Wnt（重量）/Wg（重量）信号事件控制许多生物体的体轴形成、细胞增殖和器官发生(Cadigan 2002年；Bienz和Clevers 2003；格雷戈里夫和克利夫斯2005)对肠上皮细胞和造血干细胞的自我更新很重要(Radtke和Clevers 2005；Reya和Clevers 2005). 在典型的Wnt/Wg信号通路中，β-catenin（β-cat）作为LEF-1/TCF HMG蛋白的专用转录辅激活子发挥作用(Cadigan 2002年；Bienz和Clevers 2003). 在Wnt信号缺失的情况下，新合成的β-cat靶向包含Axin、蛋白磷酸酶2A和腺瘤性息肉病大肠杆菌（APC）肿瘤抑制因子的细胞质“破坏复合物”(Xing等人，2003年,2004；Ha等人，2004年)其中，它通过酪蛋白激酶Iα（CKIα）和糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）进行顺序磷酸化。这些蛋白激酶对APC的后续磷酸化诱导与β-cat的高亲和力结合和Axin复合物的分解(Xing等人，2004年). 磷酸化的β-cat随后被βTrCP泛素化，并被蛋白酶体介导的蛋白水解破坏。Wnt配体通过Frizzled和LDL细胞表面受体以及Disheveled蛋白启动信号级联，最终使GSK-3β失活并打破破坏循环。然后，未磷酸化的β-cat进入细胞核，结合LEF-1/TCF蛋白，激活Wnt靶基因(Bienz和Clevers 2003；格雷戈里夫和克利夫斯2005)。
Wnt信号通路的失调是许多侵袭性人类癌症的标志，包括结肠癌和黑色素瘤(Moon等人，2004年；Reya和Clevers 2005). 绝大多数大肠腺瘤和癌含有APC抑癌基因的零星或遗传性截断(Kinzler和Vogelstein，1996年)或β-cat中的致癌稳定突变，导致c-Myc和其他Wnt靶基因的慢性诱导。APC最常见的致癌突变是切除蛋白的C末端一半的截断，包括Axin和核输出信号的结合位点，这使得突变的APC蛋白无法将β-cat靶向破坏复合物，也无法发挥抑癌作用（有关综述，请参阅Bienz 2002年；Henderson和Fagotto 2002). 由于I类突变APC蛋白积聚在细胞核中，它们还可能通过其他方式破坏Wnt信号传导。例如，核APC被建议结合并隔离细胞核中多余的β-cat，防止其与DNA-结合的LEF-1/TCF蛋白结合，并抑制信号细胞中的转录(Neufeld等人，2000a,b条；Rosin-Arbesfeld等人，2000年,2003). 最近还发现野生型和突变型APC蛋白与核转录辅抑制因子CtBP结合，可能在体内使β-cat偏离Wnt靶基因(滨田和比恩茨2004)。
新兴的生物化学和遗传学研究阐述了Wnt转录调控机制的重要方面。β-cat的中央犰狳（ARM）重复序列与Bcl-9/无腿辅激活子相互作用，该辅激活子用于连接β-cat与Pygopus（Pygo）PhD手指蛋白（有关综述，请参阅Bienz和Clevers 2003；格雷戈里夫和克利夫斯2005). Bcl-9/Lgs和Pygo也被证明是β-cat在细胞核内积聚所必需的(Townsley等人，2004年). 虽然尚不清楚Bcl-9/Lgs和Pygo是否能与DNA-结合的β-cat:LEF-1复合物相互作用，但遗传学研究强烈暗示这些辅激活物在转录中的作用(霍夫曼和巴斯勒2004；Hoffmans等人，2005年). 其他研究表明，β-cat通过APC从细胞核转运，APC包含对其功能至关重要的中央核输出序列（Rosin-Arbesfeld等人，2003年）。APC和LEF-1竞争β-cat犰狳（ARM）重复序列中的重叠结合位点，这表明β-cat必须在转录前后在包含APC、Bcl-9/Lgs:Pygo和LEF-1.的不同复合物之间切换。这些步骤在生化上没有很好的定义，已经提出了各种模型来解释核内APC和LEF-1之间的β-cat交换（有关综述，请参阅托文斯基和维肖2004)。
除了APC和LEF-1外，β-cat ARM重复序列还与DNA解旋酶TIP49a/Pontin52和TIP49b/TIP48/Reptin52相互作用(Bauer等人，1998年,2000)，是TRRAP/TIP60组蛋白乙酰转移酶（HAT）和哺乳动物INO80和SWRCAP/SWR1染色质重塑复合物中的亚单位(Cai等人，2003年,2005；Jin等人，2005年). TIP60和TIP49在体内直接调节Wnt靶基因(Bauer等人，2000年；Feng等人，2003年；Kim等人2005年b). Wnt信号传导所需的其他β-cat相互作用蛋白包括含有Brg1的染色质重塑复合物(Barker等人，2001年)和CBP/p300(Hecht等人，2000年；宫城等人，2000年). β-cat ARM重复序列的C区末端包含一个非常强的激活域；然而，绑定此域的因素是未知的。在体内，LEF-1/TCF蛋白与Wnt靶基因组成性结合，并在Wnt信号缺失的情况下，与Gro/TLE-1、CtBP、HDAC1和其他辅抑制剂一起抑制转录（有关综述，请参阅Courey和Jia 2001；钦纳杜赖2002)。
在这里，我们报告了β-cat C末端激活域和相邻的ARM 11/12重复序列（CTARM）选择性地与TRRAP/TIP60组蛋白乙酰转移酶（HAT）、ISW1和混合型白血病（MLL1/MLL2）SET1型组蛋白甲基转移酶（HMT）复合物的核染色质重塑亚基相关，β-cat在体内促进c-Myc基因的H3K4三甲基化（H3K4Me3）。SET1蛋白以一种依赖于哺乳动物BRE1:Rad6泛素连接酶复合体对H2B的泛素化的方式介导H3K4Me3(Kim等人，2005a；Zhu等人，2005年). 哺乳动物SET1相关的HMT蛋白（包括hSET1、ALL-1/MLL1、MLL2、ALR-1和HALR）与其他保守的SET1亚单位（包括Ash2、menin、HCF、WRD5和RbBP5）位于复合物中，是转录激活物的常见直接靶点(Nakamura等人，2002年；Yokoyama等人，2004年；Dou等人，2005年；Guenther等人，2005年；Milne等人，2005年；Schneider等人，2005年；Wysocka等人，2005年b). 我们在这里显示，β-cat诱导c-Myc转录后，H3K4Me3水平升高，而在表达APC肿瘤抑制因子的细胞中，当转录被关闭时，H3K 4Me3浓度下降。有趣的是，c-Myc转录的抑制伴随着APC、βTrCP和CtBP的短暂募集。此外，核CtBP与全长APC共免疫沉淀，但不与I类或II类突变APC蛋白共免疫沉淀。我们得出结论，β-cat调节H3K4甲基化，并被体内Wnt靶基因的APC直接抵消。
结果
β-cat激活域与核TRRAP/TIP60、ISW1和MLL1/MLL2 SET1型复合物相关
我们之前表明，通过ARM重复序列11和12跨越C末端的β-cat片段（GST-CTARM）可以选择性抑制或“抑制”体外染色质上的β-cat:LEF-1转录(Tutter等人，2001年). 这种抑制是特异性的，因为β-cat CTARM片段没有阻断Notch增强子复合物在体外的转录活性，也没有破坏β-catenin和LEF-1与染色质的协同结合。含有C末端结构域（GST-CT）或ARM重复序列11和12（GST-ARM11/12）的β-cat短片段在体外对β-cat活性没有影响。为了表征结合β-cat这一区域的蛋白质，将GST-CTARM蛋白偶联到谷胱甘肽-S-脑葡萄糖珠，并在GST-下拉实验中与SW480结直肠癌（CRC）细胞的核提取物孵育。通过SDS-PAGE和银染色观察严格洗涤后仍与GST-CTARM珠结合的核蛋白（图。). 发现多个核蛋白结合GST-CTARM（图。，车道4，星号），但不包括GST（图。，车道2）或GST-CT（图。，泳道3）珠。这些因素在纯化的GST-CTARM制剂中不存在（图。，车道7），表明它们来自SW480核提取物（图。，车道7）。
使用SW480CRC核提取物进行的GST下拉实验中与β-cat CTARM结构域结合的蛋白质的鉴定。(A类)GST-CTARM结合蛋白的SDS-PAGE分析4)、GST-CT（车道三)和GST（车道2)与SW480核提取物或GST-CTARM（lane）孵育后7)、GST-CT（车道6)或GST（车道5)不含提取物的蛋白质；蛋白质用银染法显示。MALDI-TOF识别的CTARM相互作用蛋白的GI蛋白登录号列于正确的. (B类,左边)结合GST-CTARM（lane）的HeLa核蛋白的免疫印迹分析2)或GST-CT（控制；车道三)珠子。为了进行比较，每条输入提取的2%显示在车道中1. (中部)结合GST-CTARM的SW480核蛋白的免疫印迹比较（lane5)、GST（控制、车道6)，或GST-VP16激活域（通道7). 输入的SW480核提取物显示在通道中4. (赖特)SW40核提取物中MLL1、MLL2和Ash2L的分析（输入、通道8)或绑定到GST-β-cat-FL（车道9)、GST-CTARM（车道10)或GST（车道11)珠子。(C类)HMT分析（车道1–3)或HAT（车道4–6)GST-CTARM中存在的活动（车道1,4)，GST（车道三,6)或GST-VP16（车道2,5)下拉分数。输入的核心组蛋白显示在lane中7. (底部)考马斯染色显示每个反应中的核心组蛋白。(D类)外源性β-cat的分析：用针对β-cat或MLL2的siRNA转染的HeLa细胞中内源性c-Myc基因的LEF-1激活。这个插入显示对照细胞（lane）中MLL2和β-cat蛋白水平的免疫印迹1)或表达针对每个蛋白质的siRNA的细胞（lane2)。
为了鉴定β-cat相互作用蛋白，在图的第4栏用星号标记的蛋白从凝胶中切下切片，通过胰蛋白酶蛋白水解洗脱，并通过MALDI-TOF质谱分析。这些实验中确定的主要CTARM相互作用蛋白是来自三种不同染色质重塑复合物的亚基。这些包括转录/转化域相关蛋白TRRAP、SNF2相关解旋酶p400、细菌RuvB相关单链DNA依赖性AAA+ATP酶TIP49a/Pontin52和TIP49b/TIP48/Reptin，所有这些都是TRRAP/TIP60 HAT复合物的亚基(Cai等人，2005年). 有趣的是，TIP49a先前被证明与β-cat ARM重复序列2-5直接相互作用(Bauer等人，1998年；Bauer等人，2000年)TIP49a和TIP60都被证明是体内β-cat的重要辅活化剂(Feng等人，2003年；Kim等人2005年b)。
CTARM下拉部分还包括来自其他两种染色质复合物的亚单位，特别是在几种不同的重塑复合物中发现的模拟开关核小体重塑ATP酶ISW1和SET1型复合蛋白ALL-1/MLL1。免疫印迹证实在HeLa的CTARM下拉组分中鉴定了TRRAP、MLL1和ISW1（图。，车道1-3）和SW480（图。4–7道）核提取物，并进一步揭示了MLL2 HMT的存在（图。以及常见的SET1亚单位、menin（MEN-1肿瘤抑制因子）、Rb相互作用蛋白、RbBP5和Ash2。其他下拉实验表明，GST-β-cat-FL（全长β-catenin）也与核MLL1和MLL2蛋白相关（图。，8–11车道）。正如预期的那样，没有GST-CTARM相互作用因子与GST-CT或GST-beads结合。此外，GST-CTARM蛋白没有与H2B泛素化所需的其他核蛋白相互作用，例如Paf1或Rad6，也没有与19S蛋白酶体亚基Rpt6/SUG1或BAF57或Brm染色质重塑亚基结合（图。; 数据未显示）。尽管有报道称β-cat CTARM结构域与p300/CBP组蛋白乙酰转移酶相互作用(Hecht等人，2000年；宫城等人，2000年)，这种关联一定相对较弱，因为在我们的实验中没有检测到（图。，车道4-7）。
为了评估这些相互作用的相对强度，还对使用GST-VP16激活域获得的平行组分进行了免疫印迹，已知该激活域可结合MLL1和SAGA/GCN5复合物。如图所示β-cat CTARM蛋白与MLL1/MLL2/SET1复合亚基的结合强度大于VP16激活域，而SAGA GCN5亚基与VP16活化域的结合强度更高（参见第5和第7栏）。TRRAP蛋白与两个激活结构域紧密结合，而ISW1亚基优先结合CTARM蛋白。由于TRRAP、TIP49和ISW1蛋白均存在于多个重塑复合物中，因此需要进行更详细的研究，以进一步表征这些CTARM相互作用复合物，尤其是确定哪些亚基与β-cat激活域直接相互作用。
为了评估CTARM蛋白是否与功能性HMT复合物相关，我们分析了GST-CTARM和GST-VP16下拉组分体外甲基化和乙酰化纯化核心组蛋白的能力。如图所示CTARM下拉组分含有高水平的组蛋白H3特异性甲基转移酶活性（第1道），但HAT活性相对较弱（第4道），而GST-VP16组分表现出弱HMT活性（第2道），但是HAT活性较强（第5道），这与该组分中GCN5的富集相一致。为了评估体内β-cat活性是否需要SET1型复合物，通过靶向小干扰RNA（siRNA）降低HeLa细胞中MLL2的水平，并在转染β-cat和LEF-1表达载体的情况下检测对c-Myc mRNA的影响。如图所示，在MLL2特异性siRNA存在的情况下，内源性c-Myc mRNA水平适度下降，在针对β-cat的siRNA存在的情况下更为显著。总之，这些数据表明，β-cat激活域与活性组蛋白H3甲基化复合物相关，MLL2可能有助于β-cat介导的体内c-Myc转录诱导。
β-cat需要泛素反式-染色质pBRE模板的体外激活
这些发现提出了H3K4甲基化或H2B泛素化步骤对体外β-cat活性是否重要的问题。基于染色质的体外转录检测通过引物延伸测量RNA启动，因此不需要RNA聚合酶II（RNAPII）Ser-2磷酸化或延伸因子。虽然H3K4Me3与转录延伸密切相关，但MLL1/Set1存在于哺乳动物细胞中最活跃的RNAPII启动子中(Guenther等人，2005年)，因此通常需要RNA启动或启动子清除。事实上，最近的研究表明MLL1复合物在体外强烈刺激染色质模板上的转录起始(Dou等人，2005年)。
这些观察结果使我们不禁要问，是否内源性泛素存在于果蝇属胚胎染色质组装提取物可能是体外β-cat:LEF-1转录所必需的。为了解决这个问题，染色质转录反应与含有Vsp9p-CUE结构域的蛋白质孵育，该结构域与单泛素紧密结合(利马2003). 有趣的是，GST-CUE蛋白在体外强烈抑制pBRE染色质模板的β-cat:LEF-1激活（图。，车道3）。无法结合泛素的突变GST-CUE蛋白未能阻止转录（F420A[图。，车道4]或P421A[图。，车道5]），GST单独没有影响（图。，车道6）。GST-CUE蛋白没有阻断β-cat和LEF-1与染色质的协同结合（图。参考9–12和8道），也不干扰核小体组装（数据未显示）。重要的是，添加外源性泛素可以完全克服GST-CUE抑制，无论是作为His-tagged泛素、GST-tagged泛素还是链终止形式的泛素（图。，参见泳道3和8；数据未显示）。染色质足迹实验显示，其中一个β-cat：LEF-1结合位点的DNase I超敏反应发生轻微但可重复的变化（图。)，这可能是因为修改了pBRE模板。β-cat本身不太可能泛素化，因为这些实验中使用的ΔNβ-cat蛋白缺乏磷酸化和泛素化的N末端残基。
体外染色质模板的β-cat:LEF-1转录需要泛素。(A类)CUE结构域在体外竞争染色质上的转录。染色质组装LEF-1报告基因（pBRE）RNA的引物延伸分析2–6)或不在（车道1)120 nM重组ΔNβ-cat蛋白。重组LEF-1（ΔAD；120nM）存在于所有反应中，并加入α-珠蛋白（α-glo）基因作为非染色质（DNA）转录的对照。如有说明，每个反应都含有15μg（2.5μM）的GST-CUE（车道三)，GST-CUE-F420A（车道4)，GST-CUE-P421A（车道5)或仅GST（车道6). 车道7–12显示反应中β-cat:LEF-1结合的DNase I足迹分析1–6,分别是。(B类)泛素在体外拯救GST-CUE对β-cat调节转录的抑制作用。(顶部)在含有（lanes）的反应中pBRE和α-glo（对照）RNA的引物延伸分析2–10)或缺少（车道1)重组β-cat和LEF-1。如有指示，反应含量低（2.5μM，车道3,7,8)或高（10μM，车道4)GST-CUE水平或低（2.5μM，车道5,9,10)或高（10μM，车道6)GST控制，在缺乏外源泛素（通道）的情况下1–6)或存在1μM（车道7,9)或10μM（车道8,10)His标记泛素。(C类)GST-CUE结构域在体外阻断染色质模板的Notch增强子激活。如有指示，包含反作用力（车道2–10)或缺少（车道1)重组Notch胞内结构域（NICD）和CBF1 DNA结合蛋白。反应3–10还包含Notch协同激活器主脑（MAM）。GST-CUE水平为170 nM（泳道4)，830 nM（车道5)，1.7μM（车道6)和3.3μM（车道7)，GST控制增加到5.3μM（车道8). 车道中存在二甲基亚砜中的泛素醛（1.8 nM）和MG132（4 nM）9,仅DMSO作为车道内的控制装置进行了测试10通过引物延伸分析由CBF1依赖性启动子合成的RNA；添加α-glo作为非染色质转录的对照。(D类)CUE结构域不阻断HIV-1 Tat在体外调节HIV-1启动子DNA的转录起始或延伸。在GST-Tat（lanes）存在的情况下，通过径流延伸试验分析HIV-1 RNA2,4–6)、GST-CUE（车道3–6)或仅GST（车道1,3)。
有趣的是，GST-CUE蛋白还通过重组Notch增强子复合物（包含CBF1、Notch胞内结构域和Mastermind）阻断pNRE染色质模板的转录（图。，通道4-7），表明泛素的需求可能是普遍的。泛素醛也阻断了Notch和β-cat调节的转录（图。，9号车道；数据未显示），它抑制去平衡酶。相反，Vsp9p CUE结构域并没有阻断非染色质（DNA）模板上α-珠蛋白（α-glo）启动子的转录（图。)也不干扰体外裸DNA上基础或Tat激活的HIV-1转录延伸（图。). 这些数据表明，泛素化，如乙酰化，可能通常需要增强剂和染色质依赖的体外转录启动，并且该系统的进一步研究应该有助于确定所涉及的酶和机制。
β-cat和其他Wnt路径特异性调节因子在体内循环LiCl处理细胞中的c-Myc增强子
接下来，我们使用染色质免疫沉淀（ChIP）实验来评估体内β-cat是否调节Wnt靶基因的H3K4三甲基化。在先前显示的诱导β-catenin的条件下，用GSK-3β抑制剂锂处理C2C12（小鼠成肌细胞）细胞并诱导β-cat(Baek等人，2003年). 如图所示添加LiCl后，c-Myc RNA水平迅速增加（1-6通道），同时核β-cat蛋白增加（7-12通道）。尽管C2C12细胞与锂持续孵育，但β-cat和相关辅活化因子在30–45分钟内短暂出现（图。; 车道9、10），或30–60分钟（图。; 通道3–5），然后被TLE1增压器取代。相反，LEF-1与c-Myc增强子构成结合（图。，7–12车道）。这里使用的ChIP条件是特异性的，因为在c-Myc基因的远端上游区域没有检测到LEF-1（图。在免疫沉淀物和对照IgG血清中，c-Myc增强子DNA也没有恢复（图。，7–12车道）。
锂处理C2C12细胞中β-cat诱导小鼠c-Myc转录的ChIP分析。(A、 左侧，车道1–6)用10mM LiCl处理指定时间的C2C12细胞中c-Myc RNA的RT–PCR分析在上面每条车道；作为对照，监测β-actin mRNA水平。(正确的，车道7–12)用免疫印迹法监测经锂处理的C2C12细胞中β-cat、Pygo和LEF-1的水平。(B类)通过10 mM LiCl暴露细胞诱导β-cat后不同时间c-Myc增强子的ChIP分析。用于监测小鼠c-Myc基因增强子上游LEF-1位点的引物如与P1 RNA起始位点（+1）相关的示意图所示。（车道1–6)监测远端（10 Kb）上游区域作为对照。车道7–12显示与Wnt应答c-Myc增强子结合的转录因子（参考）。(C类)暴露于10 mM LiCl指定时间后c-Myc增强子处MLL2和SET1型复合亚基的ChIP分析在上面每条车道。(D类)对部分ChIP样本进行定量PCR分析，如B类和C、。在每个图中，c-Myc增强子的β-cat定位动力学（以绿色显示）与底部每个面板的。
β-连环蛋白与Pygopus和Bcl-9/Lgs一起被招募到c-Myc增强子中（图。β-cat的转录和核转运似乎都需要Wnt路径特异性协调剂。β-cat也存在MLL2和SET1型亚单位Ash2和menin（图。c-Myc基因处的H3K4Me3显著增加。由于在细胞核中也检测到了作为氯化锂直接靶点的GSK-3β激酶，我们询问它是否也存在于c-Myc增强子中。如图所示，GSK-3β存在于增强子处，其动力学类似于TLE-1共抑制剂（图。第7、11、12车道），与β-cat车道相反。用锂处理细胞后，GSK-3β激酶迅速消失，这增加了它作为无活性Wnt靶基因的辅压复合物的一部分发挥作用的可能性。更详细的动力学ChIP分析表明，在持续暴露于LiCl的细胞中，这种交替辅激活物和辅抑制物复合物的循环模式重复了多个周期（S.Wang和K.A.Jones，未解释）。虽然增强子因子在增强子上循环，但RNAPII和CDK9转录延伸因子的水平在基因上稳定积累（图。)，与稳态c-Myc mRNA水平的升高平行。
鉴于c-Myc增强子处存在GSK3β，我们决定检测是否存在其他负Wnt调节因子，尤其是APC肿瘤抑制因子和β-cat泛素连接酶βTrCP。有趣的是，这两个因子都在c-Myc增强子处检测到；然而，它们没有与TLE1共定位，而是与β-cat一起出现（图。，3–5车道）。尽管参与其他短命激活剂降解的蛋白质已定位于靶基因的增强子元件(Muratani和Tansey 2003)在c-Myc基因上发现APC与β-cat，这是意料之外的，因为这两种蛋白在体外以相互排斥的方式相互作用。因此，假设β-cat必须在含APC的核进出口复合物和DNA-结合的LEF-1/TCF增强子复合物之间转移。ChIP数据显示了另一种情况，APC作为核伴侣，伴随着β-cat在DNA上的启动和关闭。染色质复合物的实时PCR分析提供了一些转录因子交换动力学的更定量评估（图。)，这支持了APC与c-Myc增强子相关的结论，其动力学类似于对β-cat、Pygo和Bcl-9/Lgs观察到的动力学。
HT29-APC细胞中c-Myc转录的抑制伴随着APC、βTrCP的结合,和CtBP到增强子
这些观察结果提示我们，APC和βTrCP等破坏复合亚单位可能参与转录，例如，分解Wnt增强子复合物或介导转录周期间辅活化子和辅加压子复合物的交换。在持续诱导β-cat的经锂处理的C2C12细胞中，很难评估这种可能性，但我们推断，通过ChIP检测结肠癌细胞APC表达时c-Myc转录的关闭可能有用。在这些实验中，我们使用了一种工程化的HT29-APC结直肠癌细胞系(Morin等人，1996年)，包含一个不能降解内源性β-cat的截短的II类突变APC，以及一个在锌诱导金属硫蛋白（MT）启动子控制下的完整全长APC转基因。锌在这些细胞中诱导野生型APC可促进β-cat的降解并抑制Wnt靶基因的表达。作为对照，在HT29-β-Gal细胞中进行ChIP实验，该细胞含有一个由相同的锌诱导MT启动子表达的β-半乳糖苷酶转基因(Morin等人，1996年)。
如图所示，HT29-APC细胞暴露于锌导致APC RNA快速诱导（1-7通道），而稳态c-Myc RNA水平在2至3小时后显著下降（8-15通道）。相反，两种细胞系中的β-actin mRNA水平均不受锌的影响，锌对对照HT29-β-Gal细胞中的c-Myc mRNA水平没有影响（图4A，16-22巷）。全长APC蛋白的免疫印迹相对不敏感，但在用锌诱导后8–12小时，蛋白逐渐积累，而β-cat和c-Myc蛋白的稳态水平在4到8小时之间显著下降（图。，1-5车道）。这些提取物中的Sp1转录因子水平没有变化，作为对照进行监测。ChIP分析显示，在缺乏锌的两种细胞系中，LEF-1、β-cat、Pygo、Bcl-9/Lgs和MLL2/SET1型复合物亚单位均存在于活性c-Myc增强子处（图。、HT29-β-Gal细胞的通道1和HT29-APC细胞的通道8）。正如预期的那样，RNAPII、CDK9、乙酰化H4K8和三甲基化H3K4也在活性c-Myc基因中高水平表达（图。，1-7车道）。有趣的是，内源性II类突变HT29 APC蛋白也被招募到体内活性c-Myc增强子中。然而，与氯化锂处理的C2C12细胞中的情况不同，β-cat和相关的辅活化因子并没有循环增强子，而是像LEF-1一样与c-Myc基因稳定结合。
在HT29-APC CRC细胞系中APC诱导的人c-Myc基因转录关闭的分析。(A、 顶部，车道1–7)氯化锌暴露后HT29-APC细胞APC-FL mRNA诱导的RT-PCR分析2对于不同的时间（以分钟为单位），如图所示在上面每条车道。β-肌动蛋白mRNA的RT-PCR分析显示在下面作为控件。(中间，车道8–15)氯化锌中c-Myc mRNA水平下降的RT-PCR分析2-处理过的HT29-APC细胞，暴露于ZnCl的次数2（以小时为单位）显示在上面每条车道。β-肌动蛋白mRNA的RT-PCR分析显示为对照。(底部，车道16–22)RT-PCR分析暴露于ZnCl的对照HT29-β-Gal细胞中的c-Myc、APC-FL和β-actin mRNA水平2在指定的时间内在上面每条车道。(B、，车道1–5)ZnCl处理HT29-APC细胞提取物中APC-FL、β-cat和c-Myc蛋白稳态水平的免疫印迹分析2指示的不同时间（小时）在上面每条车道。Sp1转录因子的水平作为对照。(C类)HT29-β-Gal细胞c-Myc基因结合转录因子的ChIP分析1–7)或HT29-APC单元（车道8–14)通过接触氯化锌2表示不同的时间（分钟）在上面每条车道。(D类)通过RT-PCR对中分析的一些相同因素进行ChIP分析C、。每个小组分析HT29-APC细胞（蓝色）和对照HT29-β-Gal细胞（红色）中c-Myc增强子的转录因子占用情况。FL-APC是用C末端结构域（APC-C）特异性抗血清检测的，而突变APC蛋白是用蛋白N末端（APC-N）特异性抗体检测的。(E类)Re-ChIP分析以测试突变HT29 APC蛋白和内源性β-catenin是否与HT29 CRC细胞中的c-Myc增强子共存。首先使用α-β-cat抗体对HT29-β-Gal细胞（不含锌）进行ChIP，并将免疫复合物稀释在10 mM二硫苏糖醇中。然后用α-APC（N末端特异性）或α-LEF-1抗血清对等分样品进行免疫沉淀，并使用c-Myc增强子特异性引物通过PCR扩增沉淀的染色质。
尽管暴露于锌对对照HT29-β-Gal细胞中的任何这些转录因子相互作用没有影响（图。全长APC蛋白的诱导导致Wnt增强子蛋白（β-cat、Bcl-9/Lgs和Pygo）和相关辅激活物（MLL2、menin、RbBP5、Ash2）从HT29-APC细胞中的c-Myc基因中快速分离（图。，8–14车道）。在这些实验中，RNAPII和H3K4Me3水平逐渐下降，而LEF-1水平保持不变。最有趣的是，在β-cat和辅活化蛋白丢失期间，全长APC蛋白瞬时出现在c-Myc增强子处（图。)与βTrCP、CtBP和YY1蛋白结合。在随后的时间里，在被抑制的基因中，只有TLE-1和HDAC1共抑制因子被LEF-1检测到（图。，8–14车道）。这些数据表明，APC介导的c-Myc转录的阻断分两步进行，首先是全长APC和CtBP辅压因子与增强子的瞬时结合，然后是TLE-1和HDAC1的稳定结合。
为了更详细地检查转录辅激活物和辅抑制物复合物的交换，用RT-PCR分析了HT29-APC和HT29-β-Gal细胞中LEF-1、β-cat、Pygo、Bcl-9/Lgs、APC和CtBP与c-Myc增强子的关联（图。). 这些结果表明，β-cat、Pygo和Bcl-9/Lgs以类似的动力学退出启动子，而Ash2和H3K4Me3水平下降较慢。在HT29-APC细胞的c-Myc增强子处检测到APC-FL和CtBP，有时与β-cat和辅活化子亚单位的丢失重叠。为了进一步评估截断突变APC是否存在于HT29细胞中与β-cat的稳定多蛋白复合物中，用β-cat抗体分离HT29-β-Gal细胞系的染色质复合物，并用APC和LEF-1抗血清进行reChIP。如图所示，APC和LEF-1都可以从最初的β-cat染色质复合物（通道8、9）中免疫沉淀，表明这三个因素在体内密切相关。最重要的是，我们注意到，c-Myc增强子处的辅激活物和辅抑制物复合物的交换显著提前了由APC介导的蛋白水解降解导致的β-cat蛋白水平的下降，这强烈表明APC直接和立即起作用，促进Wnt靶基因的抑制。
β-cat与CKIδ-磷酸化APC结合块与LEF-1结合并抑制LEF-1:β-cat转录
这些观察结果使我们重新审视了当β-cat与DNA上的LEF-1结合时，它是否能与Pygo和Bcl-9/Lgs或APC同时相互作用的问题。在SW480核提取物进行的下拉实验中，我们最初评估了GST-LEF-1或APC的不同结构域是否能够结合内源性β-cat蛋白（图。). 在这些研究中，我们使用了人类APC蛋白GST-APC-A、B、C，其中包含所有三个15-氨基酸重复序列；或GST-APC-2,3，包含第二和第三个20-氨基酸重复序列(Xing等人，2003年). 提取物中的天然β-cat与GST-LEF-1具有高亲和力（图。，通道3），弱至APC-2,3碎片（图。，通道6），而不是APC-A、B、C蛋白（图。，车道4）。CK1δ磷酸化APC-2,3（P-APC）使其对重组β-cat的亲和力提高了数百倍(Xing等人，2004年)在我们的实验中，与β-cat的结合大大增强（图。，车道5）。GST-APC-2,3的CK1δ-磷酸化也在体外强烈增强了与全长和N-末端截断（ΔNβ-cat）重组β-cat的结合（图。，参见车道4、5和6、7）。
体外分析重组人β-cat与人LEF-1、人Bcl-9（HD2结构域；氨基酸288–419）、APC-A、B、C或CKI磷酸化或非磷酸化APC-2,3蛋白之间的相互作用。此处使用的（人类）APC片段是APC-A、B、C，其中包含所有三个15-氨基酸重复序列（氨基酸1100–1189），以及APC-2,3，其中包含第二个和第三个20-氨基酸重复片段（氨基酸1362–1540；Xing等人，2003年). (A类)在使用SW480核提取物进行的GST下拉实验中，APC-2,3的CKI-磷酸化增强了与β-cat的结合。SW480核提取物与耦合到以下GST融合蛋白的谷胱甘肽S-Sepharose 4B珠培养：GST-LEF-1、GST-APC-A、B、C、CKI-磷酸化（P-APC）或未磷酸化GST-APC2,3或GST（对照），并在严格清洗珠后通过Western blot检测相关核β-cat。SW480提取物中的β-cat（输入，1%）显示在车道中1Ponceau S染色显示串珠偶联GST融合蛋白作为负荷控制。(B类)FL和ΔNβ-连环蛋白通过在偶联的网织红细胞裂解物（Promega）中的体外转录和翻译产生，并测试其与未磷酸化的（泳道6,7)或CK1δ-磷酸化（车道4,5)GST-APC-2,3。通过Ponceau S染色在底部面板。(C类)体外EMSA实验中，磷酸化APC-2,3阻断β-cat与LEF-1的结合。车道上存在重组LEF-1（ΔAD；1μM）2,和4–10,β-cat（ΔN；1μM）存在于泳道中3–10.如有说明，反应也包含2μM（车道5)或12μM（车道6)CK1δ-磷酸化GST-APC-2,3或2μM（车道7)或12μM（车道8)GST-APC-2,3（未磷酸化）或25μM GST（车道9)或GST-HD2（车道10). (D类)CK1δ-磷酸化APC在体外阻断染色质pBRE模板的β-cat:LEF-1转录。反应包含100或600 nM CK1δ-磷酸化GST-APC-2,3（通道4,5)或GST-APC-2,3（未磷化；车道6,7). 染色质组装完成后，添加磷酸化和非磷酸化的GST-APC-2,3（100 nM）蛋白，如图所示8和9,分别是。
为了评估这些复合物的DNA结合活性，在体外用重组LEF-1、β-cat、Bcl-9（HD2结构域）和APCβ-cat相互作用区域的片段进行了EMSA实验。如图所示β-cat很容易与DNA上的LEF-1形成三元复合物（第4车道）；然而，该复合体的迁移不受高水平GST-APC-2,3或GST（分别为7、8、9车道）的影响。相反，CK1δ-磷酸化的GST-APC-2,3竞争形成β-cat:LEF-1:DNA复合物（图。，通道5,6），表明β-cat无法同时与P-APC-2,3和LEF-1结合。Bcl-9 HD2结构域得到了相反的结果，该结构域很容易在DNA上结合β-cat:LEF-1（图。，巷10），表明β-cat可以同时结合LEF-1和Bcl-9的这一区域。正如这些结果所预期的那样，CK1δ-磷酸化的GST-APC-2,3蛋白在体外强烈阻断了β-cat调节的转录（图。在DNase I足迹实验中，还抑制了β-cat和LEF-1与染色质的协同结合（图。，底部，参见车道3和5）。我们从这些实验中得出结论，β-cat不能有效地结合未磷酸化的APC，APC的CK1磷酸化可能诱导与β-cat的高亲和力结合并触发其与LEF-1的分离。
野生型，但不是突变型，APC蛋白与提取物中的CtBP辅压因子相关
最近有报道称，在c-Myc转录关闭期间，APC与CtBP在c-Myc增强子处的共定位特别有趣，因为这两种蛋白质在体内外都直接相互作用(滨田和比恩茨2004). 然而，我们注意到，在HT29-β-Gal细胞的活性c-Myc处，CtBP不存在截短的APC，而是仅与全长APC蛋白出现，这表明CtBP与体内DNA上截短的APC蛋白无关。因此，我们进行了共免疫沉淀实验，以检测CtBP与293个结直肠癌细胞株核提取物中天然全长和突变APC蛋白的结合。如图所示，CtBP很容易在293细胞（第1通道）核提取物全长APC的免疫沉淀物中检测到，但与HT29（第2通道）或SW480（第3通道）CRC细胞核提取物中存在的截短APC蛋白无关，尽管每个提取物（第4-6通道）中的CtBP水平相同。我们得出结论，在核提取物中，CtBP优先与全长APC蛋白相互作用。
CtBP与全长APC相关，但与癌相关的截短APC蛋白无关。(A类)如图所示，使用293T细胞、SW480或HT29 CRC细胞的核提取物通过免疫印迹分析CtBP与全长或突变APC蛋白的共免疫沉淀在上面每条车道。（车道1–3)使用对蛋白N末端半部分特异的抗体免疫沉淀APC，并通过免疫印迹检测任何相关的CtBP。输入的CtBP在通道中显示（通过免疫印迹）4–6,输入的APC蛋白（通过免疫印迹）显示在通道中7–9.(B类)HT29-APC细胞中新表达的全长APC与CtBP相关。用100μM ZnCl处理HT29-APC和HT29-β-Gal细胞2诱导全长APC表达，并通过抗APC免疫沉淀物（lanes）的免疫印迹测定与CtBP的相关性1,2)或使用对照抗IgG血清（lanes5,6). 每种提取物中输入的CtBP蛋白显示在通道中三和4野生型APC和突变型HT29 APC的示意图如底部。（S1–S3）Axin结合位点。
为了证实这一观察结果，我们测试了CtBP是否与锌处理的HT29细胞中诱导的全长APC蛋白相关。如图所示（通道4），从HT29-APC细胞系的APC-FL免疫沉淀物中很容易检测到CtBP，但与从对照锌处理的HT29-β-半乳糖苷酶细胞（通道3）中免疫沉淀下来的突变APC蛋白无关，尽管提取物中的CtBP水平相同（通道1、2）。对照IgG抗血清未检测到CtBP（图。车道5、6）。这些数据证实了先前报告的APC和CtBP之间的强相互作用哈马达和比恩茨（2004）并通过显示在核提取物中，CtBP与I类或II类突变APC蛋白没有物理关联来扩展这些发现。我们无法确认之前CtBP相互作用位点与APC 15-氨基酸重复序列域的映射，也无法在含有所有三个15-氨基酸重排的APC片段的GST下拉实验中检测到CtBP（数据未显示）。这种明显差异的原因可能是我们的分析的严格约束条件以及我们使用的是核提取物而不是全细胞提取物。综上所述，这些实验强烈表明全长APC蛋白优先与核CtBP相互作用。这些数据表明核APC在Wnt转录调控中发挥着重要作用，如图所示并在下文中进一步讨论。
APC在Wnt靶基因辅激活物和辅抑制物复合物交换中的作用模型。在活性基因处，β-cat与Bcl-9:Pygo和MLL1/MLL2复合物相互作用以促进H3K4Me3。APC肿瘤抑制因子通过与CtBP相互作用的能力调节转录辅激活物和辅抑制物复合物之间的转换。GSK-3β和CK1对APC的磷酸化可诱导APC结合β-cat，并将其从LEF-1中清除。β-cat随后可能作为APC复合物的一部分从细胞核输出，或者，它可能被βTrCP泛素化，以便在DNA或细胞中的其他地方降解。
讨论
APC在体内CtBP介导的Wnt转录抑制中的作用。
这里的数据支持APC肿瘤抑制因子直接作用于体内抵消Wnt靶基因β-cat介导的转录的模型。这一可能性首先由发现在氯化锂处理的C2C12细胞中，全长APC与β-cat和相关辅活化子结合，开启和关闭c-Myc增强子（图。). 相反，增强子复合物似乎是稳定的，并且在HT29 CRC细胞中不循环，HT29 CRC细胞含有一种II类APC突变蛋白，不能降解β-cat（图。). 最引人注目的是，HT29-APC细胞中全长APC蛋白与c-Myc基因的结合与体内Wnt增强子复合物的快速分解以及随后稳态c-Myc mRNA水平的下降相关，这两种情况都明显先于细胞质中的蛋白水解降解导致的β-cat蛋白水平下降（图。). 因此，APC对c-Myc转录的影响似乎是直接和直接的，并且可能有助于协调β-cat辅活化子和TLE1辅升压复合物之间的转换（图。)。
β-cat增强子复合物包括Wnt辅活化子Pygopus和Bcl-9/Lgs，它们控制β-cat在细胞核中的滞留(Townsley等人，2004年)也可能直接在转录中起作用(霍夫曼和巴斯勒2004；Hoffmans等人，2005年). APC也可以调节β-cat的核转运(Rosin-Arbesfeld等人，2003年)提出了这样一种可能性，即这些因素可能存在于一个更大的调控复合体中，该复合体伴随β-cat进出细胞核并调节其从DNA中释放。事实上，连续的ChIP（re-ChIP）数据表明HT29结直肠癌细胞中的突变APC存在于活性c-Myc基因上与β-cat和LEF-1的稳定复合物中（图。). 这一发现出乎意料，因为β-cat不能同时与APC和LEF-1结合，因此，如果全长APC是更大的β-cat:LEF增强子复合物的一部分，它可能与其他亚单位相互作用。或者，全长APC和β-cat可能存在于不同的复合物中，在增强子处快速交换。我们目前的数据表明，靶向性是由APC蛋白的N末端一半介导的，CtBP和βTrCP仅与全长APC蛋白结合出现。如何将APC招募到Wnt增强子中仍是一个公开而重要的问题。
ChIP实验还表明，APC介导的HT29细胞c-Myc转录抑制分为两个步骤，首先是APC、βTrCP、CtBP和YY1与增强子的瞬时结合，然后是TLE-1和HDAC1辅阻遏物的稳定结合。当β-cat、Bcl-9、Pygo和其他Wnt增强子因子离开DNA时，APC和CtBP的短暂募集强烈表明这些因子在Wnt辅活化子和辅升压复合物的交换中起作用。在这方面，有趣的是，最近发现CtBP在体内和体外都与APC相关(滨田和比恩茨2004). 我们的结果证实了CtBP与HT29-APC细胞中诱导的全长APC蛋白以及293细胞中的天然（全长）APC蛋白之间的高亲和力相互作用（图。). 因此，APC可能发挥招募CtBP到Wnt增强子的作用（图。). 虽然CtBP和TLE-1都是Wnt靶基因的成熟共抑制因子，但这两种共抑制因子的不同功能尚不清楚，ChIP数据表明它们的作用步骤不同。总之，这些数据表明APC抵消细胞核和细胞质中的β-cat功能，并可能通过招募βTrCP和CtBP促进响应基因处增强子复合体的转换。
癌症相关突变APC蛋白与CtBP不相互作用
尽管CtBP与全长APC强烈相互作用，但在SW480或HT29 CRC细胞中突变APC蛋白的免疫沉淀物中未检测到CtBP（图。). 这些发现与最近的一份报告相矛盾，即CtBP与全长和突变APC蛋白中的APC 15-氨基酸重复序列相结合(滨田和比恩茨2004). 我们将这种差异归因于我们分析的严格结合条件以及我们使用的核提取物而非全细胞提取物。观察到只有全长APC蛋白可以与CtBP相互作用，这可能解释了为什么在体内活性c-Myc基因的突变APC蛋白中既没有CtBP也没有βTrCP（图。). 重要的是，图中概述的模型强烈支持前面的结论哈马达和比恩茨（2004）CtBP并不是通过与LEF-1/TCF蛋白结合而被招募到Wnt增强子中，我们推测相反，CtBP和βTrCP是由APC带到增强子的。有趣的是，CtBP复合物包含一个具有胺氧化酶活性的亚单位LSD1，它能够在体外逆转单和双H3K4甲基化(Shi等人，2003年；Wysocka等人，2005a)，因此也可以改变模板的表观遗传状态。鉴于这些观察结果，评估体内Wnt增强子的辅激活剂和辅加压剂复合物的交换是否也需要CtBP和βTrCP将特别有趣。
H3K4三甲基化在β-cat调节转录中的中心作用
为了阐明抑制机制，了解β-cat如何激活靶基因是很重要的。这里的数据表明组蛋白H3K4三甲基化在β-cat反式激活中起着关键作用。我们的生物化学研究表明，β-cat的C末端激活域与来自TRRAP/TIP60、ISW1和与三唑烷相关的MLL1/MLL2 SET1型HMT复合物的染色质重塑或修饰亚单位有物理关联（图。). SET1型复合物介导组蛋白H3K4的三甲基化，这是一种与转录延伸密切相关的高活性基因的特征染色质修饰（有关综述，请参阅汉普西和莱因伯格2003). H3K4的三甲基化需要H2B在K120的泛素化，并且在体内受到Bre1:Rad6泛素连接酶和19S蛋白酶体ATP酶亚基Rpt4和Rpt6的刺激(Ezhkova和Tansey 2004). 我们发现，在锂处理的C2C12细胞中，β-cat诱导c-Myc转录后，H3K4Me3水平显著增加（图。)当该基因在HT29-APC细胞中被抑制时逐渐下降。鉴于最近的数据表明，酵母Isw1p-ATP酶似乎以减弱RNAPII转录并促进延长以响应H3K4三甲基化的方式重塑染色质的方式，观察到β-cat与ISW1复合物相关是一个有趣的现象(Morillon等人，2003年,2005；Santos-Rosa等人，2003年). 通过推论，这些研究表明，β-cat通过招募指导H3K4三甲基化的染色质复合物来调节靶基因转录延长的早期阶段。
泛素在转录中的多重作用
体外转录所需的β-cat激活域的观察(Tutter等人，2001年)与H3K4甲基化因子相关，导致我们询问泛素是否是体外β-cat活性所必需的。我们发现染色质pBRE模板的体外β-cat转录被单泛素结合Vsp9-CUE结构域特异性阻断，并且可以被外源泛素拯救。染色质上的转录起始需要泛素的结论支持了最近的报道，即纯化的MLL1/SET1复合蛋白在体外可以强烈增强染色质模板上的转录启动(Dou等人，2005年). 相反，泛素对裸DNA转录的启动或延伸都不需要。尽管短命酸性激活剂的泛素化也与体内转录延长密切相关(Muratani和Tansey，2003年)，我们的实验是用一个缺失N末端调控域的截短β-cat蛋白进行的，这表明β-cat本身不太可能是这些实验中泛素化的靶点。重组Notch增强子复合物的转录也需要泛素，这一发现进一步表明，这是染色质上转录的一种普遍现象，与最近的研究一致，研究表明调节RNAPII转录激活中普遍需要这一步骤(Dou等人，2005年；Guenther等人，2005年；Milne等人，2005年；Wysocka等人，2005年b). 这些发现保证了进一步的机制研究，以确定H2B的泛素化是否会增强体外转录启动，并更好地阐明泛素化和甲基化步骤在转录早期是如何协调的。
由于GSK-3β和βTrCP都存在于c-Myc增强子处的APC，因此β-cat的磷酸化或泛素化以及APC的磷酸化可能是体内增强子复合物分解的重要触发因素。CKIδ对APC 20-氨基酸重复序列的磷酸化大大增强了与β-cat的结合并破坏了其与LEF-1的相互作用(Ha等人，2004年)，并在体外阻断结合和转录（图。). 一种可能性是APC可能结合并将β-cat运输出细胞核，以在细胞质中进行蛋白水解降解。或者，泛素化的β-cat可能在DNA处发生蛋白水解降解，因为最近研究表明，蛋白水解可以在体内刺激酵母GCN4和GAL4活化剂的活性(Lipford等人，2005年). 在HT29细胞中，突变APC蛋白存在于活性基因上；然而，βTrCP没有被征募，增强子复合物也没有翻转，这表明β-cat的泛素化可能不是转录激活所必需的，相反可能有助于促进辅激活子和辅抑制子复合物的交换，并促进Wnt靶基因的转录抑制。总之，这些发现表明，在体内Wnt靶基因的激活和转换过程中可能存在多种依赖于泛素的步骤。
最后，观察到APC和β-cat都进入细胞核来调节Wnt靶基因的表达，进一步强调需要评估Wnt途径是否进化为直接协调细胞粘附、形态、极性或迁移的变化与细胞核中基因调节的变化。因此，β-cat不仅是核转录辅激活子，而且与膜结合的钙粘蛋白结合以控制细胞粘附，与肌动蛋白微丝结合以控制细胞核形态(Nelson和Nusse 2004；Bienz 2005年；哈里斯和佩弗2005). 同样，APC通过与微管和F-actin的相互作用控制肌动蛋白细胞骨架组织和细胞移动(Bienz和Hamada 2004). 考虑到肌动蛋白信号传导和转录之间的许多新兴联系，包括组蛋白甲基转移酶在肌动蛋白聚合中的作用(Nolz等人，2005年)这些问题对于理解组织发育和肿瘤转移具有重要意义。
材料和方法
质粒、重组蛋白和抗体
用PCR-扩增并克隆了带有His标记的人类Pygopus（氨基酸1-160）和人类Bcl-9（氨基酸1181-1426）cDNA，在pET-28a（+）（Novagen）表达质粒的BamHI和HindIII限制位点之间带有6-组氨酸标记。His-tagged蛋白纯化方案已在前面描述(Tutter等人，2001年)，并用这些抗原在兔子体内制备多克隆抗血清（Pocono Rabbit Farm and Laboratory，Inc.）。使用的商业抗血清为β-cat、APC、βTrCP和GSK-3β（Santa Cruz Biotechnology）；MLL1、MLL2、RbBP5、Menin、Ash2L（Bethyl Laboratories）以及H4K8Ac和H3K4Me3（Upstate）。
细胞
小鼠C2C12和人SW480细胞系来自美国型培养物收集。C2C12细胞在补充有10%FBS的DMEM培养基中培养，SW480在补充有10%FBS的Leibovitz L-15培养基中培育。人HT29-APC和HT-29-β-半乳糖苷酶细胞系，包含从MT启动子表达的整合APC和β-Gal转基因，如前所述保持不变(Morin等人，1996)细胞暴露于100 mM ZnCl可诱导蛋白质表达2（Sigma）在培养基中的不同时间如图所示。
染色质免疫沉淀实验
约3×107至5×107C2C12细胞在甲醛交联前48小时进行电镀，并通过血清饥饿进行同步。诱导前两小时，用完整的DMEM替换培养基。然后将C2C12细胞在10 mM LiCl（Sigma）中培养0–2 h，如图中所示的每个实验对于HT29细胞的ChIP分析，通过添加100 mM ZnCl诱导全长APC2到介质。ChIP实验的协议如前所述(Weinmann和Farnham 2002年). 使用Qiaprep Spin Miniprep柱（Qiagen）进行DNA纯化，并使用HotStart聚合酶试剂盒（Qiangen）分析免疫沉淀DNA。PCR引物设计用于扩增人类（HT29实验）或小鼠（C2C12实验）c-Myc基因的特异区域。在这些条件下，PCR产物线性依赖于添加到反应中的基因组DNA的数量。PCR产物在1.8%琼脂糖/TBE凝胶上用溴化乙锭染色进行分析。以免疫沉淀前输入DNA的PCR作为对照。监测第三个LEF-1位点的人类c-Myc启动子引物如下所述(Sasaki等人，2003年). c-Myc引物为人前向引物，5′-GTGAATACACGTTTGCGG GTTAC-3′；人类反面，5′-AGAGACCCTTGAAAAAA ACCG-3′；小鼠向前，5′-CTAGACACAAGAG C-3′；鼠标反转，5′-CTCCCAGAGACAACCAAGCA-3′。小鼠c-Myc启动子阴性对照序列位于TATA盒上游10kb处：正向，5′-ACA CACCTTGAATCGT-3′；背面为5′-CCCAGCTAGAA TGAAGAAG-3′。对于re-ChIP实验，通过在37°C的50μL 10 mM DTT中孵育30分钟来洗脱络合物。离心后，用稀释缓冲液（1.1%Triton X-100，1.2 mM EDTA，167 mM NaCl，16.7 mM Tris-Hcl，pH 8.1）将上清液稀释20倍，然后再次进行ChIP程序。
定量PCR实验在25μL反应中使用96 well微量滴度皿格式进行，生物样品分析一式三份。SYBR GREEN（Applied Biosystems）被用作ABI Prism 7900HT仪器上DNA扩增的标记，SDS 2.1软件用于数据分析（AppliedBiosystes）。折线图表示平均免疫沉淀百分比的相对值，将值100%指定为每个样本中免疫沉淀的最大百分比。C2C12细胞中鼠c-Myc基因的引物为Mmyc-QPCR-1F，CACACACATACGAAG GCAAAA；Mmyc-QPCR-1R，AAAAGTCGGCCCTGATCAG；HT29细胞中的人c-Myc基因：Hmyc-QPCR-1F，CCCAAAAAAGGCACGGAA；Hmyc-QPCR-2R，TATTGGA AATGCGGTCATGC。
免疫共沉淀和免疫印迹分析
为了通过共免疫沉淀确定APC蛋白是否与CtBP相关，将来自293、HT29或SW480细胞的200μg预处理核提取物等分试样在结合缓冲液中以1:5的比例稀释（20 mM HEPES，pH 7.9，20%甘油，0.5 mM DTT，0.5 mM-PMSF，1μg/mL亮氨酸蛋白酶，1μg/mL抑肽酶，0.1%NP-40），并分别用1μg抗APC（圣克鲁斯生物技术）和20μL蛋白-g琼脂糖（圣克鲁兹生物技术）在4°C下连续培养90分钟。然后用3×500μL洗涤缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.9，75 mM KCl，2.5 mM MgCl2，1 mM DTT，0.1%[v/v]Nonide P-40，0.5 mM PMSF，1μg/mL亮氨酸肽，1μg/mL抑肽酶），在SDS样品缓冲液中煮沸洗脱，并用SDS-PAGE分析。
GST下拉、HMT/HAT分析、体外转录和结合实验
GST下拉和体外转录实验是使用前面描述的方案进行的(Tutter等人，2001年). 对于SW480CRC提取物的下拉实验，针对HM 0.1M（20 mM HEPES，pH 7.9，100 mM KCl，0.2 mM EDTA，12.5 mM MgCl2，10%甘油）。将300μL（500μg）等分的核提取物与700μL HM 0.1M和40μL悬浮GST融合蛋白偶联谷胱甘肽Sepharose 4B珠（10μg，最终100 nM）孵育，并在4°C下摇晃孵育4小时，在缓冲液中洗涤五次（50 mM HEPES，pH 7.9，150 mM NaCl，0.2 mM EDTA，12.5 mM MgCl2，40μM硫酸锌4，10%甘油和0.5%吐温20），并通过SDS-PAGE进行银染和免疫印迹分析，或在HMT和HAT分析中进行酶活性分析。HMT分析在反应缓冲液HM 0.06M（NaCl）中的50μL反应（最终体积）中进行。将一半样品珠与[3H]-S-腺苷蛋氨酸（SAM）或[3H]乙酰-CoA在10 mM ATP和2μg纯化核心组蛋白的存在下在30°C下孵育30分钟。对于APC的体外磷酸化，将约30μg纯化的GST-APC（3×20个氨基酸重复序列）与0.5μL（500 U）CKIδ（新英格兰生物实验室）在30μL反应中孵育，反应中加入或不加入1mM ATP，最终缓冲液浓度如下：50mM Tris-HCl（pH 7.5），10mM MgCl2和5 mM DTT，并在30°C下培养30分钟，然后通过SDS-PAGE进行分析。用Bruker Ultraflex TOF/TOF MALDI质谱仪鉴定切除的蛋白质。
在siRNA敲除实验中，使用寡效胺（Invitrogen）将LEF-1和β-cat瞬时表达载体与β-cat（5′-UCAUGCACCUUUGC GUGAGTT-3′；5′-GCUCAUCAUACUG-GCUAGUTT-3′）或MLL2（5′-GCGUAGAAUGCGUUCT-3′，5′-AUUCUG CCACUGUGGATT-3′）的siRNA一起转染到HeLa细胞。在获取总RNA前2 h，即转染后48 h，将LiCl添加至最终浓度15 mM，并将β-cat活性与未转染对照进行比较。
