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美国国家科学院院刊。2006年2月14日；103(7): 2328–2333.
2006年2月1日在线发布。 数字对象标识：10.1073/第408835103页
预防性维修识别码：项目经理1413680
PMID：16452172

Drusen补体成分C3a和C5a促进脉络膜新生血管

野崎美穗,*† 布莱恩·赖斯勒,*† 樱井英治,*† J.维迪亚·萨尔马,‡ 斯科特·巴纳姆,§ 约翰·兰布里斯, 陈亚丽,∥ 张康（音译）,∥ 巴拉默里·K·安巴蒂,** 朱迪特·巴菲,*†和贾亚克里什纳·安巴蒂*††
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

在工业化国家，老年性黄斑变性（AMD）是导致不可逆转失明的主要原因，影响着全世界3000万至5000万人。AMD最早的临床特征是视网膜色素上皮下积聚的细胞外沉淀物，即浮肿。虽然脓毒症几乎总是先于AMD的晚期视力威胁期脉络膜新生血管形成（CNV）并增加其风险，但尚不清楚脓毒症是否有助于CNV的发展。在AMD患者和最近描述的AMD小鼠模型中，补体成分C3和C5的早期视网膜下色素上皮沉积均发生，表明这些炎症蛋白在AMD的发展中起着重要作用。在这里，我们提供了证据，证明这些补体成分（C3a和C5a）的生物活性片段存在于AMD患者的血肿中，并且C3a和C3a诱导VEGF表达在体外和体内此外，我们证明C3a和C5a在激光诱导的CNV过程中早期生成，CNV是一种由VEGF驱动的新生血管性AMD加速模型，白细胞向脉络膜募集。我们还表明，C3a或C5a受体的基因消融降低了激光损伤后VEGF的表达、白细胞募集和CNV的形成，并且抗体介导的C3a或C3a中和或药物阻断其受体也降低了CNV。总之，这些发现为临床观察建立了一个机制基础，即drusen易感染CNV，揭示了免疫现象在血管生成中的作用，并为AMD提供了治疗靶点。

关键词：血管生成、炎症、损伤

在许多工业化国家，老年性黄斑变性（AMD）是老年人永久性视力丧失的主要原因(1). AMD导致的大部分视力丧失是由于病理性新生血管（称为脉络膜新生血管（CNV））通过Bruch膜（脉络膜和视网膜色素上皮（RPE）之间的细胞外基质）的断裂从下伏脉络膜侵入视网膜所致。AMD最早的临床特征是出现水肿(2)，RPE和Bruch膜之间的局部脂蛋白沉积。尽管它们的存在是CNV发展的流行病学风险因素(三,4)德鲁森如何或是否激发CNV的机制尚不明确。一些研究人员认为，血肿是副现象，而另一些研究人员则声称，血肿成分对分泌血管生成分子（如VEGF）的炎症细胞起着局部刺激作用，还有一些研究人员建议，血肿通过损害布鲁赫膜的转运来扰乱RPE体内平衡（参考文献。5).

最近的研究表明补体成分C3和C5是AMD患者血肿的成分(6–9). 它们的存在，以及膜攻击复合物（MAC）C5b-9和其他急性期反应蛋白在覆盖在鼓膜上的RPE细胞中的存在，这引发了人们的猜测，即核糖核酸酶的生物发生涉及慢性炎症过程，这些过程要么会触发补体激活和MAC的形成，从而裂解RPE细胞，要么会扰乱RPE细胞的生理稳态(9).

最近，我们描述了一种老年AMD动物模型Ccl2公司–/–和抄送2–/–小鼠出现了许多人类常见的显著病理特征(10). 有趣的是，在这些幼年小鼠中也发现了C3和C5的RPE和脉络膜沉积。这些在诱导巨噬细胞贩运中受损的小鼠无法清除这些补体沉积物，被认为通过上调VEGF的RPE细胞分泌促进CNV的后期发展(10). 这些发现表明，补体成分在树突状核内的沉积与CNV的发生之间存在着机制联系。

越来越多的证据表明，补体成分不仅仅是先天免疫的介质(11). 迄今为止，它们对血管生成的分子调控的影响体内尚未完全阐明。C3a和C5a是C3和C5的生物活性片段，通过其受体C3aR和C5aR影响生物反应。由于德鲁森易患CNV，且早于CNV，我们试图获得直接证据，证明C3a和C5a存在于德鲁森中，并在CNV的发展中发挥作用。我们研究了它们对VEGF表达和激光诱导CNV形成的影响，这是一种新生血管性AMD的加速模型，再现了人类CNV的大部分病理和免疫表型（参考文献。5)通过使用针对C3a或C5a的中和抗体、C3aR或C5aR的小分子拮抗剂以及C3aR和C5aR缺陷小鼠。

结果

在AMD患者眼中，C3a和C5a免疫定位于软硬鼓膜、RPE细胞附近以及Bruch膜，为AMD患者补体激活提供了直接证据(图1 A–F). 免疫定位的特异性通过省略针对补体片段的原代小鼠单克隆抗体和仅用二级抗体染色来证明(图1G公司). 在无AMD患者的眼后段中未检测到C3a和C5a(图1 H（H）和我). 病理标本中补体过敏毒素的显示表明正在进行和持续的沉积，因为这些可溶性蛋白通常会从补体激活部位扩散出去。虽然C3a免疫反应呈弥漫性，但C5a存在于硬核内的囊泡结构中(图1D类)之前已经证明含有C3碎片(9)和淀粉样β(12).

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C3a和C5a存在于人类酒石中。一位患有AMD的91岁女性的代表性图片(A–G)和一个没有AMD的87岁老人(H（H）和我). C3a的硬膜（星号）和Bruch膜（黑色箭头）免疫反应性（蓝色）示例(一和B类)或C5a(D类和E类)AMD患者的眼睛中，神经视网膜、脉络膜缺乏免疫标记，对照组的眼睛中存在干预性RPE(H（H）和我). C3a公司(C类)和C5a(F类)RPE（棕色色素细胞）和Bruch膜（黑色箭头）之间的软丘沉积物染色。C5a定位于硬膜下的囊泡结构（红色箭头）(D类). AMD眼部缺乏非特异性标记，省略了主要抗补体过敏毒素抗体(G公司). （比例尺，10μm）

在融合和亚融合条件下，C3a和C5a均上调人RPE原代细胞VEGF的分泌(图2一)，但在人类脉络膜内皮细胞中没有（数据未显示）在体外，用C5a扩展了我们之前的观察结果(10). D407人RPE细胞系也获得了类似的结果(13)（数据未显示）。此响应被保留体内，因为在野生型小鼠中玻璃体内注射C3a或C5a在给药后4小时内以剂量依赖的方式诱导RPE/脉络膜中VEGF的表达(图2B类). 玻璃体内注射C3a或C5a后4小时，我们发现脉络膜中的巨噬细胞或中性粒细胞数量没有增加(图2 C类和D类)表明VEGF表达的增加是由于驻留细胞所致。在神经感觉视网膜中没有类似的作用，这表明VEGF上调不是对眼内注射的非特异性反应。

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C3a和C5a上调VEGF在体外和体内与未刺激（对照）或PBS刺激的细胞相比，刺激8小时后C3a（50 ng/ml）和C5a（50 ng/ml）上调人RPE细胞VEGF的分泌(一). 与PBS注射（0 ng）相比，注射后4 h，野生型小鼠玻璃体内注射C3a（方形）或C5a（圆形）可增加RPE/脉络膜（实线）中的VEGF水平，但不增加神经感觉视网膜（虚线）中VEGF的水平，且呈剂量依赖性(B类). ∗,P（P）与PBS相比<0.05。中性粒细胞百分比（%）无差异(C类)或巨噬细胞(D类)玻璃体内注射C3a或C5a后4h，在脉络膜中与PBS进行比较。

在激光损伤模型中，我们在损伤后4小时内通过ELISA检测到RPE/脉络膜中C3a和C5a生成增强，12小时达到峰值，1天内接近基线水平(图3一). 免疫染色显示RPE细胞及其附近有大量C3和C5沉积，并溢出到损伤区域的邻近视网膜下间隙(图3 B类和C类). 未受伤区域对这些补体成分的染色很少（如果有的话）(图3 D类和E类). 激光损伤后1天RPE/脉络膜中的VEGF水平在C3aR公司–/–(67.7 ± 6.8%;P（P）=0.05）和C5aR公司–/–小鼠（76.5±7.1%）；P（P）=0.04）与野生型小鼠相比(图4一). 损伤后3天，即VEGF最大反应的时间点，VEGF水平持续下降(14)，英寸C3aR公司–/–(60.9 ± 4.9%;P（P）=0.01）和C5aR公司–/–小鼠（62.5±3.1%）；P（P）=0.004）与野生型小鼠相比(图4B类). 伤后1天，中性粒细胞最大程度浸润脉络膜(图5一)并在年减少C3aR–/–(57.8 ± 9.0%;P（P）=0.05）和C5aR公司–/–小鼠（66.6±1.7%）；P（P）=0.02）与野生型小鼠相比(图5B类). 伤后3天出现最大巨噬细胞浸润脉络膜(图5C类)并在年减少C3aR公司–/–(49.1 ± 4.6%;P（P）=0.04）和C5aR公司–/–小鼠（42.1±2.1%）；P（P）=0.05）与野生型小鼠相比(图5D类).

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激光损伤诱导野生型小鼠补体。ELISA显示，伤后4小时内RPE/脉络膜中C3a和C5a水平增加，伤后12小时达到最高水平。(一) ∗,P（P）与PBS.C3相比<0.05(B类)和C5(C类)伤后4小时，RPE细胞（绿色）附近沉积（红色）。补体与RPE细胞共定位的区域呈黄色。无C3沉积(D类)或C5(E类)在未开垦地区发现。（比例尺，5μm）DAPI染色呈蓝色。

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VEGF诱导作用在C3aR公司–/–和C5aR公司–/–老鼠。激光损伤后1天和3天，两种敲除菌株RPE/脉络膜中的VEGF水平均显著降低。*，P（P）与野生型小鼠相比<0.05。

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白细胞向脉络膜的募集在C3aR公司–/–和C5aR公司–/–老鼠。脉络膜中中性粒细胞的百分比（%），损伤后1天达到最大值(一)和脉络膜中巨噬细胞的数量，损伤后3天达到最大值(C类)，在两个敲除菌株中均显著降低(B类和D类). ∗,P（P）与野生型（wt）小鼠相比，<0.05。

这些发现也转化为功能抑制。激光诱导CNV的体积在C3aR–/–(41.5 ± 5.2%;n个= 13;P（P）<0.001）和C5aR公司–/–小鼠（40.8±4.3%；n个= 14;P（P）<0.001）与野生型小鼠相比(n个= 17) (图6 A–D). 为了证实基因消融研究，我们在野生型小鼠中使用了针对C3a或C5a的中和抗体及其受体的小分子拮抗剂。两种肽拮抗剂均能显著降低CNV（60-73%；n个=14–16）与对照肽相比(n个= 10;P（P）<0.001）和中和抗体（58-80%；n个=10–13）与同型对照抗体相比(n个= 10;P（P）< 0.01) (图6 E类和F类).

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补体功能的破坏抑制了CNV。野生型激光瘢痕内FITC-隔离B4标记组织的堆积共焦图像（1-μm切片）(一),C3aR–/–(B类)、和C5aR公司–/–(C类)小鼠在基因敲除动物中表现出CNV体积减少(D类). ∗,P（P）与野生型（wt）小鼠相比，<0.05。（比例尺，100μm）与同种对照抗体相比，用中和抗C3a或-C5a抗体（2μg）治疗的野生型小鼠的CNV降低(E类)或与对照肽或PBS相比使用C3a受体拮抗剂或C5a受体拮抗物（1μg）(F类). ∗,P（P）与对照IgG相比<0.05(E类)或对照肽(F类).

讨论

先前的研究令人信服地证明，在鼓膜中存在大量补体成分，这强烈地（尽管是间接地）暗示了AMD中补体的激活(6–9). 然而，这些数据提供了AMD补体过敏毒素的直接证据。鉴于这些蛋白质的扩散性质，对杜鲁森中C3a和C5a的鉴定表明，上覆的RPE细胞将持续暴露于这些生物活性补体片段。正在进行的对更大组眼睛中C3a和C5a生成的研究将为了解AMD补体激活的程度提供更多信息。

在AMD中，RPE细胞单层的完整性在某些区域（而非全部）受到损害，因此RPE细胞将同时存在于融合（静止）和亚融合（增殖）状态。在这两种状态下，C3a和C5a在RPE细胞中诱导VEGF在体外激光损伤后不久RPE/脉络膜内出现大量C3a和C5a，CNV在C3aR–/–和C5aR公司–/–小鼠通过协同抑制白细胞募集和VEGF表达。C3a和C5a以剂量依赖性的方式上调未受损伤眼睛中VEGF的RPE/脉络膜生成，与RPE细胞中的VEGF诱导一致在体外激光损伤诱导的VEGF上调在C3aR–/–和C5aR公司–/–老鼠。尽管C3a和C5a单独增加了VEGF(图2)，VEGF水平在两组中均降低C3aR公司–/–和C5aR公司–/–激光损伤后的小鼠(图4)这表明C3a和C5a之间的合作或它们的受体之间的串扰在诱导VEGF中的可能性。

损伤后4小时内，当中性粒细胞浸润最小时，C3和C5定位于RPE细胞及其附近(图5一)巨噬细胞浸润尚未发生(图5B类). 损伤后1天中性粒细胞反应高峰时(图5一)，C3a和C5a水平接近基线(图3一)提示补体过敏毒素产生的主要来源是常驻细胞。然而，这并没有正式排除浸润细胞对补体蛋白生成的贡献。

在激光损伤模型中，VEGF水平的初始升高发生在白细胞浸润之前(14)这表明RPE细胞等常驻细胞对此负责。损伤后3天VEGF反应的峰值与巨噬细胞的浸润相似，并可因巨噬细胞耗竭而减弱(14)这表明这些被招募的细胞负责VEGF的第二次激增。伤后1天和3天，血管内皮生长因子水平均降低C3aR公司–/–和C5aR公司–/–老鼠。在这些动物受伤后，VEGF没有立即初始升高，这归因于C3a和C5a诱导的VEGF的破坏。这些小鼠中VEGF的二次激增减弱可能是由于补体成分受体介导的信号传导受到干扰和白细胞募集减少所致。

白细胞募集在激光诱导CNV中起关键作用(14,15)，在年显著减少C3aR公司–/–和C5aR公司–/–小鼠损伤后。这可能是由于C3aR和C5aR对白细胞的趋化功能被直接截获或VEGF减少所致，VEGF本身是一种化学引诱剂(16,17). 这也可能是由于诸如Ccl-2和Cxcl-2等趋化因子的间接减少所致，我们和其他人已经证明，这些趋化因子可以由补体成分诱导(10,18–20). 抑制CNVC3aR公司–/–和C5aR公司–/–小鼠和用活化补体成分或其受体的拮抗剂治疗的野生型小鼠也可能是由于白细胞-内皮粘附分子的下调，而C3a和C5a可以促进白细胞-内皮粘附分子的下调(21–23)对CNV的形成至关重要(15).

尽管激光损伤后血管内皮生长因子水平C3aR公司–/–和C5aR公司–/–小鼠明显减少，CNV没有完全消除，这表明在该模型中存在VEGF依赖性和冗余的血管生成途径。虽然RPE细胞组成性地产生Ccl-2(24,25)和血管内皮生长因子(26)，刺激诱导其在人类CNV中过度表达(27–29)未知。生物活性补体片段能触发Ccl-2的证明(10)而血管内皮生长因子（VEGF）的产生使其成为具有吸引力的CNV触发候选物，因为它们存在于AMD患者的血肿沉积物中以及激光损伤后，尤其是因为它们可以在RPE中局部合成(6,7). 因此，在CNV的预防或治疗中检测补体抑制剂是有道理的。这些数据也加强了Ccl2公司–/–和抄送2–/–小鼠作为研究人类AMD进展的模型。

本报告提交后，出现了一篇论文，描述了C3和膜攻击复合物在激光诱导CNV中的重要性(30). 补体因子H的最新定义，在补体激活后抑制C3沉积和C5a释放(31)和类收费受体-4，影响C3沉积并受C5a负调控(32,33)，作为AMD的主要易感性位点(34–39)增加了该病补体功能障碍的越来越多的证据。这些发现和我们的研究丰富了人们越来越多的认识，即补体系统不仅用于免疫监测，还可以在血管生成中发挥多方面的作用。

通过阻断特异性受体介导的途径，我们发现补体和细胞因子网络在促进激光诱导的CNV中存在一种机制性关联。我们的研究结果介绍了生物活性补体片段作为眼睛血管生成的调节剂，并强调了免疫学和血管生物学的交叉。如果这些补体成分通过白细胞募集和血管内皮生长因子的产生在人眼中起类似作用，那么考虑到人类疾病和CNV动物模型中的许多相似和保守的病理生理途径，在新生血管性AMD中drusen和CNV之间的因果联系的假设得到了加强(5,10).

材料和方法

动物。

所有动物实验均符合肯塔基大学动物护理和使用机构委员会以及视觉和眼科研究协会的指导方针。男性C3aR公司–/–和C5aR公司–/–小鼠分别回交6次和9次至C57BL/6J(40,41)使用6至8周龄的野生型C57BL/6J小鼠（Jackson Laboratories）来最小化变异性。对于所有手术，均通过静脉注射50 mg/kg氯胺酮盐酸盐（惠氏福特道奇动物健康公司）和10 mg/kg甲苯噻嗪（加利福尼亚州圣马科斯凤凰科技公司）实现麻醉，并用1%托吡卡胺局部扩张瞳孔（德克萨斯州沃思堡阿尔康实验室）。

患者。

一名91岁女性，眼科诊断为融合性软疣，一名87岁男性，眼底检查正常，无疣征，死亡后3-4小时内获得供眼。解剖眼球以去除眼前节，后节用4%多聚甲醛在PBS中的冰上固定2h。将球体转移到15%蔗糖中30分钟，使其脱水，并在4°C的30%蔗糖中保存过夜。TBS包埋块在干冰上冷冻，并在聚赖氨酸涂层载玻片上切割成12μm的切片。所有人体组织实验均由犹他大学和肯塔基大学机构审查委员会批准，并符合赫尔辛基宣言。

CNV公司。

如前所述，对每只动物的双眼进行激光光凝（532 nm，200 mW，100 ms，75μm）（OcuLight GL，IRIDEX，Mountain View，CA）（体积研究，每只眼睛三次；蛋白质分析/流式细胞术，每只眼12次）以诱导CNV(14,15,42). 据报道，通过扫描激光共聚焦显微镜（TCS SP，Leica）测量CNV体积(14,15,42)，含0.5%FITC–单叶灰树异凝集素B4（Vector Laboratories）或0.5%FITC–鼠抗小鼠CD31抗体（BD Biosciences）。凝集素和CD31染色获得的体积高度相关(第页2= 0.95).

补体抑制。

C3a受体拮抗剂N个2-[（2,2-二苯基乙氧基）乙酰基]-我-精氨酸(43)和C5a受体拮抗剂AcF(44)按描述合成(45,46). 一种控制肽（IAVVQDWGHHRAT），如前所述合成(47)，用作对照。针对小鼠C3a的大鼠IgG2a抗体（克隆3/11；HyCult生物技术，荷兰乌登）和针对由大鼠C5a的C末端区域构建的合成肽的兔多克隆IgG抗体(48)用于阻断C3a和C5a。以兔IgG（Jackson Immunoresearch）和大鼠IgG2a（Serotec）为对照。如前所述，激光损伤后，立即用一根33 gaug的双口径针头（东京伊藤）将这些试剂注入野生型小鼠的玻璃体腔(42).

免疫组织化学。

将小鼠眼睛剜除，用OCT复合物进行snap冷冻，然后冷冻切片。冷冻切片（10μm），固定在Histochoice MB（Amresco，Euclid，OH）中，并用DAKO细胞形成蛋白块（DAKO）封闭，与抗小鼠RPE65的兔抗体（1:100；贝塞斯达国家眼科研究所的T.m.Redmond慷慨捐赠）一起孵育，稀释在DAKO胞形成抗体稀释剂中然后使用Alexa 488-结合羊抗兔IgG抗体（分子探针）。我们通过用钥匙孔帽贝血蓝蛋白偶联的小鼠C3或C5肽（Aves Labs，Tigard，or）免疫母鸡来产生针对小鼠C3或C5的鸡抗体，随后通过使用偶联到琼脂糖珠的C3或C5肽从鸡蛋中亲和纯化这些多克隆抗体。将载玻片在抗小鼠C3（1:250）或C5（1:5000）的鸡抗体中孵育，然后与抗鸡IgG的Cy3-偶联驴抗体孵育（Jackson Immunoresearch）。细胞核用DAPI染色（1:25000；分子探针）。将固定在Histochoice MB中并封闭在Dako细胞形成蛋白块中的人眼切片与小鼠抗人C3a（1:50）或C5a（1:25；HyCult生物技术）单克隆抗体孵育，这些单克隆抗体针对补体激活时产生的新表位，然后与抗小鼠IgG的生物素化山羊抗体孵养（1:1000；向量实验室）。根据制造商的说明，使用碱性磷酸酶Vectastain ABC和Vector Blue碱性磷酸酶底物试剂盒（Vector Laboratories）进行免疫染色。使用左旋咪唑溶液阻断内源性碱性磷酸酶（Vector Laboratories）。通过省略主要抗体来确认染色的特异性。

细胞培养。

从眼底检查正常的患者的供体眼睛中分离出的人RPE细胞在37°C、10%CO、含有10%FBS、青霉素G（100单位/ml）、硫酸链霉素（0.1 mg/ml）（均来自Sigma-Aldrich）的DMEM（Invitrogen）中培养2和90%的室内空气。第2-4代细胞达到80%或100%融合后用于实验，并在无血清培养基中用C3a或C5a（50 ng/ml；Sigma-Aldrich）刺激。在8小时时从培养基中采集上清液组分，并分析蛋白质含量。

ELISA法。

在450/570 nm（Emax，Molecular Devices）下，通过改良Bradford分析法（Bio-Rad）分析细胞培养上清液的总蛋白含量，并通过ELISA试剂盒（R&D Systems）分析VEGF。通过将VEGF ELISA结果除以同一样品的总蛋白测定值，计算每个样品的正常VEGF水平。对于体内测定时，RPE/脉络膜复合物在裂解缓冲液[20 mM咪唑HCl/10 mM KCl/1 mM MgCl中超声处理2/10 mM EGTA/1%Triton X-100/10 mM NaF/1 mM钼酸钠/1 mM EDTA加蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich）]冰敷15分钟。用ELISA测定上清液中的VEGF水平，并将其归一化为总蛋白，如上所示。为了检测RPE/脉络膜裂解物中的C3a和C5a蛋白水平，我们开发了一种夹心ELISA（检测阈值，15.6 ng），方法是用1μg/ml捕获鼠抗小鼠C3a（克隆I87–1162）或C5a（克隆I 52–1486；BD Biosciences）抗体包被高结合96 well板（Costar），其对补体激活后产生的新表位具有特异性，在4°C下过夜。将标准品和未知物在PBS中3%BSA的样品缓冲液中室温培养2小时。通过使用抗小鼠C3a（克隆I87–419）和C5a（克隆I 52–278；BD Biosciences）的生物素化大鼠抗体（1μg/ml）进行检测，然后添加链霉亲和素-辣根过氧化物酶结合物和TMB基板的颜色显影（Pierce）。C3a和C5a水平如上所述归一化为总蛋白。测量以掩蔽方式进行。

流式细胞术。

通过胶原酶D（20单位/ml；Roche Diagnostics）处理从小鼠RPE/脉络膜分离的细胞悬浮液在Fc块（0.5mg/ml；BD Biosciences）中在冰上孵育15分钟；用抗小鼠F4/80的Cy5-rat抗体（1:30；Serotec）、抗小鼠CD11c的FITC–仓鼠抗体（1:100；Serotec）或抗小鼠Gr-1的PE-rat抗体（1:200；eBioscience，加州圣地亚哥）染色；并进行FACS分析（FACScalibur、BD Biosciences）。巨噬细胞和中性粒细胞被定义为F4/80+CD11c公司–和Gr-1+功能4/80–单元格。

统计。

CNV的体积。

由于每个激光损伤发展为CNV的概率受其所属组（小鼠、眼睛和激光斑）的影响，因此使用线性混合模型和分割图重复测量设计比较平均损伤体积，如所述(14,15). 整个图因子是动物所属的遗传群，而分裂图因子是眼睛。在0.05水平上确定统计显著性。平均数的事后比较采用Bonferroni调整进行多重比较。

蛋白质水平和流式细胞术。

VEGF、C3a和C5a水平和白细胞数量表示为至少三个独立实验的平均值±SEM，并使用Mann-Whitney进行比较U型测试。无效假设在被拒绝P（P）< 0.05.

致谢

我们感谢R.J.C.Albuquerque、S.Joshi、R.King、N.Mezei和D.W.Skufca提供的技术援助；P.A.Pearson（肯塔基大学，列克星敦分校）、A.M.Rao和G.S.Rao（佐治亚州奥古斯塔）进行了富有启发性的讨论；以及A.A.Humbles和C.Gerard（波士顿哈佛医学院儿童医院）对敲除小鼠的慷慨礼物。J.A.得到了美国国立卫生研究院拨款EY15422、美国老年医学会颁发的Dennis W.Jahnigen职业发展奖的支持，该奖项由John A.Hartford基金会和大西洋慈善组织、美国卫生援助基金会、E.Matilda Ziegler盲人基金会资助，国际视网膜研究基金会、黄斑狼疮视力研究基金会和预防失明研究部挑战拨款。E.S.得到了“为视觉而战”博士后奖学金的支持。J.Z.B.和B.J.R.得到了国家耳聋和其他沟通障碍研究所/国家卫生研究院培训拨款5T32DC000065的支持。M.N.由视觉和眼科研究协会/日本国家预防失明协会支持。K.Z.由美国国立卫生研究院EY14428、EY14448、P30EY01480和GCRC M01-RR00064资助；基础战失明；露丝和米尔顿·斯坦巴赫基金会；罗纳德·麦克唐纳慈善机构；马库拉视力研究基金会；圣殿骑士眼睛研究基金会；格兰特·里特基金；美国卫生援助基金会；卡尔·柯奇格斯纳基金会；瓦尔和伊迪丝·格林基金会；和西蒙斯基金会。J.D.L.得到了美国国立卫生研究院GM62134和GM69736的资助。B.K.A.得到了退伍军人管理职业发展奖和圣殿骑士眼科研究基金会的支持。

词汇表

缩写：

AMD公司年龄相关性黄斑变性
CNV公司脉络膜新生血管
C3/5号机组补体成分3/5
C3a/5aC3/5的生物活性片段
C3aR/5aRCea/5a受体
零售物价指数视网膜色素上皮。

脚注

利益冲突声明：J.A.被列在肯塔基大学提交的专利申请中，描述了这些发现。

本文直接（第二轨道）提交给PNAS办公室。

工具书类

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