在胚胎第13天（E13）和E14天之间，使用BrdU脉冲标记法，Corti器官的前体可以被识别为耳蜗导管内的非增殖细胞区(，括号）4,9-10随后，前驱结构域内的细胞分化梯度在耳蜗底部附近开始，导致一排内毛细胞和三排外毛细胞的图案（图。,)沿耳蜗全长E18.510，毛细胞顶端表面具有均匀定向的立体纤毛(，绿色）。从E14.5到E18.5，耳蜗的长度增加了大约2倍(). 从横截面上看，同一时期Corti的发育器官从4-5细胞层的原基变薄()只有两层细胞(). 一层毛细胞位于一层支持细胞核之上，细胞核的细胞质指骨突起到达毛细胞的顶点，将它们彼此分开(). 基于这些观察结果，我们先前提出，成熟器官更长更薄是由一定数量的有丝分裂后前体细胞通过完整的细胞插入运动形成的4从E14到E18的BrdU追踪进一步表明，Corti的原始器官和周围细胞之间没有检测到细胞混合(). 此外，E14.5处的毛细胞被红色荧光蛋白（Math1/RFP）标记为多细胞层()在感觉原基内(). 感觉原基的变薄由E18.5完成，没有检测到细胞死亡().
Corti器官与其有丝分裂后前体结构域的分化。a-b：E14.5（a）和E18.5（b）处的漆填充内耳。箭头表示耳蜗的底部。刻度：200μm。c-e：E14.5（c）或E18.5（d）全耳蜗脉冲共聚焦扫描，分别标记6小时或用BrdU追踪4天，并对BrdU（红色）和肌球蛋白VI（绿色）进行双重染色。（c）中的括号表示非增殖原基，在其内侧边缘（c）处可见一排内毛细胞（用箭头表示）。根据E18.5（d），无BrdU+在Corti器官中检测到细胞。P1动物的Corti器官（e）显示方向一致的静纤毛（绿色）。V形静纤毛上有一个单动纤毛（红色）的旋涡指向外侧。刻度：50μm（c-d）；10微米（e）。f-h：Math1/RFP（f）的表达标志着前体结构域（括号）内侧边缘多层柱（箭头）中最早的毛细胞，由E14.5横截面（g）中的Isl1表达划分27根据E18.5（h），Corti器官在支持细胞核层（箭头所示）上方有一层毛细胞（红色）。无激活的caspase3+在E14.5至E18.5的Corti器官内检测到细胞（f和g为绿色，用星号标记）。刻度：50μm。内毛细胞和外毛细胞分别用箭头和括号（d，e，h）表示。洋红色箭头（e）表示分离内外毛细胞的支柱细胞区域。
为了进一步验证我们的假设，我们将E14.5耳蜗上皮细胞分为顶部和底部，并在规定的培养基中培养。以切割伤口部位为参照点，我们分别监测了Corti器官在根尖培养和基础培养中从根尖到基底或从基底到根尖的延伸情况(). 在培养开始时，毛细胞分化仅限于靠近基底的一排内毛细胞()其尚未到达耳蜗的顶端和外毛细胞区域（图。和). 体外4天后（DIV），两个顶端的毛细胞分化进展正常（图。和)和基础培养物（图。,). 然而，在根尖培养中，没有观察到Corti器官延伸到伤口以外（图。和)；而毛细胞阵列在基础培养中延伸到伤口以外（图。-). 切割培养物的细胞标记证实了基底至顶端的延伸（补充图1）。此外，感觉区内的细胞没有从培养基中吸收BrdU，而周围的细胞在基础培养基顶部延伸时吸收了BrdU（图。和注意培养物的方向），表明只有有丝分裂后前体结构域内的细胞有助于Corti的延伸器官。
体外Corti器官的单向延伸。a-b：同一耳蜗管的平分基底部（a）和顶端（b）部分。核定位GFP在Math1增强子的控制下表达4标记活培养物中的毛细胞。等分位置用箭头表示。耳蜗的基底（基础培养）和顶端（顶端培养）部分均用于体外培养（c-e）。请注意，基底细胞培养或根尖细胞培养的预期延伸方向分别为基底至根尖或根尖至基底细胞。c-e：培养同一耳蜗（a-b）的基底（基底培养）和顶端（顶端培养）部分，并以切割伤口位置（箭头所示）作为参考点（c-e）监测延伸情况。毛细胞（GFP+)4DIV（c）后在根尖培养中正常分化。然而，成排的毛细胞没有通过二分位点（c），这表明在顶端培养中没有顶端到基底的延伸。基底培养物（d和e）中的毛细胞行从基底向顶端延伸穿过二分位点（d，e）。在扩展的基础培养物中未检测到Corti器官中的BrdU掺入（e）。成排的毛细胞被一对箭头包围，外植体的方向如（c-e）所示。底部面板（f-j）是上部面板的对应相位图像。
体内和体外数据共同支持有丝分裂后前体结构域内的细胞进行细胞重排以延长的假设。这一过程似乎是通过前体结构域的变薄而发生的，并且沿着耳蜗纵轴从基底向顶点的延伸是单向的，平行于Corti器官的基底至顶端分化梯度。Corti器官在垂直轴上通过狭窄的细胞层延伸，这是被称为“会聚延伸”的细胞运动的特征6，我们提出的一个概念4并得到了最近一项形态学研究的支持11值得注意的是，脊椎动物的会聚延伸受一个保守的遗传途径，即PCP途径调节，通过其在平面细胞极性（PCP）中的作用来描述果蝇属12-15在小鼠中，同源PCP基因突变，Vangl2型1,16,塞尔斯12,17-18或两者兼而有之分离的(Dvl（驱动阀）)1和219-20，导致神经管缺陷被推断为收敛延伸失败21-24此外Vangl2号机组1或塞尔斯12也会导致耳蜗中静纤毛的定位错误，这意味着这种推测的哺乳动物PCP通路也调节细胞极性。因此，我们假设哺乳动物PCP途径在终末分化过程中调节Corti器官中PCP的极化延伸和建立。
我们分析了小鼠PCP同源基因的表达。如所示,塞尔斯1和驱动器1在上皮细胞和支配E16.5处毛细胞的螺旋神经节神经元（SG）中表达（图。和). 此外，BAC（细菌人工染色体）转基因小鼠含有Dvl2-EGFP型融合基因（补充图2）在整个上皮细胞和耳蜗SG神经元中表达DVL2-EGFP(). 这三个PCP同源基因的表达与报道的Vangl2号机组1此外，类似于PCP组分的极化亚细胞分布果蝇属7-8,14-15DVL2-EGFP在Corti器官中显示出极化和不对称的亚细胞定位()包括新分化的毛细胞以及E17.5处经历毛细胞分化的区域(). 共免疫组化进一步显示，DVL2-EGFP在毛细胞顶端表面的外侧富集(). DVL2-EGFP在Corti新分化器官和分化器官中的极化分布表明，在建立静纤毛定向之前和期间，DVL2-EGFP不对称地定位于Corti器官。DVL2-EGFP在毛细胞中的这种极化亚细胞分布在Vangl2号机组功能丧失突变体环尾(Lp/Lp)老鼠16(). 与易于检测的极化膜富集的野生型同窝仔相比()E18.5处（图。,)，Dvl2-EGFP的膜富集在磅/磅突变体。使用20倍于野生型室友的激光功率，Dvl2-EGFP的微弱皮层信号只能偶尔检测到，并且不局限于毛细胞的外侧(). 这些数据表明哺乳动物PCP途径，涉及Vangl2号机组,Dvl（驱动阀）和塞尔斯1在平面细胞极化中，这些基因可能与苍蝇PCP途径具有类似的潜在分子机制。
Corti发育器官中存在功能性PCP通路。a-c：E16.5处Celsr1（a）和Dvl1（b）的原位杂交，E18.5处DVL2-EGFP信号（c）。（a-b）中的括号表示Corti的器官。d-g：耳蜗导管底部80%（d）、75%（e）、50%（f）和25%（g）处Corti E17.5器官的共焦扫描。在底部（g），毛细胞分化，可见静纤毛（红色）。在内侧区（f），静纤毛较不发达，不可见（红色）。然而，内外毛细胞都是分化的（蓝色），而激毛细胞（绿色）是偏心的，表明存在极化区域。在顶端区域（d-e），外毛细胞区域的肌球蛋白VI表达（蓝色）尚未完成，激肽细胞（绿色）居中，表明极化过程之前的过渡阶段。h-m：在E17.5从相应的顶端（h）、内侧（i）和基底（j）区域对Corti整个安装器官的DVL2-EGFP（绿色）进行共聚焦扫描，如d-g所示。在E18.5用毛细胞膜（l，红色）和DVL2-EGFP（k）进行反训练表明，毛细胞侧面（m）的DVL2_EGFP信号o-p：野生型（o）中的DVL2/EGFP和磅/磅（p） E18.5的室友。注意DVL2-EGFP野生型（o）亚细胞定位在磅/磅突变体（p，星号标记毛细胞内侧有DVL2-EGFP）。箭头和括号（c-p）分别标记内部和外部毛细胞。刻度：50μm（a-m）。
接下来，我们研究了Vangl2号机组和Dvl公司基因及其作用Dvl（驱动阀）哺乳动物PCP途径中的基因（图。和). E18.5英寸驱动器119或驱动器220单个空动物，或驱动器1和驱动器2双杂合子，或磅/+动物的静纤毛方向正常(和数据未显示）。相反，驱动器1−/−;驱动器2−/−(DvlDKO公司)20,磅/磅,驱动器2−/−; 磅/+动物表现出静纤毛定向错误(). 如报告所示1，静纤毛的发育磅/磅()与野生型同卵双胞胎相当，而静纤毛的均匀定向被破坏(). 这种破坏在内侧区比基底区更为严重。同样，静睫状束定向错误DvlDKO公司底部是温和的()但在内侧区域受到更严重的破坏(). 从DvlDKO公司还观察到突变体(). 静纤毛的定位错误DvlDKO公司很明显（在两排外毛细胞中约为35%），但程度低于磅/磅在可比较的内侧区有突变体（约95%在两排外毛细胞中）。这些差异DvlDKO公司从磅/磅突变体可能由涉及Dvl（驱动阀）基因25-26和另一只老鼠的可能参与Dvl（驱动阀）基因，驱动器327。静纤毛束定向错误也见于驱动器2−/−;磅/+突变体().
Corti器官的静纤毛在驱动器1−/−;驱动器2−/−(DvlDKO公司),磅/磅、和驱动器2−/−;磅/+胚胎。a-i：Corti器官共聚焦表面扫描，E18.5野生型（a-c）中染色的静纤毛（红色）和动纤毛（绿色），磅/磅（d-f），DvlDKO公司（g-i）和驱动器2−/−; 磅/+（m-o）胚胎。注意，对照组（b-c）在此阶段耳蜗基底部和内侧区域的静纤毛容易染色，而在顶部区域（c）静纤毛较不发达。j-k：来自E18.5对照的可比中间区域的Corti器官的扫描EM驱动器1−/−;驱动器2+/−（j） 以及DvlDKO公司胚胎（k）。l： 圈出（k）的两个细胞的SEM图像放大倍数较高。注意，其中一个细胞中静纤毛的方向发生改变时，动纤毛（箭头）和静纤毛保持相对位置。外毛细胞区域和内毛细胞区域（a-k）分别用括号和箭头表示。比例尺：50μm（a-i）；10μm（j和k）；952纳米（l）。
耳蜗导管及其感觉器官变短和变宽，PCP突变体延伸缺陷。a： PCP突变体的内耳，DvlDKO，磅/磅,驱动器2−/−; 磅/+，并将胚胎控制在E18.5。括号表示内耳的耳蜗部分。其余为前厅。刻度：500μm。b-c：对照组（上部）分离的耳蜗导管（b）和DvlDKO公司（下部）E18.5胚胎。显示了两个样本的可比较区域（c）。这些线勾勒出了可比较区域（b和c）耳蜗导管的直径。刻度：200μm。d-e：来自对照组（d）和DvlDKO公司（e） E18.5室友。显示了用于毛细胞的肌球蛋白VI（绿色）和用于激肽染色的乙酰化α-微管蛋白（红色）。请注意对照样品（d）中毛细胞和激肽细胞的有组织图案，而突变样品（e）中的毛细胞行数增加和激肽纤维移位。刻度：25μm。f-h：肌球蛋白VI（绿色）和Corti器官在最顶端（f）、距顶点四分之一（g）和E18.5中耳蜗基底内侧（h）区域的相位图像的叠加DvlDKO公司突变体。星号表示尚未完成稀释过程的细胞。比例尺：25μm。
对这些突变体的检测进一步揭示了静纤毛方向和Corti器官延伸之间的强烈相关性。PCP突变体的内耳DvlDKO公司,磅/磅、和驱动器2−/−; 磅/+与非PCP对照动物内耳的正常外观相比，动物的耳蜗导管缩短和加宽（补充表一）(，i）。PCP突变体的Corti器官变宽（图。,,,)与正常对照动物耳蜗内一排内毛细胞和三排外毛细胞相比，耳蜗顶端1/3范围内的毛细胞增加了(，可比较的顶端区域）。总的来说，这些数据表明Vangl2号机组和Dvl（驱动阀）基因参与并在遗传上相互作用，以调节耳蜗管的长宽比，这种表型与Corti器官中的PCP表型相关。
PCP突变体中的Corti器官，磅/磅（未显示数据）和DvlDKO公司()，在耳蜗导管的基底部至内侧部正常变薄，形成一层毛细胞和一层支持细胞(). 这些观察表明，有丝分裂后前体结构域内的完整细胞运动可能包括径向（变薄）和内侧（变窄）夹层6（补充图3）。PCP突变体中耳蜗导管的缩短和加宽可能是由于内侧插入缺陷导致伸展失败的表现。
PCP突变体的前后轴缩短1-三PCP突变体的内耳向后移位（数据未显示）。PCP突变体的空间变化可能限制了耳蜗管的正常延伸，从而影响毛细胞模式和静纤毛方向。我们分别使用完整和剖分式耳蜗器官培养直接测试PCP通路功能丧失与耳蜗静纤毛方向和伸展的相关性。野生型完整E14.5耳蜗导管在6 DIV后长度增加了30%（图。和)与体内2倍的生长相比。结果，朝向顶端区域有更多排的外毛细胞和内毛细胞()与其他研究中观察到的情况类似28然而，耳蜗管的整个长度上都保持着静纤毛极性()显示了野生型组织中静纤毛定向的惊人内在保真度。科尔蒂的器官来自磅/磅在相同条件下培养的胚胎长度无法增长（<2%）（图。,)，显示静纤毛方向错误(). 文化中的顶点明显加宽(). PCP突变体的延伸延迟在二等分培养中得到进一步直接证明(). 如预期()，在野生型中，伸展以从基底到顶端的方向进行(，长度增加=1.74±0.23倍，n=12）和磅/+二等分培养物（长度增加=1.61±0.19，n=4）。Corti延伸器官中的静纤毛保持了正确的方向(). 相反，耳蜗及其感觉器官磅/磅室友的成长速度不太快(长度增加=1.22±0.08倍，n=7），静纤毛的方向被破坏(). 这些数据表明，静纤毛的方向性错误与环形线圈耳蜗组织内的突变磅/磅PCP突变体在耳蜗和Corti器官的延伸方面存在缺陷。
PCP通路在Corti器官的延伸和平面细胞极性中的直接需求。a-b：来自控制和磅/磅E14.5处的室友。支架标记着内耳的耳蜗部分。c-f：来自对照组的完整耳蜗导管（c和e）和磅/磅（d和f）培养的6个DIV。概述了可比较心尖区的耳蜗导管直径（e和f）。毛细胞通过Math1-EGFP可视化。g-k：共焦图像-对照用静纤毛（指骨样蛋白）（g-i）和磅/磅在顶端（g和j）、内侧（h和k）和基底（i）区域进行（j-k）培养。刻度：25μm。l-q：从野生型（l-m）和磅/磅（n-o）培养6 DIV，野生型（p）和磅/磅（q） ●●●●。l-o中的箭头表示平分位置。（g-k，p-q）中的箭头和括号分别标记内毛细胞区域和外毛细胞区域，洋红色箭头标记用p75染色的柱细胞区域（h，k，p，洋红色）。
我们的数据表明，Corti器官在终末分化过程中通过细胞层的变薄经历了会聚伸展的极化伸展特征。PCP突变体的分析进一步表明，除了通过与其同源的类似机制调节Corti器官的平面细胞极性外果蝇属PCP组分不对称分布途径7-8,14-16哺乳动物的PCP通路也需要用于耳蜗导管及其感觉器官的极化延伸。对Corti器官正常发育和PCP突变体缺陷的形态发生学观察表明，放射状和内侧插入（尚未直接测试）都可能参与Corti器官的延伸，并且PCP突异体的内侧插入受到显著影响。我们观察到的Dvl2的内侧-外侧不对称亚细胞定位可能：（1）表明从无脊椎动物到哺乳动物的PCP通路在调节平面细胞极性方面的一种保守的细胞机制，以及（2）脊椎动物PCP通路调节收敛延伸的细胞机制的基础29在科尔蒂的器官里。
方法
小鼠菌株和动物护理
在Math1增强子的控制下，在毛细胞中表达GFP的小鼠菌株Math1/GFP如下所述4.环形线圈这些动物最初是从杰克逊实验室获得的。驱动器1和Dvl2双淘汰赛(DvlDKO公司)如前所述产生等位基因19-20Dvl2-EGFP动物如补充图1所述产生。携带Math1-RFP的小鼠菌株通过BAC介导的转基因产生。Math1/GFP或Math1-RFP阳性的胚胎分别通过小脑和脊髓中的GFP或RFP阳性信号进行鉴定。Dvl1、Dvl2基因敲除等位基因的基因分型环尾等位基因按照描述进行16,19-20。要区分Dvl2-EGFP型内源性野生型BAC转基因驱动器2，一对位于内含子2两侧的引物用于PCR（补充表II）。内源性野生型驱动器2等位基因产生370 bp的PCR产物，而Dvl2-EGFP型由于在内含子2中插入34 bp LoxP位点，转基因产生了404 bp的PCR产物（补充图2）。目标驱动器2该PCR反应不会扩增出空等位基因。对于BrdU注射，E14.5时间段的孕妇每隔2小时注射三次50μg/g体重的BrdU，并在最后一次注射后2小时处死，进行脉冲标记，每天三次，每次间隔2小时，直到E18.5进行追踪。动物的护理和使用符合NIH指南，并得到埃默里大学和加利福尼亚大学圣地亚哥分校动物护理和使用委员会的批准。
内耳组织的原位杂交和免疫染色
如前所述进行内耳解剖、切片、免疫染色和原位杂交30为了分析Corti器官的平面细胞极性，用乙酰化α-微管蛋白抗体对Corti的整个安装器官进行染色，然后用Cy5-结合驴对小鼠抗体进行孵育，用罗丹明结合的指骨样蛋白进行反染色，并用蔡司LSM510进行可视化。为了可视化Dvl2-EGFP小鼠耳内的天然GFP信号，从轻度固定的胚胎中解剖Corti器官，用指骨样蛋白逆行染色，并用Zeiss LSM510获得小于1μm光学切片的图像。使用的主要抗体和染料为：肌球蛋白VI（兔多克隆，1:200，来自UCSD的Tama Hasson）；BrdU（小鼠单克隆抗体，1:100，来自Chemicon International Inc.）；Islet1（小鼠单克隆，1:100，来自发育杂交瘤库）；ActCaspase3（兔子多克隆，1:100，来自研发系统）；乙酰化α-微管蛋白（单克隆，1:50，埃默里大学Winfield Sale赠送）；p75（兔多克隆，1:100来自Chemicon International）；罗丹明结合的卵磷脂（25 pM，来自分子探针）。从分子探针中获得二级抗体。通过RT-PCR从E15.5内耳上皮细胞中克隆了Dvl1和Celsr1的cDNA，寡核苷酸列于补充表II中。根据所述方法，使用激毛细胞的共焦图像和静纤毛双重染色对静纤毛定向错误进行量化1.与正常值相比偏差大于20°的立体纤毛被视为定向错误。
毛细胞计数和耳蜗长宽比（L/W）测量
对于L/W比，将整个解剖耳蜗导管的图像导入NIH Image J，并通过每个样本的三次独立测量进行计算。对于毛细胞计数，收集肌球蛋白VI染色的整个耳蜗导管的共焦图像，并对每个样本的毛细胞进行至少两次计数。
内耳涂料填充
将适当阶段的胚胎在4°C的Bodian固定液中固定过夜，通过一系列酒精脱水，在水杨酸甲酯中进行组织清除。然后对内耳进行部分解剖，以便在耳蜗导管底部插入装有1%水杨酸甲酯白色乳胶漆的微量吸管进行注射。用装有滨松数码相机的奥林巴斯SZX12立体镜对充满油漆的内耳进行成像。
器官培养
在E14.5时处死定时妊娠的雌性。在DPBS中解剖内耳（GIBCO，猫#14040-133），用dispase培养（GIBCO，猫#17105-041，1 mg/ml）和胶原酶（沃辛顿，猫#S3J6581，0.5 mg/ml）在DPBS中在室温下放置2分钟，以清除耳蜗导管周围的组织。允许切除的耳蜗导管在聚D-赖氨酸（Sigma，Cat#P-6407，0.5 mg/ml）和纤维连接蛋白（Sigma，Cat#F1141，0.005%）镀膜玻璃底皿，并在DMEM/F12（Cellgro，Cat）中培养#15-090-cv）补充N2（Gibco，Cat#17502-048）用于4-6 DIV。对于培养物中的BrdU掺入，在整个培养期间，培养基中包含1μM BrdU。每隔一天补充培养基，用奥林巴斯I71倒置显微镜或蔡司LSM510拍摄活培养物图像。对于二分法耳蜗培养，当耳蜗管的底部粘附在培养皿上时，在培养期间未粘附在培养盘上的管状耳蜗导管的顶部保持在其原始位置（补充图1）。因此，耳蜗顶部的二分位点可作为Corti器官在培养物中延伸的参考标记，并通过DiI标记进行验证（补充图1）。用于器官培养环形线圈野生型突变体，Lp/+，或磅/磅最初分别通过正常外观、环尾或开放神经管来识别同窝婴儿。随后进行PCR反应以确认同窝婴儿的基因型。将培养图像导入NIH图像J，通过比较4-6次DIV后耳蜗管的原始长度和最终长度来量化延伸。
Corti器官的扫描电子显微镜
将内耳固定在2%多聚甲醛/2%戊二醛（EM级）中，在4°C下过夜，转移到0.1M NaCacadylate，pH7.4。去除醛类后，用1%单宁酸处理样品，然后用四氧化锇处理。通过系列乙醇使样品脱水，并临界干燥样品。将干燥后的样品安装在金属桩上，并涂上金颗粒，准备进行检查。使用DS-130/Schottky场发射SEM/STEM拍摄图像。
数据库访问号码
Vangl2/Ltap公司：36148毫米；塞尔斯1：22680毫米；驱动器1：3400毫米；驱动器2：5114毫米
