). 例如，Palese及其同事在小鼠模型系统中表明，NS1蛋白缺失的流感病毒致病性较低，但仍能引发强烈的适应性抗体和T细胞反应(49). 就牛呼吸道合胞病毒而言，缺乏NS蛋白表达的干扰素诱导突变体在体内表现出高度减毒，并诱导保护性免疫来挑战(50). 除了我们的数据显示SV5 P/V突变在原发性DC中基本上是非细胞病变的，我们之前已经证明这种突变也限制了低MOI在上皮细胞群中的传播(54). 因此，这些发现与副粘病毒载体的安全性可以通过工程突变P/V基因来提高的一般假设相一致(38,49,50). SV5 P/V突变体在诱导DC表达成熟标记和获得激活T细胞所需功能方面也比WT rSV5更有效。作为将我们的细胞培养数据扩展到体内结果的警告，尚不清楚SV5是否直接感染整个动物的DC。综上所述，现有数据增加了具有工程P/V突变的副粘病毒可能成为新病毒疫苗载体的基础的可能性，新病毒疫苗既安全又有效地激活适应性免疫反应。
