在研究体性腺和生殖系之间的通讯时，我们发现JAK/STAT通路在雄性生殖细胞中特异性激活，但在雌性生殖细胞中没有激活。在果蝇，JAK/STAT信号（参见5)当UPD或UPD样配体与跨膜受体（Domeless）结合，激活磷酸化STAT92E转录因子的janus激酶（JAK），Hopscotch（HOP）时启动。STAT激活已被证明可以调节统计基因表达6并可诱导STAT92E蛋白的上调，可用于JAK/STAT通路激活的检测。我们发现STAT92E在性腺形成时在男性生殖细胞中特异性上调，但在女性生殖细胞中没有上调(). 这反映了JAK/STAT通路的男性特异性激活，因为（i）STAT92E的激活形式（磷酸化-STAT92E）也仅在男性生殖细胞中检测到()和（ii）JAK活性对于STAT92E表达是必要和充分的。JAK抑制剂的表达，Socs36E公司 7导致雄性生殖细胞中STAT92E表达缺失()和组成活性JAK的表达8(单足蹦跳TumL（翻转）)在雌性生殖细胞中诱导STAT92E(). 此时STAT92E的雄性特异性激活与早期胚胎生殖细胞中STAT92E的激活不同，后者不是性别特异性的，由MAP激酶途径调节9。
Jak/Stat通路在雄性生殖细胞中被激活。a-f型胚胎性腺（15期）与抗Vasa（红色）和抗STAT92E联合免疫标记(a、 b、e、f，绿色）或抗磷-STAT92E(c、 d日，绿色）。较小的面板分别显示红色（'）或绿色（''）通道。性别在本图和随后的图中确定，如所述（方法）。a–d.野生型雄性(a、 c（c）)和女性(b、 d日)性腺。e（电子）雄性胚胎，生殖细胞表达Socs36E公司（无人机-Socs36E；纳米-镀锌4）。（f）.生殖细胞表达单足蹦跳TumL（翻转）（无人机-单足蹦跳TumL（翻转）;纳米-镀锌4）。面板中的比例尺（12.5μm）一适用于面板a–f。
我们还发现，STAT92E在雄性生殖细胞中的表达依赖于它们与体性腺的联系。迁移至性腺的生殖细胞中未检测到STAT92E()但在雄性生殖细胞接触体性腺后检测到(). STAT92E的表达在艾娅突变体（数据未显示），体性腺特性开始，但未保持10此外，野生型胚胎性腺外的生殖细胞中未检测到STAT92E(，箭头）或在错误放大的生殖细胞中乌能()和HMG-CoA还原酶（数据未显示）缺乏指向体性腺生殖细胞的指导线索的突变体11,12然而，在这些相同的突变体中，在接触雄性胚胎体性腺的少数生殖细胞中检测到STAT92E(插图）。
Jak/Stat通路被雄性体性腺激活。除非另有说明，否则胚胎为15期和野生型。a–d，抗Vasa（红色）、抗STAT92E（绿色）。a、 b、，雄性11期(一)和阶段13(b条). 图示为性腺（轮廓）和生殖细胞错位（箭头）。c（c）、男性生殖细胞的错位乌能总工程师突变体（插图：同一胚胎性腺中的生殖细胞）。d日男性躯体中的.XX生殖细胞(dsx公司D类/dsx公司1)。e、 （f）,更新核糖探针（红色）和抗Vasa（绿色）。更新表示为(e（电子）)男性而非男性(（f）)雌性性腺。g、 小时、抗Vasa（红色）、抗STAT92E（绿色）。Gonads进入(克)XY Df（os）1a个)胚胎和(小时)生殖细胞表达的雌性胚胎Upd（升级）（无人机-更新；纳米-镀锌4）。比例尺（12.5μm）英寸一和d日应用于a-c公司或d–h，分别是。
STAT92E在生殖系中的表达取决于周围躯体的性别。当XX（正常情况下为女性）生殖细胞存在于通过表达雄性体细胞性别决定基因而雄性化的体细胞中时双性(dsx公司)13，生殖细胞现在表达STAT92E()。dsx公司在生殖细胞本身中不起自主作用14表明这些胚胎中STAT92E的诱导是由体细胞雄性化引起的。相反，当XY（通常为男性）胚胎的体性腺通过性别决定基因的表达而女性化时变压器(特拉)在中胚层而非生殖细胞中，在XY生殖细胞中不再观察到STAT92E的表达（数据未显示）。综上所述，这些数据表明，雄性体性腺对于激活XX或XY生殖细胞中的JAK/STAT通路是必要的和充分的。
与此一致的是，我们发现JAK/STAT配体，更新，在雄性而非雌性体性腺中特异表达(). 在胚胎中不再检测到STAT92E在雄性生殖细胞中的表达更新和两个同源物，更新2和更新3 15，已删除（Df（os1a个);). 由于男性生殖细胞从胚胎突变为更新仅STAT92E仍表达（数据未显示），生殖系中JAK/STAT的激活可能受到以下因素的冗余调节更新及其一个或多个同源物。此外更新中胚层（数据未显示）或生殖细胞()足以诱导XX生殖细胞中STAT92E的表达。的表达式更新2或更新3也能够在生殖细胞中诱导STAT92E（数据未显示）。
更新对胚胎图案也很重要16和体细胞性别决定17,18。有趣的是，更新在索马里促进女性身份17,18，但在生殖系中促进男性发育（见下文）。为了验证更新对生殖系的其他影响不是间接引起的更新，我们检查了胚胎分割（Engrailed）、体细胞性别决定（sex致死）、体细胞核特性（无眼）和体细胞性腺性别特性（Sox100B）的指标（数据未显示）。Df（操作系统1a个)半合子男性胚胎出现了预期的分割缺陷16但形成的性腺表达正常的体细胞和性别特异性标记。体外表达的胚胎更新各方面检查均正常。
接下来，我们研究了雄性体性腺对JAK/STAT通路的激活是否调节雄性生殖细胞的特异性发育。在成人睾丸中，JAK/STAT通路是维持生殖系干细胞所必需的19,20这使得在现阶段很难评估此途径在男性生殖细胞鉴定中的作用。相反，我们在胚胎发生和幼虫早期检查了生殖细胞，当时生殖细胞的发育首次变得两性异形。在小鼠生殖系中，性别决定的最早表现是体细胞对生殖系细胞周期的差异调节4.英寸果蝇属生殖细胞在形成后会经历1-2次分裂，但在生殖细胞迁移过程中会停滞在细胞周期中，只有在性腺形成后不久才恢复分裂21,22由于幼虫睾丸含有的生殖细胞比幼虫卵巢多23，我们研究了雄性和雌性生殖细胞的增殖调节是否不同。事实上，生殖系中有丝分裂标记物（磷酸组蛋白-H3）的性别特异性分析表明，生殖细胞增殖在性腺发育的早期阶段完全是雄性特异性的(). 此外，雄性特异性生殖细胞的分裂依赖于雄性体性腺。雄性生殖细胞在艾娅缺乏体性腺或体内失去生殖细胞的突变体乌能突变胚胎。雄性体细胞中的XX个生殖细胞(dsx公司 D类 /dsx公司1)增殖，而XY生殖细胞在女性化的胞体中（UAS-特拉F类;扭曲-Gal4）没有。因此，生殖细胞增殖模式与生殖细胞中JAK/STAT通路的活性密切相关。
表1
胚胎性腺中生殖细胞的分裂具有雄性特异性，并受JAK/STAT通路的调控。
| 基因型 | %具有1个或多个分裂生殖细胞的XY胚胎（n） | %有一个或多个分裂生殖细胞的XX个胚胎（n） |
|---|
| 野生型1 | 28.0 (147) | | 0 (170) | |
| 眼睛缺失 | 0 (69) | | ND（无损检测） | |
| 乌能-生殖细胞错位2 | 0 (42) | | ND（无损检测） | |
| 乌能-性腺生殖细胞2 | 33.0 (42) | | ND（无损检测） | |
| dsx公司D类/dsx公司1-男性化躯体 | 39.0 (41) | | 24 (33) | |
| 扭转-Gal4/UAS公司-特拉F类-女性化躯体 | 0 (42) | | 0（40） | |
| 状态92E 06346 | 4.0 (101) | }P=2.1 x 10−7Ψ | 0 (90) | |
| 控制三 | 28.0 (232) | 0 (214) | |
| 无人机-Socs36E；纳米-镀锌4 | 6.3 (111) | }P=3.2 x 10−9Ψ | 0 (103) | |
| 控制4 | 38.8（85） | 0 (88) | |
| Df（操作系统1a个) | 7.5 (94) | }P=1.1 x 10−6Ψ | 不适用Δ | |
| 控制三 | 35.1 (94) | ND（无损检测） | |
| 无人机-更新；纳米-镀锌4 | 55.0 (40) | | 19.0 (58) | }P=7.8 x 10−4Ψ |
| 控制三 | 21.7 (46) | | 0 (46) |
为了评估JAK/STAT信号是否调节雄性特异性生殖细胞分裂，我们检测了缺乏合子的胚胎状态92E并观察到雄性生殖细胞增殖急剧下降(). 在upd/upd-like型突变型（Df（os1a个))在JAK抑制剂的胚胎中Socs36E公司在生殖细胞中表达。因此，生殖细胞内需要JAK/STAT活性才能在性腺中进行适当的雄性特异性生殖细胞分裂。我们还发现更新在生殖系中足以诱导雌性生殖细胞增殖。因此，JAK/STAT通路可以诱导XX生殖细胞表现出这种雄性特异性生殖细胞行为。
接下来我们研究JAK/STAT通路是否调节男性生殖细胞发育的其他方面。雄性生殖系标记-1（mgm-1）是一个lacZ公司增强子陷阱系在雄性生殖细胞中表达，但在雌性生殖细胞中不表达，因此是雄性生殖细胞特性的标记24（请参见). 通过去除合子抑制JAK/STAT通路状态92E活动不影响毫克-1胚胎中的表达（数据未显示），这与最初的预期一致毫克-1表达依赖于生殖细胞自主线索25然而，去除合子状态92E活动完全取消毫克-1在一龄幼虫中表达。野生型一龄雄性幼虫(),毫克-1在大多数生殖细胞中观察到表达，这些细胞可能是正在发育的雄性生殖系干细胞和精原细胞。不毫克-1在中观察到表达状态92E-突变幼虫()β-半乳糖苷酶仅在胞体中观察到表达，而在种系中未观察到表达状态92EP元件等位基因(). 在一项实验中，预计25%的幼虫都是雄性，并且含有毫克-1增强子诱捕器（见方法），野生型幼虫23.2%（n=262）毫克-1在生殖细胞中表达，而没有状态92E突变幼虫（n=55）表现出生殖细胞毫克-1表达式(; 这与野生型同胞显著不同，P=2.9x10−5). 因此，状态92E突变体对雄性生殖系的发育有很强的影响，一些雄性生殖系细胞类型要么缺失，要么身份改变。
JAK/STAT激活调节雄性特异性生殖细胞行为。a–d。幼虫（L1）性腺。抗-Vasa（红色）、抗-β-Gal（绿色）。a、 b。 毫克-1中的表达式(一)男性和(b条)女性来自毫克-1/+X（X）Kr-GFP公司/年。c。男性状态92E063461号交配突变体（方法）毫克-1在生殖细胞中表达。d。男性状态92E 06346/+显示躯体状态92E 06346增强子陷阱表达。例如：。 毫克-1在16期性腺中的表达（X-gal染色）(e（电子）)男性(（f）)女性和（g）异位表达胚胎更新（配合#2，方法）。h–j。 数字功率放大器表达式(就地杂交）在17期性腺（圆圈）(小时)男性(我)女性和(j）异位表达的女性胚胎更新（配合#3，方法）。比例尺（12.5μm）英寸一和e（电子）应用于a–d和e–j分别是。
最后，我们评估了JAK/STAT通路的激活能在多大程度上使女性生殖细胞雄性化。雌性生殖细胞表达更新虽然我们激活了男性特有的信号，但这些生殖细胞仍然处于女性的躯体环境中，并保留着女性生殖细胞的自主线索，因此我们不希望完全男性化。事实上，这样的胚胎产生了可生育的成年雌性，这表明至少有一些生殖细胞保留或恢复了雌性身份（数据未显示）。这可能部分是由于更新在成年雌性生殖系中表达的结构26然而，更新足以在胚胎XX生殖细胞中诱导雄性特异性基因表达。While期间毫克-1通常只在雄性生殖细胞中表达(),毫克-1在所有胚胎中表达（100%，n=71，)何时更新是外胚层表达的。此外，我们还鉴定了两个新的雄性生殖系标记，椎间盘增殖异常和微小染色体维持5（mcm5）(以及未显示的数据），这也可能是由更新然而，这些基因通常只在雄性生殖细胞中表达(数字功率放大器：96%男性，n=56，0%女性，n=63；微小染色体维持蛋白5：89.7%男性，n=68，0%女性，n=70），女性胚胎在更新是外显的(和数据未显示）。在一项实验中，预计只有50%的胚胎表达异位更新在生殖系（见方法）中，32.5%的女性胚胎表达数字功率放大器（n=135）和21.3%表示微小染色体维持蛋白5（n=47）。因此，更新这种表达足以激活雌性生殖细胞中雄性特异性基因的表达。
我们的数据表明，JAK/STAT途径介导来自雄性体性腺的关键信号，这是雄性生殖细胞发育所必需的。该信号可能与雄性生殖细胞自主线索一起作用，促进雄性生殖系识别和精子发生。这种信号也足以激活男性在女性生殖细胞中的增殖模式和基因表达，即使这些生殖细胞保留女性生殖细胞的自主线索并存在于其他女性体细胞中。在未来，识别额外的（例如雌性）体细胞信号以及生殖细胞自主线索，并评估这些因素对正常生殖系性发育的相对贡献，将是非常有趣的。因为这是两种性别特异性生殖细胞行为的最早表现之一果蝇属而小鼠是通过体性腺调节生殖系细胞周期的，进一步确定体细胞信号是否在果蝇属在哺乳动物生殖系性别决定中起着类似的作用。
方法
飞行股票
w个1118、广州-S和ru-st-faf-lacZ e ca苍蝇被用作野生型。扭曲-Gal4和24B个-Gal4（中胚层驱动器）和纳米-Gal4:：VP16（生殖细胞驱动程序）用于表达文本中所示的以下UAS结构：UAS-更新（M.Zeidler），无人机-CG5988（更新2），无人机-CG5963（更新3）和UAS-跳跃TumL（翻转）（D.Harrison），阿联酋-Socs36E公司（B.Mathey-Prevot），阿联酋-特拉F类和UAS-mCD8:：绿色荧光蛋白其他股票包括：毫克-1（M.Steinmann-Zwicky），状态92E06346,Df（操作系统1a个)（D.Harrison），更新YM55年，乌能总工程师（K.霍华德），hmgcr（hmgcr）clb1类,艾娅cli-IID,dsx公司D类和dsx公司1任何未指明的股票均来自Van Doren Lab或Bloomington Stock Center(http://flybase.bio.indiana.edu/)。
免疫细胞化学、原位杂交和X-gal染色
按照胚胎的描述进行免疫细胞化学27和幼虫28除0.1%吐温-20在幼虫的超声和免疫染色过程中被Triton X-100替代外。为了定量生殖细胞分裂，从25°C放置6小时，然后在18°C放置21小时的收集物中获取胚胎进行固定。使用在25°C下老化30-48小时的幼虫进行幼虫分析。核糖核酸就地按照描述进行杂交27杂交进行20–48小时，并使用比色（NBT/BCIP）或荧光（HNPP，罗氏）碱性磷酸酶底物进行揭示。更新通过消化制备反感核糖探针pBS-KS公司+-更新使用HindIII，并使用地高辛标记的UTP（Boehringer-Mannheim）用T7聚合酶（Promega）转录。数字功率放大器和微小染色体维持蛋白5通过消化产生反义核糖探针pFLC-1型-数字功率放大器或pFLC-1型-微小染色体维持蛋白5（克隆自CHORI BACPAC Resources的RE04051和RE67590）分别用SacI或SmaI，然后用T3聚合酶（Promega）转录。胚胎的X-gal染色如前所述29反应持续48小时。
抗体
使用了以下主要抗体：1:10000的鸡抗Vasa（K.Howard）；兔抗STAT92E（S.Hou）1:1000；兔α-磷酸-STAT92E（细胞信号技术），1:50；兔抗磷组蛋白H3（Upstate Biotechnology）1:1000；兔子α-Sox100B（S.Russell），1:1000；1:3000的兔子抗GFP（Torrey Pines）；兔抗β-半乳糖（Cappel），1:10000；小鼠抗β-半乳糖（Promega）1:1000；小鼠抗SXL-M18（发育研究杂交瘤库（DSHB；P.Schedl），1:300；小鼠抗EN-4D9（DSHB；C.Goodman），1:2；小鼠抗EYA-10H6（DSHB；N.Bonini），1:25；1:2000的AP结合羊抗地高辛（罗氏）。1:500使用的二级抗体包括：Alexa488-和Alexa546-山羊抗兔、Alexa488和Alexa568-山羊抗鼠；Alexa546-山羊抗鸡（全部来自分子探针）、Cy5-山羊抗兔（Amersham-Pharmacia）和Cy5-羊抗鸡（Rockland）。
全山胚胎和幼虫分析
胚胎和幼虫被安装在PBS中70%的甘油中，0.1%Triton X-100（Sigma）或2.5%DABCO（Sigma70%甘油）。使用蔡司Axioplan光学显微镜或蔡司510 Meta共焦显微镜观察样品。根据Campos-Ortega和Hartenstein进行胚胎分期30使用表达GFP的平衡染色体确定胚胎的基因型27使用学生t检验进行统计分析，假设方差相等，以比较测试样本与对照样本。
胚胎和幼虫的性别可以通过女性特异性抗SXL抗体的免疫染色来确定(面板e、f；小组a–d，h）或男性特异性抗Sox100B抗体()或使用携带P{Dfd-lacZ-HZ2.7}（W.McGinnis）的X染色体(;)或FM7c、P{GAL4-Kr.C}、P{UAS-GFP.S65T}(;)（图中未显示通道）。标记的X染色体只存在于雄性父母中，因此只由雌性胚胎遗传。
使用1号交配的胚胎（如下）进行检查毫克-1中的表达式状态92E突变幼虫。状态92E通过体性腺中缺乏GFP表达来鉴定突变体。这些幼虫还用抗Sox100B标记，以确保获得正常比例的雄性幼虫。使用2号交配的胚胎来确定更新上的表达式毫克-1在生殖细胞中表达。毫克-1/无人机-更新；纳米-Gal4/+胚胎由毫克-1前体细胞中的表达，结合缺乏ftz-lacZ型表达式。使用3号交配的胚胎来检测更新上的表达式数字功率放大器和mcm-5型表达式。胚胎性别取决于是否存在Dfd-lacZ公司表达式。
