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美国国家科学院院刊。2006年2月14日；103(7): 2257–2261.
2006年2月3日在线发布。 数字对象标识：10.1073/pnas.0510565103
预防性维修识别码：项目经理1413718
PMID：16461460

人类实体肿瘤的microRNA表达特征确定了肿瘤基因靶点

斯特凡诺·沃利尼亚,*†‡ 乔治·A·卡林,*‡ 刘畅（Chang Gong Liu）,* 斯特凡·安布斯,§ 阿米莉亚·西米诺,* 法比奥·彼得罗卡,* 罗莎·维松,* 玛丽莲娜·伊奥里奥,* 克劳迪娅·罗尔多,* 曼纽拉·费拉辛, 罗宾·L·普鲁埃特,§ Nozumu Yanaihara公司,§ 乔瓦尼·兰扎, 阿尔多·斯卡帕,∥ 安德烈亚·维基奥内,** 马西莫·内格里尼, 柯蒂斯·C·哈里斯,§和卡洛·克罗斯*††
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

小的非编码microRNAs（miRNAs）可以促进癌症的发展和进展，并且在正常组织和癌症中有不同的表达。通过对540个样本（包括肺、乳腺、胃、前列腺、结肠和胰腺肿瘤）的大规模miRNA分析，我们确定了一个由大量过表达miRNA组成的实体癌miRNA特征。在这些miRNAs中，有一些具有良好特征的癌症相关性，例如miR-17-5p,miR-20a型,miR-21型,miR-92基因,miR-106a型、和miR-155型差异表达miRNAs的预测靶点显著丰富了蛋白质编码的肿瘤抑制因子和癌基因(对< 0.0001). 许多预测的靶点，包括肿瘤抑制因子RB1（视网膜母细胞瘤1）和TGFBR2（转化生长因子，β受体II）基因已通过实验证实。我们的结果表明，miRNAs广泛参与实体肿瘤的癌症发病机制，并支持其作为显性或隐性癌症基因的功能。

关键词：微阵列、转录组、肿瘤发生

微RNA（miRNAs）是最近发现的一类调节基因表达的非编码小RNA(1). 成熟的miRNAs是由两种RNase III酶Drosha和Dicer介导的初级转录物（pri-miRNAs）顺序处理的结果(2). 成熟的18-24nt长的miRNAs通过翻译抑制或mRNAs降解负调控特定mRNA的蛋白表达(三). miRNAs在人类癌症中有差异表达。我们之前曾报道过miR-15a型和miR-16-1型位于慢性淋巴细胞白血病（CLL）中损失最小的30-kb区域，并且这两个基因经常被删除或下调(4). 后来，其他研究小组报告了结肠直肠癌中miRNA表达的变化(5)，小儿Burkitt淋巴瘤(6)，肺癌(7)，大细胞淋巴瘤(8)、胶质母细胞瘤(9)和B细胞淋巴瘤(10). miRNAs也可以促进肿瘤的发展(11). miR-17/92簇与c-MYC合作加速肿瘤发展(12,13). 我们描述并验证了一个微阵列平台来评估miRNA的全球表达(14). 最近，基于微珠的流式细胞术也被用于对人类癌症进行分类，并观察到miRNAs的普遍下调，131个差异调节的miRNAs中有129个在癌症中表达不足(15). 我们使用包含活性和前体分子特异探针的微阵列平台来研究B-CLL中的miRNA谱(16,17)以及其他癌症特异性miRNA图谱，包括乳腺癌(18). 由于有许多证据表明miRNA与癌症有关，因此阐明它们在实体肿瘤中的作用并进一步揭示常见的miRNA驱动途径具有重要意义。

结果和讨论

有关更多详细信息，请参阅图4和表3-14，它们作为支持信息发布在PNAS网站上。

我们在这里描述了对来自六个实体肿瘤的540个样本的miRNA图谱的大规模详细分析（见表3）。363例实体癌和177例正常标本中228个miR的miRNA表达谱的聚类如图所示图1这棵树是用137种不同的miRNAs构建的，它们在至少90%的样本中表达，并且显示出不同组织之间的良好分离。我们最初将所有肿瘤与所有正常组织进行比较，以确定26种过表达和17种低表达的miRNA（表4）。这些结果表明，在实体癌中，表达的miRNA的谱与正常细胞的谱有很大不同（137个miRNA中的43个，31%）。进行此分析是为了使用与Lu相同的方法评估结果等人。(15). 癌症组织与正常组织的比较是通过使用减少的肺样本子集（80个癌症和40个正常样本）进行的，因此在数量上平衡了不同组织，总共404个样本。为了进行统计分析，从228个测量中保留了137个miR，其中至少90%的样本中的表达值高于256（阈值）。A类吨该试验用于识别差异表达的miRNAs（表11）。这个对的值吨该测试针对多个测试程序进行了校正，以控制I型错误率。已调整对通过对500000个排列进行重采样获得值(19). 我们获得了43 miRs的调整值对值<0.05。当将六种实体癌（乳腺癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌）归为一组时，20～29个miR过度表达，17个miR表达不足。作为替代方案吨试验中，我们使用微阵列显著性分析（SAM）来鉴定差异表达的miRNAs。此程序允许控制假检测率（FDR）。选择δ导致FDR≤0.01，检测到49 miRs差异表达，其中34 miRs上调（表12）。然后，我们使用微阵列预测分析中实施的最近收缩质心方法，确定了在所有组织中产生最佳肿瘤分类的miRNA子集，即，该子集可以最佳预测两类（癌症和正常）。通过10倍交叉验证计算预测误差。交叉验证后，选择的miRNAs产生的错误分类误差最小。癌症中36个过度表达的miRNA与阳性癌症评分相关，21个下调的miRNA则与阴性癌症评分相关（表13）。

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对代表六种实体癌和各自正常组织的540个样本进行聚类分析。当MiRNAs在至少90%的样本中的表达水平（背景吸收强度）高于阈值（256）时，将其纳入树中。保留了137个miRNA进行聚类。阵列以中位数为中心，并通过使用基因簇2.0使用无中心相关度量进行平均连锁聚类。

这一总体分类可能无法确定持续导致转化的组织特异性miRNA改变，因为miRNA表达具有高度组织特异性，如图1因此，为了确定真正能预测癌症状态的miRNAs，而不因组织特异性而产生偏见，我们使用了另一种方法。我们首先通过对微阵列测试进行独立预测分析（总结于表1和5-10），然后选择不同组织型miRNA签名之间共享的miRNA(表2). 要计算对对于这个多问题组合分析的值，我们对miRNA身份进行了1000000个随机排列的重采样测试。得分定义为miRNAs达到共享阈值的频率之和（三个肿瘤）。这个对数值被定义为模拟分数超过实际分数的相对频率。表2包括至少三种实体癌常见的21种失调miRNA(对值=2.5×10−3)并显示了六种实体癌特征中每个miRNA的频率。

表1。

miRNAs用于人类癌症和正常组织分类

癌症上调miR下调的miR10倍交叉验证后的误分类错误
乳房15120.08
科隆2110.09
肺35三0.31
胰腺5520.02
前列腺3960.11
胃2260.19

进行中位数归一化，并使用最近的收缩质心的方法来选择预测性miRNA(28).

表2。

六种实体癌的特征共有的miRNAs

miR公司N个肿瘤类型
miR-21型6乳房、结肠、肺、胰腺、前列腺、胃
miR-17-5p5乳房、结肠、肺、胰腺、前列腺
miR-191型5结肠、肺、胰腺、前列腺、胃
miR-29b-2型4乳房、结肠、胰腺、前列腺
miR-223型4结肠、胰腺、前列腺、胃
miR-128b型三结肠、肺、胰腺
miR-199a-1型三肺、胰腺、前列腺
miR-24-1三结肠、胰腺、胃
miR-24-2型三结肠、胰腺、胃
miR-146型三乳房、胰腺、前列腺
miR-155型三乳房、结肠、肺
miR-181b-1型三乳房、胰腺、前列腺
miR-20a型三结肠、胰腺、前列腺
miR-107型三结肠、胰腺、胃
miR-32型三结肠、胰腺、前列腺
miR-92-2三胰腺、前列腺、胃
miR-214型三胰腺、前列腺、胃
miR-30c型三结肠、胰腺、前列腺
miR-25型三胰腺、前列腺、胃
miR-221型三结肠、胰腺、胃
miR-106a型三结肠、胰腺、前列腺

该列表包括3种或更多种中21种常见上调的microRNA(N个)实体癌的类型(对值=2.5×10−3).

为了尽量简洁，我们计算了六对癌症/正常人的miRNA绝对表达水平的平均值。无论疾病状态如何，这些miRNAs都能正确地将不同组织聚集在一起(图2A类).图2B类显示了不同肿瘤中常见miRNA相对于正常组织的差异表达。该树根据miRNA子集的折叠变化显示不同的癌症类型。前列腺、结肠、胃和胰腺最为相似，而肺和乳腺的特征则截然不同(图2B类).图2明确显示哪些miRNAs与特定类型的癌症相关。引人注目的是，miR-21型,miR-191基因、和miR-17-5p在我们考虑的所有肿瘤类型中均显著过度表达，或分别在六分之五的肿瘤类型中显著过度表达。miR-21型据报道在胶质母细胞瘤中过度表达并具有抗凋亡特性(9). 肺癌的一部分特征与乳腺癌相同，另一部分特征则与其他实体肿瘤相同，包括miR-17型/20/92，miRNA簇的所有三个成员都与c-Myc积极合作以加速淋巴腺病(12). 这些miRNAs的过度表达是对我们方法的极好证实。激活的第二个miRNA组包括miR-210型和miR-213型; 与一起miR-155型已报道在大细胞淋巴瘤中扩增(8)，患有Burkitt淋巴瘤的儿童(6)和各种B细胞淋巴瘤(10)，这些miRNA是唯一在乳腺癌和肺癌中上调的miRNA。miR-218-2型在结肠癌、胃癌、前列腺癌和胰腺癌中持续下调，但在肺癌和乳腺癌中不下调。

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六种实体癌的miRNA表达特征。(A类)不同调节的miRNA在实体癌中的表达。至少90%的组织中存在61个miRNA。树显示log2转换后的平均绝对表达式值。计算来自相同组织或肿瘤组织类型的所有样本的平均值。基因和阵列以平均值为中心，通过使用基因簇2.0利用欧氏距离进行平均连锁聚类。(B类)至少75%的实体肿瘤中存在miRNAs的折叠变化（癌症与正常），其中至少有一个肿瘤绝对值高于2。该树显示平均折叠变化的log2转换（癌症高于正常）。计算来自相同组织或肿瘤组织类型的所有样本的平均值。数组以平均值为中心，并使用基因簇2.0使用无中心相关度量进行平均连锁聚类。(C类)至少50%实体肿瘤的特征中存在miRNAs的折叠变化（癌症与正常）。该树显示平均折叠变化的log2转换（癌症高于正常）。计算来自相同组织或肿瘤组织类型的所有样本的平均值。数组以平均值为中心，并使用基因簇2.0使用无中心相关度量进行平均连锁聚类。

几项观察进一步加强了我们的结果。首先，在本研究中，我们测定了大多数基因前体miRNA和成熟miRNA的表达水平。值得注意的是，除了miR-212型和miR-128a型，在所有其他情况下，异常表达区域是与活性部分相对应的区域，是唯一与靶mRNA相互作用的区域。第二，如图2C类在不同类型的癌症中，实体癌miRNA特征的表达变异通常是单一的（即下调或上调），这表明参与人类肿瘤发生的共同机制。第三，通过溶液杂交对12个乳腺样本的微阵列数据进行验证(18) (miR-125b型,miR-145型、和miR-21型)17例内分泌胰腺癌和正常人(miR-103型,miR-155型、和miR-204基因)（C.R.和C.M.C.，未发表的数据），有力地证实了我们微阵列数据的准确性。

我们没有观察到Lu最近报道的癌症中几乎完全下调了miRNA（129/131）等人。(15). 我们的工作和卢的工作之间的区别等人。可能是由于样本数量的差异（Lu等人。使用<100个活检，全部来自>10个不同的实体癌类型）或不同的技术平台。值得注意的是，已证实的致癌miRNAs，如miR-155型,miR-17-5p,miR-92-1型、和miR-21型未在Lu中识别等人。的论文被过度表达。相反，令人惊讶的是，miR-17-5p,miR-20型、和miR-92型被描述为在肿瘤中调节不足。使用了不同的分析方法；卢等人。分析了所有肿瘤轮廓与所有正常轮廓，而不是像我们一样进行单独的组织匹配分析。在所有肿瘤与所有正常人的比较中，我们正确地检测到miR-21基因和miR-17-5p在癌症中过度表达，与已发表的文献一致(9,13).总体上吨测试分析和所选miRNAs的组织特异性癌症表达。然而，有时该程序可能会产生误导：例如，在我们的样本集中，miR-155型在乳腺、肺和结肠中过度表达(图2C类)但由于在正常胰腺中，当进行所有肿瘤与所有正常胰腺的比较时，其表达强烈上调，miR-155型在实体肿瘤中表现为下调，尽管具有临界意义(对值=0.04）。

我们在这里展示的miRNA失调在癌症中的功能意义需要理解。在实体肿瘤中，最常见的miRNA事件是表达增加，而在癌症中表达减少是一个更有限的事件，更具有组织特异性。我们按照以下顺序使用了三步间接法：首先，生物信息学预测靶点，然后进行荧光素酶分析，以首次验证癌症相关靶点，最后，离体特定miRNA:：mRNA相互作用物对的miRNA表达（通过微阵列）和靶蛋白表达（通过Western blotting）之间的肿瘤相关性。癌症miRNAs的相关靶点可以是隐性（抑癌基因）或显性（癌基因）癌症基因。为了验证这个假设，我们首先使用了生物信息学利用保守的3′UTR miRNA靶点数据库TargetScan识别预测miRNA靶区的方法(20). TargetScan包含对18种miRNA的5121个预测（在表2)在22402个（26.5%）预测的miRNA中。共有115个已知癌症基因（263个，44%）被预测为这18个miRNAs的靶点（表14）。由于偶然性，癌症miRNAs靶向的癌症基因比例如此之高是不太可能的(对<0.0001，Fisher精确测试）。

然后，我们通过实验证实了对视网膜母细胞瘤（RB1）、TGF-β-2受体（TGFBR2）和PLAG1这三种不同癌症基因的电子预测。在荧光素酶分析中，发现四种miRNA:：mRNA预测的相互作用中有三种（75%）呈阳性，这是因为与扰乱的对照寡核苷酸相比，蛋白质翻译显著减少(图3A类). 例如，发现视网膜母细胞瘤3′UTR在功能上与miR-106a型先前的报告表明，Rb1基因在结肠癌中正常转录，而不同部分的细胞不表达Rb1蛋白，这进一步证实了miRNA:：mRNA相互作用的生物学意义(21). 这一发现表明RB1的转录后调节机制可以由伴随的miR-106a型我们在结肠癌中检测到过表达(图2B类). 此外，miR-20a型在乳腺癌中下调(图2C类)事实上，TGFBR2蛋白在乳腺癌上皮中表达(22). 此外，最近有研究表明，通过在缺乏TGFBR2蛋白的肺细胞中引入外源性TGFBR2来恢复TGF-β信号，可以降低人类肺癌的致瘤性(23). 有趣的是，miR-20a基因，我们证明它与TGFBR2相互作用在体外，在我们分析的肺癌样本中过度表达。

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以蛋白质编码的癌症基因为靶点的固体癌症miRNA标记成分。(A类)不同癌症蛋白编码基因的3′UTR能够调控癌症miRNA。这些数据显示了萤火虫荧光素酶表达的相对抑制，该抑制标准化为转染对照肾小球荧光素酶。miRNAs是从实体癌的差异调节基因中选择的，如图2和表2PLAG1，多形性腺瘤基因1；TGFBR2、转化生长因子、β受体II、Rb、视网膜母细胞瘤基因。pGL-3（Promega）用作空载体。miR-20a型,miR-26a-1型、和miR-106型寡核苷酸（sense和scrambled）用于转染。第二个实验使用缺乏5′miRNA-end互补位点（MUT）的每个靶mRNA的突变版本作为对照，如赖特所有的实验都进行了两次，一式三份(n个= 6). (B类)在癌症患者中，RB1蛋白水平与miR-106a型表达式。为了正常化，我们使用了β肌动蛋白。

最后，我们测试了一组患者样本，以验证RB1蛋白表达是否与miR-106a型表达式(图3B类). 正如预期的那样，在胃、前列腺和肺肿瘤样本中，RB1下调（相对于配对正常值），并且miR-106a型发现过度表达，而在乳腺肿瘤样本中miR-106a型略微下调(图2C类)RB1的表达水平略高于配对正常对照组。

这些实验证据强化了这样一个假设，即实体癌中关键癌症基因受miRNAs异常表达的调控(24). 这些数据为具有重要癌症基因靶点的miRNA列表添加了示例，如约翰逊之前所示等人。(25)（let-7:：Ras交互），O'Donnell等人。(13)（miR-17-5p:：E2F1）和西米诺等人。(26)（miR-16:：Bcl2）。值得注意的是，最后提到的两个miRNAs是我们在这里确定的所描述的miRNA实体癌特征的成员。总之，我们的数据表明，miRNAs通过控制蛋白编码抑癌基因和癌基因的表达，参与实体瘤的癌症发病机制，并以显性或隐性方式支持其功能。

材料和方法

样品。

本研究使用了540个样本，包括363个原发肿瘤和177个正常组织（表3）。以肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌和胰腺内分泌肿瘤为代表的实体癌。所有样本均在患者知情同意的情况下获得，并经组织学证实。前列腺样本来自国家癌症研究所（NCI）合作前列腺癌组织资源（CPCTR）。正常人的肺和胃样本与非癌症患者的剩余组织样本配对。所有正常乳房样本均通过汇集五个不相关的正常组织获得。根据制造商的说明，用TRIzol（Invitrogen）从组织中分离出总RNA。

MiRNA微阵列。

按照说明进行微阵列分析(14). 简单地说，5μg总RNA用于miRNA微阵列芯片上的杂交。这些芯片包含基因特异性的40-mer寡核苷酸探针，通过接触技术发现并共价连接到聚合物基质。微阵列在6×SSPE（0.9 M NaCl/60 mM NaH）中杂交2人事军官4·H（H）2O/8 mM EDTA，pH 7.4）/30%甲酰胺，25°C下18小时，在0.75×TNT（Tris·HCl/NaCl/Tween 20）中37°C下洗涤40分钟，并使用链霉亲和素-Alexa Fluor 647共轭物直接检测含生物素转录物的方法进行处理。使用微阵列扫描仪扫描处理过的载玻片，激光设置为635nm，固定PMT设置，扫描分辨率为10mm。如参考文献所述，通过Northern印迹法确认数据。16,18、和24.

计算分析。

使用genepix专业将每个miRNA复制点的平均值减去背景值，进行归一化，并进行进一步分析。通过使用每个芯片的中值归一化方法和中值阵列作为参考进行归一化。14最后，我们选择了一个数据集中至少在两类中最小的一类中检测到的miRNAs。在进行统计分析之前，将缺席呼叫阈值设置为4.5。该水平是实验中检测到的平均最低强度水平。miRNA命名依据基因组浏览器(http://genome.ucsc.edu)以及桑格中心的miRNA数据库(27); 如果出现差异，我们会查看miRNA数据库。通过使用吨微阵列显著性分析（SAM）中的测试程序(28). SAM根据相对于所有测量标准偏差的表达变化计算每个基因的得分。通过应用最近的收缩质心来确定miRNA的特征(29). 该方法确定了一组基因，这些基因最能表征每种实体癌与其相应的正常对应物。通过10倍交叉验证计算预测误差，对于每种癌症，我们保留了导致最小预测误差的miRNA特征。通过随机排列分析进行重采样测试，以计算对共享签名的值。统计分析确定的所有miRNAs和癌症特征都列在支持信息中。

肿瘤抑制因子和癌基因靶点预测。

最新的TargetScan预测（2005年4月）用于识别假定的miRNA靶点。它们基本上包括Lewis报告的3′UTR目标等人。(20)2005年4月，UCSC基因组浏览器将RefSeq mRNAs映射到hg17人类基因组集合中，更新了基因边界定义，并带来了一些变化。在假定的靶点中，我们指定了已知的癌症基因（抑癌基因和致癌基因），如www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/Census网站或由OMIM在网址：www.ncbi.nlm.nih.gov.

目标体外化验。

对于荧光素酶报告实验，通过PCR从人类基因组DNA中扩增预测与特定癌症miRNAs相互作用的Rb1、TGFBR2和Plag1的3′UTR片段，并使用荧光素酶终止密码子下游的XbaI位点插入pGL3控制载体（Promega）。人类巨核细胞系MEG-01在RPMI培养基1640中的10%FBS中生长，并在37°C、5%CO的增湿空气中添加1x非必需氨基酸和1 mmol丙酮酸钠2根据制造商的协议，使用siPORT neoFX（Ambion，Austin，TX）在12孔板中与萤火虫荧光素酶报告载体0.4μg和含有雷尼利亚荧光素酶，pRL-TK（Promega）。对于每个井，使用10 nM miRNA寡核苷酸（Dharmacon Research，Lafayette，CO）或打乱寡核苷酸（Ambion）。萤火虫和雷尼利亚转染24小时后，采用双荧光素酶测定法（Promega）连续测定荧光素酶活性。

RB1的Western Blotting。

通过使用小鼠单克隆抗RB1抗体（Santa Cruz Biotechnology），使用标准的Western blotting程序对RB1蛋白水平进行定量。用小鼠单克隆抗肌动蛋白抗体（Sigma）进行归一化。

补充材料

支持信息：

致谢

这项工作得到了国家癌症研究所项目拨款P01CA76259、P01CA81534和P30CA56036的支持，这是Kimmel学者奖（授予G.a.C.），以及意大利公共卫生部、意大利大学研究部、Telethon和意大利癌症研究协会（AIRC）的拨款（授予M.N.、G.L.、a.S.和S.V.），Progetto CAN2005 Sostenitori委员会（2005）和意大利卡里维罗纳基金会（AS）。

词汇表

缩写：

微小RNA微小RNA。

脚注

利益冲突声明：未声明冲突。

数据存储：微阵列数据存储在ArrayExpress数据库中（登录号。电子标签-23对于乳腺癌，电子标签-46对于结肠癌，电子标签-47对于肺癌，电子标签-48胰腺癌，电子标签-49前列腺癌，以及电子标签-50胃癌）。

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文章来自美国国家科学院院刊由以下人员提供美国国家科学院