DNA Methylation Is Critical for Arabidopsis Embryogenesis and Seed Viability

Wenyan Xiao; Kendra D. Custard; Roy C. Brown; Betty E. Lemmon; John J. Harada; Robert B. Goldberg; Robert L. Fischer

doi:10.1105/tpc.105.038836

植物细胞。2006年4月；18(4): 805–814.

数字对象标识：10.1105/tpc.105.038836

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PMID：16531498

DNA甲基化对拟南芥胚胎发生与种子活力

肖文燕（Wenyan Xiao）,^一肯德拉·D·卡斯特,^一罗伊·C·布朗,^b条贝蒂·E·莱蒙,^b条约翰·哈拉达,^c（c）罗伯特·B·戈德堡,^d日和罗伯特·费舍尔^a、，¹

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摘要

哺乳动物基因组中的DNA甲基化（5-甲基胞嘧啶）主要发生在CpG二核苷酸，由DNA甲基转移酶1（Dnmt1）维持，对胚胎存活至关重要。植物基因组在CpG二核苷酸处也有5-甲基胞嘧啶，由Dnmt1的同源物甲基转移酶1（MET1）维持。此外，植物在CpNpG和CpNp N位点有DNA甲基化，部分由CMT3 DNA甲基转移酶维持。在这里，我们展示拟南芥胚胎功能丧失突变MET1型和CMT3型发育不正常，细胞分裂平面和数目改变，生存能力下降。指定胚胎细胞特性的基因表达错误，在异常情况下生长素激素梯度没有正确形成满足1胚胎。因此，DNA甲基化对植物胚胎发生和种子活力的调控至关重要。

简介

早期胚胎发生拟南芥以可预测的细胞分裂模式区分(鲍曼和曼斯菲尔德，1994年). 合子不对称分裂产生一个小的顶端细胞和一个大的基底细胞，这两个细胞具有不同的发育命运(图1A至1F) (Goldberg等人，1994年;Scheres和Benfey，1999年). 顶端细胞发育为胚胎本身，而基底细胞伸长并横向分裂产生胚柄，胚柄是支持胚胎本身发育的短暂器官(Berleth和Chatfield，2002年). 顶端细胞经历两轮纵向细胞分裂（二细胞期和四细胞期）和一轮横向分裂（八细胞期）。来自八分体胚胎顶端细胞的八个细胞中的每一个都会沿周向分裂产生一个16细胞胚胎。在早期胚胎发生期间，极性的短轴固定，形成茎和根分生组织，产生子叶贮藏器官，并规定组织层。胚胎经历了一系列形态上被定义为球状、心脏、鱼雷和手杖阶段的阶段(Goldberg等人，1994年;Jurgens，2001年). 相比之下，基底细胞伸长并横向分裂，形成一个由7到9个细胞组成的结构。基底谱系的最上层细胞，垂体，整合到胚胎本身，成为根分生组织的静止中心(Berleth和Jurgens，1993年;Hamann等人，1999年). 基础谱系中的剩余细胞遵循胚外细胞的命运，形成胚柄。

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图1。

金属1-6突变影响悬浮物和胚胎发育。

（A）到（十）野马斯基野生型和纯合子照片金属1-61至6 DAP的突变胚胎。

（是）到（JJ）野生型和表1-64到6个DAP的突变胚胎。

野生型照片（A）到（F）分别在1、2、3、4、5和6 DAP时；这个满足11 DAP时的突变胚胎(【G】,[男]、和【S】)，2个DAP(【H】,【否】、和【T】)，3个DAP([我],【O】、和[美])，4个DAP([日本],【P】、和【V】)，5个DAP(【K】,[问]、和[西])和6 DAP(【L】,【右】、和【X】). 野生型胚胎的组织切片（A）到（C）分别为4、5和6 DAP；这个满足14 DAP时的突变胚胎(【BB】,【EE】、和[小时])，5个DAP([抄送],【消防】、和【二】)和6 DAP(【日期】,【政府】、和[日本]).（A）到（D）,（G）到（J）,（米）到（P）,（S）到（五）,（是）,（BB）,（立方厘米）,（EE）,（HH）、和（二）比例相同，并且（E）,（F）,（K）,（左）,（问）,（右）,（W）,（十）,（Z）,（AA）,（日）,（法国法郎）,（GG）、和（JJ）是相同的规模。棒材=20μm in（A）和50μm英寸（E）箭头表示第一次合子细胞分裂的平面([答],【G】,[男]、和【S】)，顶端和基底谱系衍生细胞之间的边界(【B】到【L】)，垂体（是），顶端细胞核（BB）或顶端细胞前两个纵向细胞分裂的细胞平面(【EE】和[小时]).

早期胚胎发生受转录因子、激酶介导的信号转导途径以及建立和维持生长素激素梯度的蛋白质调控(Willemsen和Scheres，2004年). 例如尤达(YDA公司)该基因编码有丝分裂原激活的蛋白激酶激酶，调节胚胎和胚柄细胞的特性。在伊达突变体植物，胚柄细胞采用胚胎细胞命运，纵向分裂，并整合到胚胎本身而不是形成胚柄(卢科维茨等人，2004年).WUSCHEL相关homebox(WOX公司)转录因子基因标志着早期胚胎发生过程中的细胞命运决定。WOX2型和工作8在卵细胞和合子中表达，它们的表达分别局限于顶端细胞系和基底细胞系。WOX2是形成顶端胚域的细胞分裂所必需的。生长素梯度有助于形成胚胎顶基轴、茎和根分生组织以及子叶器官(Jenik和Barton，2005年;Friml等人，2006年).PIN成型(销钉)基因编码对调节生长素运输很重要的运输类膜蛋白(Friml，2003年;Weijers等人，2005年). PIN蛋白在质膜上显示不对称亚细胞定位，调节生长素的极性运输，并在胚胎发生过程中建立生长素梯度。中的突变PIN码1和引脚7破坏胚胎顶基轴的建立(Steinmann等人，1999年;Friml等人，2003年).松果体(PID（PID）)，编码Ser-Thr蛋白激酶(Christensen等人，2000年)调节PIN定位和心尖-基底轴形成(Friml等人，2004年). 的过度表达PID（PID）导致PIN定位的基-顶偏移，导致生长素梯度丢失和胚胎发育缺陷。

DNA甲基转移酶在5位共价甲基化胞嘧啶。DNA甲基化是一种可遗传的表观遗传过程，调节动植物的发育过程(马丁森和科罗特，2001年;Reik等人，2001年;李，2002). DNA甲基化在基因组稳定、X染色体失活、转座子和内源性逆转录病毒沉默、基因表达和印迹中起着重要作用(伯德和沃尔夫，1999年;贝斯特，2000;Reik和Walter，2001年;本德，2004;Gehring等人，2004年;Chan等人，2005年).

在哺乳动物中，5-甲基胞嘧啶是CpG二核苷酸。在配子发生和胚胎发生过程中，DNA甲基化丢失，随后通过DNA甲基转移酶3a（Dnmt3a）和Dnmt3 b重建(Okano等人，1999年). DNA甲基化模式在体细胞发育期间由Dnmt1 DNA甲基转移酶维持(Li等人，1992年). DNA甲基化对哺乳动物胚胎发育至关重要Dnmt1型或Dnmt3型基因导致胚胎死亡(Li等人，1992年;Okano等人，1999年). 在拟南芥，CpG DNA甲基化由甲基转移酶1（MET1）维持，MET1是DNA甲基转移酶Dnmt1的直系同源物(芬尼根和丹尼斯，1993年;Finnegan和Kovac，2000年). 除了CpG甲基化，拟南芥具有CpNpG和CpNp N甲基化。染色体甲基化酶3（CMT3）和结构域重排甲基化酶1（DRM1）和DRM2（Dnmt3的同源物，用于DNA从头甲基化）维持CpNpG和CpNp N甲基化模式(Henikoff和Comai，1998年;Bartee等人，2001年;Lindroth等人，2001年;曹和雅各布森，2002a,2002年b).

拟南芥反义植物MET1型转基因，部分功能丧失满足1突变，或cmt3 drm1 drm2突变表明DNA甲基化降低导致胚胎后植物发育异常(Finnegan等人，1996年;Kakutani等人，1996年,2004;Ronemus等人，1996年;Cao，2003年;Kankel等人，2003年;Kato等人，2003年;Saze等人，2003年). 在这里，我们展示了满足1和达到1 cmt3突变胚胎的存活率降低。满足1和达到1 cmt3胚胎通常具有错误的细胞分裂模式、极性和生长素梯度，以及指定胚胎细胞身份的基因表达错误。因此，DNA甲基化对于胚胎的正常发育和存活是必要的拟南芥.

结果

此前，我们隔离了四名满足1突变等位基因(符合1-5到表1-8) (肖等人，2003). 这个金属1-6该等位基因可能是一个空等位基因，因为由于翻译终止密码子过早，它编码一个缺失催化结构域的截短DNA甲基转移酶。这个金属1-6突变导致开花延迟（W.Xiao和R.L.Fischer，未发表的结果），导致基因组低甲基化，并降低印迹基因启动子中的DNA甲基化，MEDEA公司(肖等人，2003). 植物杂合子金属1-6突变等位基因，来源于突变的植物，这些植物从来没有这种突变的纯合子(肖等人，2003)，用于生成纯合子金属1-6这些研究中使用的植物。我们发现来自纯合子的西力克金属1-6植物含有败育种子（12%）的频率比野生型对照（0.3%）高约40倍(表1). 使用清除的种子和组织切片观察胚胎发生，发现33%的金属1-6胚胎发育异常(表1). 如下所述，这些纯合子表1-6突变胚胎表现出广泛的发育异常，这些异常一直被观察到。

表1。

DNA甲基转移酶基因突变对胚胎发生和种子活力的影响

	遗传杂交		F1异常胚胎^一		F1种子败育
自花授粉	女性	男性	%	n个	%	n个
野生型			0	967	0.3	678
金属1-6/金属1-6			33	568	12.2	986
cmt3-7/cmt3-7			三	578	0.5	875
MET1型/金属1-6			10	562	7.8	539
cmt3-7/cmt3-7			23	816	16.3	1096
MET1/金属1-6
	金属1-6/金属1-6	野生型	16	550	7.2	690
	野生型	met1-6/met1-6	8	822	1.2	982
	MET1/金属1-6	野生型	8	420	2.2	683
	野生型	MET1/金属1-6	5	403	1	853

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^一授粉后1至6天的胚胎通过整粒种子清理进行检查。

不对称第一细胞分裂

F2纯合子的异常满足1授粉后1d，第一次合子分裂后胚胎发育明显。我们检测到满足1突变合子(图1G,，1百万，100万、和和1S）1S（秒）)与野生型对照胚胎相比，其分裂更加对称(图1A). 约13%(n个266）个胚胎的基底细胞未能伸长并进行横向分裂(图1N和和1T）。1吨). 这些结果表明，DNA甲基化的全基因组变化影响胚胎发生的早期阶段拟南芥.

悬架开发

在野生型胚胎中，基底细胞伸长并横向分裂，形成7到9个细胞的胚柄(图1B到1E）。1E级). 在野生型悬浮体中，不会发生纵向分裂(图1Y). 相比之下，基底细胞谱系中的纵向细胞分裂检测到约27%(n个=266）纯合子金属1-62岁时的胚胎(图1H和和1N）1牛)和3 DAP(图1I和和1O）。1个O). 在野生型胚胎中，球形原胚和胚柄细胞的线性排列之间有一个清晰的边界(图1C)在4到6 DAP时，基底细胞系中最上层的细胞垂体变得突出(图1D到至1F）。1楼). 胚胎和胚柄之间的这种明确界限在金属1-6胚柄中许多纵向细胞分裂导致的突变胚胎(图1J,，1K，1公里、和和1U）。1U（美国）). 因此，DNA甲基化对于胚柄的正常发育是必要的拟南芥胚胎发生。

胚胎发育

在野生型胚胎中，顶端细胞经历两轮对称分裂，分裂面相互垂直，形成四细胞原胚(Goldberg等人，1994年). 在某些异常满足1胚胎，顶端细胞纵向分裂，但随后的分裂方向不正确(图1EE和1HH). 这有时会产生不对称胚胎，垂体一侧有两个细胞，另一侧没有细胞(图1DD和1GG). 此外，与野生型对照胚胎相比，这些胚胎的发育明显延迟。这些结果揭示了纯合子细胞分裂的早期平面金属1-6突变胚胎有时没有被正确指定。

细胞分裂的数量和平面上的异常始终存在满足1胚胎发生。野生型拟南芥在4到6个DAP时，胚胎经历了一系列形态上被定义为球状、心脏和鱼雷的阶段(图1D到至1F1楼和1AA）。在异常中满足1胚胎，由于胚柄基底细胞的纵向细胞分裂，我们观察到在顶端细胞和基底细胞谱系之间没有明确边界的异常胚胎(图1J,，1K，1公里,，1P，1P（1P）、和和1U）1U（美国）)或不显示顶基轴且其基底细胞谱系与顶细胞谱系相似的胚胎(图1Q和1FF）。我们还观察到金属1-6胚胎(图1V和和1W1瓦).

在野生型胚胎发生的过渡期和早期心脏期，两个对称的子叶从胚胎的侧域开始形成，胚芽顶端分生组织从两个子叶之间的内侧域分化出来(图1F) (Berleth和Chatfield，2002年;Prigge等人，2005年). 纯合子金属1-6胚胎，胚胎有时不能分化出两个子叶(图1L和1JJ）或启动三个子叶(图1R). 具有一个子叶的突变胚胎也缺少产生胚芽分生组织的中间区域。在F2纯合子中也观察到这种表型金属1-6幼苗，有一个缺乏顶端茎分生组织的子叶(图2B和2C)，两个异常子叶(图2D)，三个子叶(图2F和和2G），2G（2G）)或四个子叶(图2H). 综上所述，这些结果表明，DNA甲基化的缺失改变了生成胚胎固有轴、顶基轴、子叶和分生组织所需的细胞分裂的数量和平面。

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图2。

的影响金属1-6子叶和茎尖分生组织的突变。

在发芽后第5天以相同的放大倍数拍摄幼苗。钢筋=2 mm。

（A）和（E）野生型幼苗。

（B）到（D）和（F）到（H） 金属1-6幼苗。

部分主导效应金属1-6胚胎发生突变

为了检测父系或母系低甲基化基因组是否会影响胚胎发生，我们将纯合子相互杂交金属1-6野生型植物的植株，并检查F1种子内的胚胎发生。我们发现，母体或父体来源的低甲基化基因组足以导致异常胚胎发生(图3)和种子败育(表1). 母体低甲基化基因组的遗传导致16%的异常胚胎，而当父系基因组低甲基化时，8%的胚胎发育不正常。这些结果表明，低甲基化基因组对胚胎发生和种子败育具有部分显性效应。

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图3。

低甲基化的母体或父体基因组影响胚胎发育。

野生型胚胎和与野生型和金属1-6以3至6 DAP处理的植物。棒材=分别在3和5 DAP时为20和50μm。

配子发生过程中DNA低甲基化对胚胎发生的影响

植物杂合子金属元素1突变产生配子，配子在减数分裂期间发生低甲基化(Kankel等人，2003年;Saze等人，2003年). 为了确定配子发生过程中DNA甲基化的丢失是否足以影响胚胎和种子的发育，我们对杂合子进行了自花授粉金属1-6/met1种植并分析F1种子。大约10%的F1胚胎表现出与图1，约8%的F1种子败育(表1). 为了确定雌配子体或雄配子体中DNA甲基化的缺失是否足以干扰种子发育，我们与金属1-6/met1杂合子和野生型植物。当母本为杂合子时，约8%的F1胚胎在细胞分裂的数量和平面上表现出异常，2%的F1胚胎流产(表1). 当父系为杂合子时，这种影响减弱，分别有5%和1%的F1胚胎出现发育异常和流产(表1). 在与野生型植物的对照杂交中，我们没有发现任何异常的F1胚胎，只有0.3%的胚胎流产(表1). 这些结果表明，雌性或雄性配子发生期间DNA甲基化的丢失足以影响胚胎发生和种子活力。

基因突变之间的协同作用MET1型和CMT3型DNA甲基转移酶基因

一个假设解释了金属1-6植物产生有活力的种子是因为MET1型和CMT3型在生物学上是多余的；突变一个甲基转移酶不会导致100%的死亡，因为其他甲基转移酶仍然存在。为了验证这个假设，我们自花授粉MET1/MET1-6 cmt3-7/cmt3-7并对F1代进行了分析。在这些实验中，亲本植物从来都不是纯合子金属1-6突变，从而在雌、雄配子体中启动CpG低甲基化。我们发现23%的F1胚胎发育异常，而自花授粉的胚胎发育异常MET1/MET1-6和4%的cmt3-7/cmt3-7控件(表1). 根据对种子的目视检查，约16%的F1后代来自自花授粉MET1/MET1-6立方厘米3-7/立方厘米-7植物已经败育(表1). 我们确定了276株自花授粉幼苗的基因型MET1/MET1-6 cmt3-7/cmt3-7工厂。所有后代均为纯合子厘米3-7，36%为纯合子MET1型，60%为杂合子MET1/金属1-6，4%为纯合子金属1-6纯合子的比例为2:1MET1型和杂合子MET1/金属1-6后代（χ²=2.8，P>0.09）表明金属1-6减数分裂期间的等位基因，与大多数纯合子一致金属1-6不能产生活苗的种子。罕见金属1-6 cmt3-7纯合植物的身高与金属1-6和厘米3-7控制装置(图4)并且是无菌的（数据未显示）。因此，CpG和非CpG DNA甲基化的降低是由金属1-6和厘米3-7突变导致种子活力和植物健壮性的协同降低。

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图4。

表1-6和厘米3-7突变对拟南芥增长与发展。

拍摄了45天龄的代表性植物。棒材=2.5厘米英寸（A）到（D）和0.4厘米英寸（E）.

（A）野生型。

（B）纯合子厘米3-7.

（C）纯合子金属1-6.

（D）和（E）同一纯合子cmt3-7金属1-6植物。

细胞识别规范

胚柄中的纵向细胞分裂(图1H,、1I、，1I公司,，1N，1牛、和和1O）1个O)表明胚柄细胞正在接受胚胎命运(卢科维茨等人，2004年). 为了研究DNA甲基化是否会影响早期胚胎发生期间的细胞命运决定，我们分析了对细胞命运规范重要的基因的表达。如所示图5，的表达式YDA公司，一个有丝分裂原激活的蛋白激酶激酶基因(卢科维茨等人，2004年)，在纯合子中升高金属1-64 DAP时播种。相比之下WOX2型和工作8同源域转录因子基因在纯合子中减少金属1-64 DAP时播种。因此，DNA甲基化，无论是直接还是间接，都会影响早期胚胎发生过程中调节细胞身份的基因的转录。

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图5。

的影响金属1-6调节胚胎细胞特性的基因表达突变。

从野生型和纯合型中分离出RNA金属1-6种子。WOX2型,WOX8型,YDA公司、和肌动蛋白如方法所述，通过RT-PCR扩增RNA。

生长素梯度

异常表1-6突变胚胎(图1)类似于那些在建立生长素梯度方面有缺陷的人(Friml等人，2003年). 为了了解DNA甲基化与胚胎发生期间生长素梯度之间的关系，我们比较了DR5（数字参考5）：绿色荧光蛋白(GFP公司)转基因在野生型胚胎和纯合子中的表达金属1-6流产的胚胎。DR5（数字参考5）:GFP公司是一种合成的生长素反应启动子(DR5（数字参考5）)连接到GFP公司用于揭示野生型胚胎发生早期阶段的生长素梯度(Sabatini等人，1999年;Friml等人，2002a,2002年b). 如前所述(Friml等人，2003年),DR5（数字参考5）:GFP公司表达主要在3至4 DAP的基底细胞中，尤其是在垂体和上胚柄细胞中(图6). 最多5至6 DAPDR5（数字参考5）:GFP公司在根分生组织的静止中心、未来的小柱及其首字母中检测到活性，在发育中的子叶尖端和血管外链中弱表达(图5). 我们发现生长素梯度，正如DR5（数字参考5）:GFP公司启动子活性，在异常纯合子中没有正确指定金属1-6胚胎(图6).DR5（数字参考5）:GFP公司在4、5和6DAP时，异常胚胎的顶端或基底细胞衍生的细胞中表达相对均匀。这一结果表明，正常的DNA甲基化模式，无论是直接还是间接，都是在胚胎发生过程中持续产生生长素梯度所必需的。

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图6。

的表达式DR5（数字参考5）:GFP公司转基因异常金属1-6突变胚胎。

的缩微照片DR5（数字参考5）:GFP公司转基因在野生型和异常型中的表达金属1-63、4、5和6 DAP时的胚胎。对于每个胚胎，拍摄了两张显微照片，一张在明亮区域（顶部），另一张使用蓝光激发的外荧光（底部）。箭头指向顶端和基底谱系衍生细胞之间的边界。

PIN码1编码生长素外排载体并负责在早期胚胎发生中建立生长素梯度(2003年星期五;Weijers等人，2005年). 确定是否PIN码1启动子活性直接或间接受到DNA甲基化的影响，我们引入了PIN码1:GFP公司将基因转入金属1-6/met1杂合植物。如所示图7，在3和4 DAP的对照野生型植物中PIN码1:GFP公司转基因主要表达于球形胚胎本身，尤其是在胚胎本身的上半部分(Friml等人，2003年). 然而，在异常情况下金属1-6胚胎，PIN码1:GFP公司表达于整个胚胎本身，并均匀分布于顶端和基底细胞(图7). 这一结果表明，DNA甲基化直接或间接地调节PIN码1基因表达反过来又是建立生长素梯度所必需的。

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图7。

的表达式PIN码1:GFP公司转基因异常金属1-6突变胚胎。

的缩微照片PIN码1:GFP公司转基因在野生型和异常型中的表达金属1-63和4 DAP时的胚胎。对于每个胚胎，拍摄了两张显微照片，一张在明亮区域（顶部），另一张使用蓝光激发的外荧光（底部）。箭头指向亮视野中采集的顶端和基底谱系衍生细胞之间的边界，以及胚胎上半部分之间的平面，其中PIN码1:GFP公司主要在野生型胚胎中表达，下半部分在野生型胚中表达。

调控胚胎发生基因的DNA甲基化状态

DNA甲基化通常抑制基因表达(本德，2004). 胚胎发生可能在金属1-6突变，因为基因因缺乏抑制性DNA甲基化而表达错误或过度。或者，胚胎发生金属1-6由于异位从头甲基化和基因沉默，突变体可能存在缺陷，这一过程以前在DNA甲基化突变背景中已有记录(Chan等人，2005年).

为了研究DNA甲基化是否会直接影响胚胎调节基因，我们对从野生型或纯合子中分离的DNA进行了凝胶印迹分析金属1-6幼苗。基因组DNA用核酸内切酶消化血红蛋白II（CCGG）和Hpy公司CH4 IV（ACGT），在其识别序列中均被5-甲基胞嘧啶抑制。将消化后的DNA进行印迹，并与与5′-区、编码区和3′-区互补的标记探针杂交PIN码1和YDA公司由于这些基因在胚胎发生中的整体作用以及直接受MET1型.

我们在引脚1.野生型和满足1突变DNA大小相同幽门螺杆菌II和Hpy公司CH4 IV限制性片段，表明这些限制酶位点不存在5-甲基胞嘧啶（数据未显示）。因此，MET1可能间接影响PIN码1基因。相比之下，我们发现YDA公司基因在金属1-6突变背景。在5′-区、编码区和3′-区YDA公司,幽门螺杆菌II和Hpy公司CH4 IV位点在野生型DNA中未被消化，而这些位点在金属1-6DNA(图8). 这表明这些位点在野生型植物中甲基化，这种甲基化依赖于MET1型活动。因此金属1-6突变直接影响DNA甲基化YDA公司轨迹。这可能是较高的YDA公司在中检测到表达金属1-6突变种子(图5).

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图8。

DNA甲基化YDA公司基因。

野生型和金属1-6DNA被消化幽门螺杆菌II或Hpy公司CH4 IV，印迹并杂交到杂交到伊拉克国防部按照方法所述制备的5′-区、基因和3′-区。

（A） YDA公司5′-区。

（B） YDA公司基因。

（C） YDA公司3′-区域

讨论

DNA甲基化对拟南芥胚胎发育

拟南芥胚胎发育涉及细胞分裂的平面和数量的可预测模式(鲍曼和曼斯菲尔德，1994年). 我们发现，在有突变的胚胎中，这种模式并没有在很大一部分胚胎中保持MET1型和CMT3型DNA甲基转移酶基因(表1,图1). 我们观察到第一次不对称分裂的平面上有缺陷，产生顶端和基底细胞谱系，以及胚胎本身的分裂，形成不同的细胞层并分割球状期胚胎(Mayer等人，1993年). 晚期胚胎有时表现出基底细胞系的大量细胞增殖，从而失去其极性顶基轴(图1). 这可能归因于胚胎未能抑制胚柄的胚胎潜能，这一点以前已经观察到(杨和梅克，1993年;Yadegari等人，1994年). 许多畸形胚胎可能会中止发育，导致种子无法存活(图1,表1).

在这两种中都观察到多效性表型金属1-6和金属1-6 cmt3-7发育中的胚胎。这一事实使得我们很难精确定位在这些背景下直接受影响的发育过程和基因。然而，我们能够确定胚胎生长素梯度(图6)和PIN码1启动子活性(图7)非常不安金属1-6胚胎。生长素运输和信号传导缺陷的突变体也表现出多效性表型(Friml，2003年)，其中一些与此处描述的类似(图1).

DNA甲基化调控胚胎发生的机制

DNA低甲基化如何影响胚胎发生和降低种子活力拟南芥? DNA甲基化缺失导致沉默转座子失活(Kakutani等人，2004年)这些基因可以插入到早期胚胎发生所必需的基因中；然而，换位事件在一代人中发生的频率较低(Miura等人，2001年)不能解释金属1-6和金属1-6 cmt3-7突变体(表1). 一般来说，由于基因表达不当，低甲基化更容易导致表型缺陷(本德，2004)比如异位妊娠鱼类和野生动物管理局表达与延迟开花满足1突变背景(Soppe等人，2000年). 也有可能是异位高甲基化和基因沉默，这种现象发生在超人和阿加穆斯甲基化突变体的基因座(雅各布森等人，2000年)，可能负责一些金属1-6胚胎表型。因此，金属1-6胚胎发生可能受到干扰，因为低甲基化和异位高甲基化引起基因转录的变化。

我们发现WOX2型,WOX8型、和YDA公司介于野生型和金属1-6正在发育的种子(图5). 我们还发现PIN码1:GFP公司不正确地表示为异常金属1-6胚胎(图7). 如果DNA甲基化直接影响生长素梯度的建立，很可能不是通过调节PIN码1基因转录，因为在Hpy公司CH4 IV和血红蛋白II的站点PIN码1野生型或金属1-6植物。相比之下PIN码1，我们发现YDA公司该位点在野生型基因组中甲基化，这种甲基化依赖于MET1型(图8). DNA甲基化的丧失与YDA公司中的表达式金属1-6正在发育的种子(图5). 这种甲基化是否直接影响YDA公司表达式未知。YDA调节基底细胞的胚外细胞命运(卢科维茨等人，2004年). 可能有些金属1-6胚胎表型可归因于YDA公司然而，我们并不知道胚胎发生过程中直接受DNA甲基化调控的所有基因的数量或身份。它们很可能编码参与细胞代谢的调节蛋白和酶。

DNA低甲基化对胚胎发生、活力和种子大小的亲本效应

野生型亲本和低甲基化亲本之间由于反义表达的相互杂交MET1型转基因导致F1种子胚胎和胚乳大小发生改变(Adams等人，2000年). 低甲基化母亲基因组的遗传产生较大的胚胎和胚乳，而低甲基化父亲基因组的遗传则产生较小的胚和胚乳。据认为，一个亲本基因组的低甲基化允许正常沉默的印记等位基因的表达，这些等位基因影响种子大小(Adams等人，2000年). 我们观察到亲本对野生型和纯合型的互惠杂交后代种子大小的影响金属1-6植物（W.Xiao和R.L.Fischer，未发表的结果）与MET1型反义植物(Adams等人，2000年). 纯合子之间的互惠杂交金属1-6野生型父母也生产了一代流产胚胎的重要部分(图3,表1). 因此，低甲基化的母体或父系基因组足以对胚胎发生产生不利影响。这种部分显性效应可能是由于DNA甲基转移酶突变导致DNA甲基化缺失的区域再甲基化效率很低(Chan等人，2004年)允许母体或父系衍生基因组的低甲基化状态在F1杂合子代中持续存在。

与满足1野生型植物显示，母体基因组低甲基化的后代中异常F1胚胎的比例高于父体基因组低甲化的后代(表1). 这些结果表明，胚胎发生对母体基因组的低甲基化特别敏感，并支持母体基因组在控制早期种子发育中起主导作用的假设(Vielle-Calzada等人，2000年).

植物基因组中DNA甲基化的冗余

我们发现两种基因的突变MET1型和CMT3型基因对胚胎发生和种子活力的影响更大(表1)和工厂开发(图4)与其中一个基因的突变相比。这表明，在DNA甲基化在种子活力和植物发育中的作用明显之前，必须将其降低到临界阈值水平以下。在哺乳动物中，5-甲基胞嘧啶主要存在于单序列环境中，即CpG二核苷酸，由DNA甲基转移酶Dnmt1维持。功能丧失突变Dnmt1型基因消除了大多数DNA甲基化并导致胚胎死亡(Li等人，1992年). 相比之下，植物基因组在多个序列背景下（CpG、CpNpG和CpNpN）具有5-甲基胞嘧啶，由多种DNA甲基转移酶维持(本德，2004;Chan等人，2005年). 我们的结果表明，MET1和CMT3以部分冗余的方式对植物基因组进行表观遗传修饰。

方法

植物材料和生长条件

拟南芥植物在23°C的连续光照下在温室中生长。厘米3-7突变植株与MET1/金属1-6杂合植物，那么MET1/MET1-6 CMT3/CMT3-7在F1后代中选择植株MET1/MET1-6 cmt3-7/cmt3-7F2代获得植株。基因分型植物金属1-6和厘米3-7按说明进行(Lindroth等人，2001年;肖等人，2003).

整粒种子清理、组织学和显微镜

在霍耶氏液（70%水合氯醛、4%甘油和5%阿拉伯树胶）中清除1至6 DAP整粒未成熟种子，并使用Zeiss-Axioskop 50显微镜使用Nomarski光学进行观察。使用所述方法对种子进行薄片研究(Brown等人，1999年). 简单地说，种子固定在4%戊二醛中的0.1 M磷酸盐缓冲液中，pH为6.9，后固定在铁氰化锇中，通过分级丙酮系列脱水，并用斯珀尔树脂（EMS）渗透。用配备玻璃刀的LKB组织切片机在珠孔和柄平面上对胚珠进行矢状切片。2.0至5.0μm截面安装在玻璃载玻片上(Brown和Lemmon，1995年)并用多色染色(福克斯，1997年). GFP荧光显微镜按所述进行(Yadegari等人，2000年).

RT-PCR分析

如前所述进行RT-PCR分析(Kinoshita等人，1999年). 从野生型和金属1-64 DAP下的突变种子。实验中使用的引物如下：WOX2型,WOX2F型（5′-CGTTTTCTTCTACCCCCTCC-3′）和工作2小时（5′-ATCACGGAGGGCAATCTGT-3′）；对于WOX8型,WOX8F系列（5′-CCTTATCCTTCCTTCCA-3′）和WOX8R系列（5′-TTGGAGAACACGAGCTTG-3′）；对于YDA公司,YDA-F公司（5′-ATACCGGTGCTGGAGCCTGAT-3′）和YDA-R公司（5′-GTCGATCAAGAGAGAGAG-3′）。所有引物对跨越内含子序列，因此RNA的扩增可以与任何污染DNA的扩增区分开来。

DNA凝胶印迹分析

基因组DNA是从10天龄的野生型（哥伦比亚全球1)和金属1-6培养苗(Tai和Tanksley，1990年). DNA被甲基化离子敏感限制性内切酶切割血红蛋白II和Hpy公司CH4 IV在37°C下静置4小时，在1.2%琼脂糖凝胶上运行，并吸附到带正电荷的尼龙膜上（Amersham Pharmacia Biotech）。膜与使用Stratagene的Prime-It II（随机引物标记试剂盒）随机标记的探针杂交。用于扩增DNA进行放射性标记的引物如下：PIN码1启动子区，PIN1m_F1码（5′-CAAGGCGCACGAATTTTAGT-3′）和引脚1m_R4（5′-ATAGCTACGTATACGGAACC-3′）；对于PIN码1基因，PIN1m_F4码（5′-CGAGCGATTTTGTTAACTAGTG-3′）和引脚1m_R2（5′-TGAAGGAAAATGAGGGACCAG-3′）；对于引脚13′-基因间区，引脚1m3-F1（5′-GAGATTATCAAAACACAGGG-3′）和引脚1m3-R4（5′-AAGAATCGGTAAAAGGATACAC-3′）；对于YDA公司启动子区，pYDA-f1型（5′-TTTTTT CACTTTTAAATATTTGC-3′）和pYDA-r型（5′-GATCTTCTTCCCACAAACCA-3′）；对于YDA公司基因，YDAm-F1型（5′-ATGCCTCTGGTGGAGTAATCA-3′）和YDAm-R1型（5′-GGGTCCTCTGTTTTGATC-3′）；对于YDA公司3′-基因间区，YDAm-F2型（5′-CCCGTTTCGAGTCAAATGATTC-3′）和YDAm-R2型（5′-GTTTTCTCACTTGTCGATT-3′）。

接入号码

本文中的序列数据可以在GenBank/EMBL数据库中的登录号下找到AT1G73590型(PIN码1)和AT1G63700型(YDA公司).

致谢

我们感谢J.Penterman激发讨论并帮助编写这份手稿。我们还感谢M.Gehring、T.-F.Hsieh、J.H.Huh和D.Michaeli批判性地阅读了这份手稿，感谢J.Friml和ABRC（俄亥俄州哥伦布俄亥俄州立大学）提供了DR5（数字参考5）:GFP公司和PIN码1:GFP公司转基因种子。这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款GM069415和美国农业部拨款2005-02355的支持。

笔记

作者负责根据《作者须知》中所述的政策分发本文所述调查结果的完整材料(网址：www.plantcell.org)是：Robert L.Fischer(ude.yelekreb@rehcsifr网站).

文章、出版日期和引文信息可在www.plantcell.org/cgi/doi/10.1105/tpc.105.038836.

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文章来自植物细胞由以下人员提供牛津大学出版社