引言
表面受体转导来自细胞外环境的信号，以引起各种各样的细胞反应。这一过程是在配体结合时启动的，并通过受体与细胞内信号分子的物理相互作用的时空调控进行转导。功能获得或丧失突变体改变了细胞内环境稳定的正常平衡，反过来又可能导致肿瘤发生和/或发育停滞。对许多受体来说，配体的触发导致受体聚集，随后通过内吞和随后的溶酶体降解下调活化的表面受体(Ceresa和Schmid，2000年). 后一步骤通常通过去除激活的受体复合物来减弱信号传递。然而，最近的研究表明，受体内化可以将激活的受体靶向内吞室，并有助于信号强度和信号复合物的组装(米亚琴斯卡等，2004年b).
CD95（CD95/APO-1/TNFRSF6）是一种典型的死亡受体，属于肿瘤坏死因子（TNF）受体超家族(Li-Weber和Krammer，2003年). CD95与其配体CD95L（CD178/FasL/TNSF6）的相互作用在外周耐受性和淋巴稳态的调节中起着关键作用。人类和小鼠CD95和CD95L内的自然突变与自身免疫性淋巴增殖综合征的发生有关(长田，1999). CD95在细胞表面以预缔合同源三聚体的形式表达，并在CD95L结合后发生构象变化，以揭示其细胞质死亡结构域（DD），从而有利于与其他含DD的蛋白质的同源相互作用(伊藤和长田，1993年;博尔丁等, 1995;钦奈人等, 1995;西格尔等, 2000). 通过FADD的N末端“死亡效应域”（DED）与procasase-8和-10中编码的DED域介导的其他相互作用组装死亡诱导信号复合物（DISC）(Peter和Krammer，2003年). 高效的DISC组装提供了一种浓缩半胱氨酸蛋白酶的分子支架，以诱导caspase-8的自溶裂解，进而激活凋亡途径。
CD95介导的细胞凋亡通过两种通用模式转导(Algeciras-Schimnich公司等, 2003;巴恩哈特等, 2003). I型细胞表现出快速的受体内化并形成大量的DISC，而II型细胞更依赖线粒体扩增途径，在数量上表现出较少且较慢的DISC组装。我们在此证明，I型细胞中的CD95内化在CD95L诱导的凋亡途径激活中发挥了以前未被认识到的必要作用。相反，在没有受体内化的情况下参与CD95会激活非凋亡信号通路。因此，CD95信号传导的亚细胞室激活不同的生化途径，以促进不同的存活或凋亡细胞命运。
结果
质膜定位PIP的表达2-特异性5-磷酸酶调节PIP2水平并抑制CD95L诱导的CD95内化和凋亡
我们之前已经证明，丝状肌动蛋白的破坏抑制CD95内化，这一过程通常通过网格蛋白介导的内吞室进行，并使细胞对CD95介导的凋亡更具抵抗力(Algeciras-Schimnich公司等, 2002;Algeciras-Schimnich和Peter，2003年). 作为PIP的细胞水平2（铂族锡（4,5）P2)已经证明可以调节氯氰菊酯介导的内吞作用(马丁，2001)，我们采用酶法，使用酿酒酵母Inp54水解PIP的5-磷酸酶（INP54p）2至PI（4）P(斯托尔茨等, 1998). 通过从Fyn蛋白酪氨酸激酶附加肉豆蔻酰化/棕榈酰化序列，实现了绿色荧光蛋白（GFP）–INP54p融合蛋白靶向质膜（PM）(谢诺伊·斯卡里亚等, 1993;劳赫尔等, 2000) (补充图1A，中间面板）。FynC-GFP-INP54p表达降低PIP2>98%转染GFP的水平+，但不是GFP−，个单元格(补充图1B，中间面板）。相反，Cys 3和6对棕榈糖基化和PM定位很重要的突变体的表达突变为Ser（命名为FynS-GFP-INP54p），导致细胞质分布(补充图1A，右侧面板），对PIP的影响较小2水平补充图1B，底部面板）。项目实施计划2表达对照FynC-GFP cDNA的细胞中的水平不受影响（顶面板）。
接下来我们研究了PIP降低的功能后果2在CD95功能中。用Flag-taged（Flag-）CD95L（SuperFasL，Apotech）刺激瞬时转染FynC-GFP-INP54p、FynS-GFP-INP54p或FynC--GFP的BJAB细胞，通过TUNEL染色评估凋亡程度。在FynC-GFP中+或FynS-GFP-INP54p+细胞，约65%的细胞为TUNEL+CD95L刺激后补充图1C，左右面板）。相反，<5%的FynC-GFP-INP54p+BJAB细胞为TUNEL+响应CD95L处理（中间面板）。在第5、16、24和48小时观察到抑制CD95L诱导的凋亡补充图1D). 在I型SKW6.4细胞中也观察到CD95L诱导的凋亡受到类似抑制补充图2A). 相反，FynC-GFP-INP54p的表达并不影响CD95L介导的II型Jurkat T细胞凋亡补充图2B). FynC-GFP-INP54p的表达并未导致BJAB细胞凋亡机制的普遍缺陷，如足叶乙甙诱导的凋亡，其通过线粒体介导的内在途径发挥作用(清水等, 1996)，未受影响补充图2C). 此外，抗凋亡FynC-GFP-INP54p+CD95L激活后的细胞保持正常的细胞生长，与正常的BJAB细胞无明显区别（数据未显示）。
为了确定FynC-GFP-INP54p影响CD95介导的凋亡的生化基础，用Flag-CD95L刺激BJAB细胞，并用免疫印迹法测定其自分裂产物caspase-8和-3的活化。而用Flag-CD95L处理BJAB细胞导致两种半胱天冬酶的时间依赖性切割(，1-4通道），在FynC-GFP-INP54p中未检测到caspase-8或-3激活的证据+BJAB电池（5-8通道）。接下来，我们分析了FADD向活化CD95的募集，这是DISC形成中最接近的生化事件之一。虽然FADD在对照细胞中容易与CD95L结合的CD95共同免疫沉淀，但在FynC-GFP-INP54p中未检测到FADD与活化的CD95的相关性+BJAB细胞(，顶行）。类似地，虽然caspase-8和-10很容易与对照细胞中的CD95/CD95L复合物共免疫沉淀，但在FynC-INP54p中激活的CD95均未检测到这两种酶+BJAB细胞（第二排和第三排）。综上所述，这些观察结果表明FynC-GFP-INP54p可降低细胞PIP2以及CD95L诱导的FADD与激活的CD95、caspase激活和凋亡的关系。
FynC-GFP-INP54p表达细胞中CD95内化缺陷和凋亡诱导。(A类)PM-靶向INP54p表达细胞中caspase激活缺陷。表达对照载体（泳道1-4）或FynC-GFP-IMP54p（泳道5-8）的BJAB细胞用Flag泳道-CD95L刺激指定时间。细胞被裂解并分析caspase-8（顶部）和-3（底部）的裂解。使用双重转染方案，转染效率>90%。所示数据代表了两个实验。(B类)PM-靶向INP54p表达细胞中的DISC组件有缺陷。BJAB细胞按（A）所述进行处理。CD95L–CD95复合物通过使用抗标记抗体偶联珠进行免疫沉淀，并分析相关的DISC蛋白（1-8通道）。还分析了细胞裂解液中的DISC蛋白和CD95表达（通道9和10）。所示数据代表了三个实验。(C类)瞬时转染FynC-GFP-INP54p的BJAB细胞用Flag-CD95L刺激指定时间。通过反褶积显微镜观察左侧面板中渗透细胞的GFP（绿色），并对中间面板中的CD95（红色）和F-actin（蓝色）进行染色。右侧面板显示了CD95荧光信号记录的RPV定量图像分析。红色表示最高荧光强度，蓝色表示最低荧光强度。RPV=相对像素值。所示数据代表了所分析的150多个细胞。(D类)FynC-GFP-INP54p抑制CD95内化。转染FynC-GFP（顶部）或FynC-GFP-INP54p（底部）的BJAB细胞在37°C下与Flag-CD95L孵育15（绿色）或30分钟（红色）。作为对照，用Flag-CD95L在冰上培养细胞（0分钟，黑色）。用抗CD95单克隆抗体（DX2）染色检测剩余表面CD95，并用流式细胞仪进行分析。所示数据代表了四个实验。
由于FynC-GFP-INP54p没有改变CD95L与CD95的结合补充图3A)，我们评估了FynC-GFP-INP54p对CD95聚集的影响。细胞在4°C用Flag-CD95L孵育，在37°C孵育诱导激活，CD95的定位通过反卷积显微镜分析。在wt BJAB细胞中（GFP−刺激后5分钟内，CD95L在PM处诱导小的“斑块样”受体簇(，面板4-6，左侧单元格）。FynC-GFP-INP54p的表达并不影响CD95L在激活后5分钟的PM诱导CD95聚集的能力(，面板4-6，GFP+单元格）。在15和30分钟时，GFP中聚集的CD95−细胞已经内化为细胞内的隔室(，面板7–12，左侧单元格）。相反，在FynC-GFP-INP54p中，CD95在PM处聚集至少30分钟+CD95L刺激后无明显内化的细胞(，面板7–12，右侧单元格）。
流式细胞仪研究进一步支持了这些结果。在转染对照FynC-GFP的BJAB细胞中，CD95L激活后15分钟内检测到CD95下调(，顶部面板）。相反，FynC-GFP-INP54p+细胞甚至在CD95L激活后30分钟也不能下调表面CD95（下图）。SKW6.4细胞也有类似结果补充图2D).
膜结合CD95L（mCD95L）诱导的凋亡需要CD95内化
我们迄今为止的数据表明，CD95介导的对可溶性CD95L（sCD95L）刺激反应的凋亡需要受体内化。然而，人们普遍认为CD95的生理刺激更可能是mCD95L。因此，我们将表达人mCD95L（CT26mCD95L）的小鼠CT26细胞与SKW6.4细胞孵育。在CT26mCD95L细胞或这些细胞培养物的浓缩上清液中未检测到可溶性CD95L补充图4B和数据未显示）。在SKW6.4细胞中，当与CT26mCD95L共同孵育时，CD95被有效内化，但在未经处理的SKW64细胞中没有内化(和(补充图4A和B). 相应地，CT26mCD95L细胞诱导了procasase-8的时间依赖性加工补充图4C). 当SKW6.4细胞被贴附在粘附的CT26细胞上时，CD95内化在接触CT26mCD95L但不接触对照CT26细胞的SKW6.4中(，底部面板）。这些数据表明，mCD95L诱导CD95内化的程度与sCD95L相同。
膜结合CD95L诱导CD95内化。(A类)mCD95L激活后CD95在SKW6.4细胞上的内化。SKW6.4细胞与FITC-DX2在冰上孵育。然后，细胞未经处理或与表达人mCD95L的分离CT26细胞孵育1小时。细胞核用DAPI染色，CD95用共焦显微镜观察。左下面板表示早期，细胞核完整，内含CD95小泡（箭头）。右下图显示了细胞核碎裂的细胞凋亡晚期。(B类)SKW6.4细胞上的CD95在接触侧与表达mCD95L的CT26细胞内化。将带有结合生物素标记的抗CD95单克隆抗体的SKW6.4细胞（标记为S）涂布在粘附的CT26或CT26mCD95L细胞（标记C）的顶部，并按照指示进行培养。通过链霉亲和素Alexa Flour 488染色观察CD95。DAPI染色显示细胞核。(C类)抗裂解mCD95L（DA4）激活后CD95在BJAB细胞上的内化。将BJAB细胞（标记为B）与鸡DT40细胞（标记为D）（左图）或表达人mCD95L（DA4）的DT40细胞（右图）孵育1小时，然后通过去卷积显微镜分析CD95（红色）、表面hIgM（绿色）和DAPI染色（蓝色）。(D类)抑制mCD95L诱导FynC-GFP-INP54p表达细胞凋亡。用FynC-GFP-INP54p或对照FynC--GFP转染BJAB细胞，并与表达人类mCD95L（DA4）不可清除突变的DT40细胞以1:5（BJAB:DT40）的比例孵育指定时间。GFP的凋亡+细胞通过Annexin V染色进行评估。显示的数据是两个独立实验的代表。(E类)抑制FynC-GFP-INP54p表达细胞中mCD95L介导的CD95下调。如D所述转染BJAB细胞，与表达mCD95L（DA4）的DT40细胞孵育30或60分钟。GFP上表面CD95表达+流式细胞术检测细胞。所示数据代表了两个独立的实验。
我们之前已经表明，未修饰的sCD95L不会在I型细胞中诱导CD95凋亡(Algeciras-Schimnich公司等, 2003). 然而，为了排除暴露于mCD95L的细胞中观察到的内化和凋亡不是由于分泌的sCD95L量非常少，我们表达了一种无法从膜表面分离的人类mCD95L突变形式（称为DA4）(田中等, 1998)在鸡DT40 B细胞表面补充图3B). 反褶积显微镜证实，当与表达mCD95L（DA4）的DT40细胞孵育时，CD95内化到细胞质室(，右侧面板），但与对照DT40细胞（左侧面板）孵育时没有。
接下来我们测试了mCD95L诱导的细胞凋亡是否受到FynC-GFP-INP54p表达的影响。表达CD95L（DA4）突变体的DT40细胞诱导FynC-GFP细胞凋亡+BJAB细胞(在FynC-GFP-INP54p中加入CD95L（DA4）后16和24小时，细胞凋亡显著减弱+BJAB电池（右侧面板）。同时，FynC-GFP中表面CD95下调+BJAB细胞在30分钟和60分钟时，但FynC-GFP-INP54p中这一点明显受损+BJAB细胞().
FynC-GFP-INP54p在BJAB细胞中的表达抑制CD95L诱导的凋亡，而与CD95寡聚程度无关。FynC-GFP-INP54p的表达抑制了可溶性和板结合交联Flag-CD95L或抗CD95单克隆抗体（CH-11）诱导的细胞凋亡和CD95下调补充图5A). 最后，FynC-GFP-INP54p的表达也抑制了使用与抗CD95单抗或Flag-CD95L共价偶联的微球对BJAB细胞的CD95激活补充图5B和数据未显示）。与激动性抗CD95单克隆抗体相反，用拮抗性抗CD95-mAb（ZB4）处理H9细胞未能诱导CD95内化补充图5C). 因此，与刺激方法无关，FynC-GFP-INP54p的表达抑制CD95内化和凋亡。此外，细胞凋亡依赖于用sCD95L或mCD95L处理的细胞中CD95的内化。
氯菊酯介导的内吞作用是CD95诱导细胞凋亡所必需的
我们的数据表明PIP的调节2INP54p水平通过阻断CD95的内化使细胞对CD95介导的凋亡产生抵抗。然而，PIP的调制2可能导致整体细胞变化，导致细胞通过受体内化以外的机制对CD95介导的凋亡产生抵抗。CD95被认为通过网格蛋白介导的内吞途径内化(Algeciras-Schimnich公司等, 2002). 为了专门干扰这种形式的受体内化，我们使用RNA干扰靶向AP-2适配器复合体和网格蛋白重链（CHC）蛋白的表达。CHC或AP-2特异性siRNA的转染（α±μ2)适配器亚单位导致其蛋白质表达水平显著降低(，2–6车道）(莫特利牌汽车等, 2003).
氯氰菊酯介导的内吞作用是CD95下调和细胞凋亡所必需的。(A类)CHC的分解，AP-2μ2和AP-2α使用BJAB细胞中的siRNAs。通过对指示蛋白的印迹来监测敲除效率。肌动蛋白的印迹被用作蛋白质负荷的控制（底部）。(B类)如（A）所述，将转染有指示siRNA的BJAB细胞与Flag-CD95L孵育30分钟，并通过流式细胞术评估表面CD95的表达。红色直方图显示细胞受到30分钟的刺激，而灰色阴影区域显示CD95的基础水平，而没有CD95L刺激。所示数据代表了三个实验。(C类)如（A）和（B）所述，将BJAB细胞在有（灰色）或无（白色）Flag-CD95L的情况下培养16 h，并用Annexin V和7-AAD染色定量凋亡细胞。所示数据代表了三个实验。(D类)CD95L诱导的FADD与CD95的关联被AP-2和CHC siRNA抑制。细胞转染对照组（1区和2区）、AP-2（3区）或CHC（4区）siRNA，用Flag-CD95L激活30分钟，用免疫沉淀CD95L–CD95复合物评估FADD与活化CD95的相关性。第5-7车道显示所有细胞中FADD和CD95的可比水平。(E类)CHC siRNAs抑制FADD和caspase-8与CD95的关联。BJAB细胞转染对照（1-4通道）和CHC（5-8通道）siRNA，并用Flag-CD95L激活指定时间。通过免疫沉淀法检测CD95L，免疫印迹法检测FADD、caspase-8和CD95，评估FADD和caspase-8与活化CD95的相关性。(F类)氯菊酯介导的内吞作用是CD95介导的PBT细胞凋亡所必需的。活化的人CD4+用AP-2（α+μ2)和GFP cDNA以监测表达效率。分类GFP你好在Flag-CD95L激活后（分别为30分钟和6小时），对细胞进行CD95下调（左）和凋亡（右）分析。红色直方图表示CD95L刺激的细胞，而灰色阴影区域表示未处理的细胞。%右侧对凋亡细胞进行了定量。所示数据代表了两个实验。
相应地，AP-2（α或μ2)单独导致CD95L诱导的表面CD95下调适度降低(，面板2和3）。AP-2（α和μ）的敲除2)亚基或CHC导致CD95下调的更大折衷（图4和图5）。最后，击倒两个AP-2（α+μ2)CHC对CD95下调的抑制最大，尽管表面CD95表达的基础水平也降低了（面板6）。
CD95下调中观察到的妥协程度与CD95L诱导的细胞凋亡程度直接相关。AP-2（α+μ2)或CHC分别导致CD95L诱导的细胞凋亡减少约50–80%，AP-2（α+μ2)和CHC siRNAs，在CD95L诱导的CD95下调中表现出最大的抑制作用，导致对CD95L诱发的细胞凋亡的完全保护().
有趣的是，转染AP-2（α+μ2)或CHC siRNA(，泳道3和4）。FADD相关性的缺乏严重降低了DISC的形成，因为在CHC-siRNAs转染细胞的CD95活化后5、15或30分钟，FADD和caspase-8均未与CD95共同免疫沉淀(). 这些结果表明受体内化在DISC组装中起作用。
最后，我们分析了CD95内化在CD95L诱导外周血T淋巴细胞（PBT）凋亡中的作用。通过CD3/CD28激活PBT，然后转染AP-2（α+μ2)和GFP，后者用于监测表达。GFP公司你好通过细胞分选纯化细胞，并分析CD95内化和凋亡。转染AP-2（α+μ2)PBT中的siRNA导致CD95L激活后CD95下调受到抑制(，左下面板）。相应地，这些细胞表现出CD95L诱导的凋亡受损(，右下面板）。总之，我们的数据表明，I型细胞和原代T淋巴细胞中CD95内化的抑制减弱了DISC成分向CD95受体的募集和凋亡。
CD95内部化后DISC组件的招募
为了直接追踪DISC组分向活化CD95的募集，并比较I型和II型细胞之间的受体信号，我们使用了一种新的方法来分离用于检测内化TNF受体及其信号组分的受体内含内化囊泡(施耐德-布拉赫等, 2004). 在这种方法中，细胞与生物素化抗CD95（抗APO-1）单克隆抗体孵育，然后添加链霉亲和素偶联磁性纳米粒子。内化后，在采用高梯度磁场的自由流动装置中使细胞均匀化并分离磁性囊泡。对含有受体的小泡进行Western blotting，以获取内胚体和溶酶体标记，以评估含有受体小泡的不同内吞成熟阶段。
与CD95在I型SKW6.4细胞中内化的能力相一致，Rab4和EEA-1是内质体运输的标记物，在刺激后很早就在CD95包含的小泡中检测到，并在10分钟达到峰值(). 组织蛋白酶D（CatD）的出现证明，含有CD95的小泡在3分钟时即已被检测到，在30分钟时达到峰值，这表明含有CD95受体小泡与含有CatD的溶酶体小室快速结合/融合。虽然在含有CD95的基底层膜结构中检测到低水平的FADD，但其在磁性囊泡中的出现在30分钟达到峰值。与FADD类似，caspase-8及其中间裂解产物在10分钟达到峰值，并可在刺激后3小时检测到（数据未显示），提示caspase-8的大部分激活发生在位于内胚体甚至溶酶体小泡的细胞内。在含有CD95的囊泡内也观察到胱天蛋白酶-10的类似缔合动力学。
CD95 DISC复合体的内化和内体成熟。SKW6.4细胞内CD95受体转运的时间进程(A类)和Jurkat(B类)单元格。分析抗APO-1mAb处理0、3、10、30和60分钟后衍生的总细胞裂解物或磁性组分的内体成熟标志蛋白（Rab4和EEA-1）、溶酶体（CatD）、肌动蛋白、CD95和DISC蛋白。注：在Jurkat细胞中装载两倍数量的裂解蛋白以可视化Rab4、EEA-1和CatD。ACHN细胞内CD95受体转运的时间进程(C类)和HCT15(D类)单元格。如A和B所述，分析抗APO-1单克隆抗体处理后获得的总细胞裂解物或磁性部分。
与I型SKW6.4细胞相比，在II型Jurkat细胞中未观察到Rab4、EEA-1或CatD的显著增加，表明CD95缺乏定向运动进入内胚小泡(). 与II型细胞中延迟和较少数量的DISC成分组装相一致，FADD、caspase-8和-10的检测水平低于I型细胞，检测时间较晚。
由于在I型SKW6.4和II型Jurkat细胞之间观察到的差异可能是由于II型细胞上CD95表达水平较低或仅限于淋巴细胞(黄等, 2000)，我们分析了表达CD95水平低于II型HCT15细胞的I型ACHN细胞(阿尔赫西拉斯Schimnich等, 2003). 在ACHN细胞中，在含有CD95的囊泡中检测到Rab4，且在5分钟时最大关联，表明受体内化已经开始(). EEA-1在5分钟出现，30分钟达到峰值，与内胚体小泡成熟一致。在5分钟时也检测到CatD，进一步增加到60分钟，表明CD95及其相关蛋白进入溶酶体室。对DISC组分的分析表明，FADD、caspase-8和-10以及caspase-8激活的招募在30分钟达到峰值，此时大多数受体已进入含EEA-1的隔间。与I型ACHN细胞相比，刺激II型HCT15细胞后，Rab4、EEA-1和CatD表现出轻微增加(). 此外，FADD、caspase-8和-10在60分钟时仅在CD95膜中微弱检测到。这些数据表明，在造血和非造血来源的I型细胞中，大多数DISC成分在内化到胞内/溶酶体室后被招募到CD95中。
CD95刺激后CD95、FADD和活性半胱天冬酶-8在内体上的定殖
为了补充生化研究，我们通过反卷积显微镜分析了未经处理和CD95L激活的BJAB细胞中FADD的亚细胞定位。对于FADD，已经描述了核染色和细胞质染色(佩雷斯和怀特，1998年;Gomez-Angelats和Cidlowski，2003年;斯克里顿等, 2003;奥莱利等, 2004). 在未经处理的BJAB和PBT中，基于与DAPI核染色的共定位，FADD优先在细胞核内检测到补充图6A面板1和面板4以及未显示的数据）。虽然在未经处理的细胞中EEA-1和FADD的染色重叠最小（第3组），但在CD95L激活后5分钟很容易检测到FADD和EEA-1的重叠（第7组）。亚细胞分馏研究证实了FADD在未经处理的BJAB细胞中的主要核定位以及CD95L处理的BYAB细胞的核和细胞质分布补充图6B). 相比之下，共聚焦和分馏研究表明未经处理和CD95刺激的Jurkat T细胞中FADD的核质分布没有变化补充图6C和D).
对未经处理和CD95-刺激的BJAB细胞中CD95和FADD定位的分析进一步支持了CD95L参与后它们在早期内体上的共定位。在未经处理的BJAB细胞中，CD95在PM处表达，而不是与FADD共同定位(，面板1-3）。CD95L刺激后2分钟内，CD95在PM处形成微聚集，FADD很容易在细胞质中检测到（图6-8）。CD95L作用后15分钟，当这些细胞中FADD与CD95的相关性最大时（参见)，在TfR中检测到CD95和FADD的显著共定位+早期内体室(，面板11–15）。类似地，在EEA-1中很容易检测到CD95和活化的胱天蛋白酶8的共定位+CD95L接合后15分钟内(、面板4-6和)与CD95受体的分析一致（参见).
CD95L刺激后早期内体CD95、FADD和活化caspase-8的结肠化。(A类)BJAB细胞用Cy5标记的转铁蛋白（蓝色）预孵育15分钟，不刺激或用Flag-CD95L刺激2或15分钟，然后固定并染色CD95（红色）或FADD（绿色）。反褶积分析中显示了单个和叠加荧光。所显示的数据代表了分析的200多个细胞。(B类)活化的caspase-8与内化的CD95共定位。用Flag-CD95L刺激BJAB细胞。固定细胞并对其进行CD95（左）、裂解（活性）caspase-8（中）或IgM染色。右侧显示了CD95（红色）、活性caspase-8（绿色）和IgM（蓝色）作为PM标记的合并图像（面板3、6和9）。所示数据代表分析的100多个细胞。(C类)活化caspase-8与EEA-1共定位+内体。用Flag-CD95L处理BJAB细胞15分钟后，固定并染色EEA-1（左）、活化caspase-8（中）或IgM。右侧显示了EEA-1（红色）、激活caspase-8（绿色）和IgM（蓝色）的合并图像（3和6）。(D类)用标记的CD95L刺激BJAB细胞。从总细胞膜提取物（通道1）中分离出PM（通道2-4）和内膜（通道5-7）组分。分馏后，通过FADD和caspase-8的免疫印迹分析FADD与caspase-8与活化的CD95–CD95L复合物的关联。血浆和膜内部分也进行免疫印迹，以检测IgM作为PM和EEA-1作为内体标记物。
内化后激活CD95的DISC成分的招募似乎与我们之前的报告相矛盾，该报告中FADD和caspase-8快速招募到激活CD95(基什克尔等, 1995). 然而，这些研究涉及细胞膜的洗涤剂溶解，导致细胞内隔间的破坏，并且不允许区分DISC成分向不同细胞膜的募集。因此，我们采用了一种生物化学方法，通过分析分离PM和胞内膜组分后CD95及其相关蛋白的亚细胞定位来保存细胞内膜室。使用BJAB细胞，CD95L激活导致PM组分内CD95数量的时间依赖性减少，这与内胚体组分内检测到的CD95伴随增加有关(). 在未经处理的BJAB细胞中，低水平的FADD与配体结合的CD95共同免疫沉淀，而在CD95L结合后，FADD或活化的caspase-8与PM-相关的CD95没有显著增加。相反，增加的FADD和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8与激活的CD95在内膜部分（5-7道）内共同免疫沉淀，动力学与这些细胞中观察到的CD95内化一致。
假定AP-2结合基序的突变破坏CD95内化和凋亡
CD95的细胞质结构域包含一个假定的蛋白质分类基序（Y291DTL），与一致的YXXΦAP-2结合序列一致(哦，不等, 1995). 类似于AP-2敲除研究中CD95内化的减少()与wt CD95相比，抗CD95单克隆抗体（CH-11）治疗后，突变CD95的内化作用减弱，其中Tyr 291被转变为苯丙氨酸(). 同时，CD95（Y291F）表达细胞在抗CD95单克隆抗体（CH-11）治疗后发生凋亡的能力也同样降低(、下部两个面板和). 由于该酪氨酸残基定位于FADD DD内，我们分析了体外FADD的DD与wt CD95或CD95（Y291F）的细胞内结构域（ICD）相互作用的能力。来自wt或Y291F的ICD同样能够结合体外翻译的FADD(). 相反，DD合并了液化石油气cg公司小鼠未结合FADD(马丁等, 1999). 因此，CD95共识AP-2结合基序内的Tyr 291突变损害了CD95L介导的内化和凋亡，但不影响其与FADD潜在相互作用的能力。总之，我们利用生物化学、遗传和成像方法进行的研究表明，CD95内化是有效DISC组装和激活促凋亡途径所必需的。
CD95的内化突变体（Y291F）在CD95L介导的凋亡中受到损害。(A类)用wt人（h）CD95或hCD95（Y291F）转染A20细胞。在0分钟（灰色阴影区）、15分钟（绿色）和30分钟（红色）激活抗hCD95（CH11）后，分析细胞CD95下调情况(B类)用wt-hCD95或hCD95（Y291F）转染A20细胞。在抗hCD95（CH11）激活16 h后，使用AnnexinV/7-AAD分析细胞凋亡。所示数据是三个实验的代表性数据。(C类)用wt-hCD95或hCD95（Y291F）转染A20细胞。%在与抗hCD95（CH11）单克隆抗体孵育5和16小时后，对凋亡细胞进行定量(D类)CD95（Y291F）可以绑定FADD体外. The体外wt CD95（通道1）、内化突变CD95（Y291F）（通道2）或相应hCD95突变（V254N）的翻译ICD液化石油气cg公司将融合到FLAG表位的小鼠（第3通道）与生物素化的FADD DD孵育。使用抗FLAG单克隆抗体偶联珠免疫沉淀FLAG-CD95-bound FADD，并通过杂交分析FADD和FLAG。使用标记的GFP作为对照蛋白（通道4）。
CD95介导的独立于CD95内化的信号转导
CD95参与CD95耐药肿瘤细胞或经sCD95L治疗的CD95凋亡敏感性I型肿瘤细胞已被证明激活非凋亡信号通路，包括Erk和NF-κB(安等, 2001;秦等, 2002;巴恩哈特等, 2004). 虽然我们的数据表明，I型细胞中的受体内化是激活促凋亡通路所必需的，但我们检查了CD95L诱导的非凋亡信号通路中受体内化的要求：Erk1/2磷酸化和NF-κB转录激活。用对照siRNAs转染并用Flag-CD95L处理的细胞没有表现出明显的Erk1/2激活(，车道1-3）。相比之下，转染AP-2（α+μ2)或CHC siRNAs显示CD95L诱导的Erk1/2激活（5-7和9-11通道）。转染FynC-GFP-INP54p的BJAB细胞也诱导了NF-κB反应性荧光素酶报告子的剂量依赖性增加，而转染FynC-GFP对照的细胞没有NFκB响应，因为所有细胞在CD95L刺激后都发生了凋亡(和数据未显示）。在这两个实验系统中，当细胞通过B细胞抗原受体或佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐（PMA）刺激时，Erk和NF-κB反应保持完整。内化缺陷CD95（Y291F）突变体的交联也诱导Erk活化，甚至比wt受体更有效().
CD95L介导的内化依赖性信号。(A类)转染AP-2（α+μ2)或CHC siRNAs。转染对照AP-2（α+μ2)或CHC siRNA，与Flag-CD95L或抗IgM Fab孵育指定时间2'持续5分钟。分析细胞裂解液中磷酸化Erk1/2（顶部）或总Erk1/2（底部）的表达。所示数据代表了两个实验。(B类)FynC-GFP-INP54p中NF-κB转录的激活+细胞。分析转染FynC-GFP-INP54p的BJAB细胞在Flag-CD95L、PMA或BCR刺激后NF-κB的转录激活。这些数据代表了两个实验。(C类)CD95（Y291F）激活Erk信号通路。转染wt CD95或CD95（Y291F）的A20细胞与抗hCD95单克隆抗体（CH11）孵育指定时间。分析细胞裂解物的磷酸-Erk1/2（顶部）或总Erk1/2（底部）表达。用PMA处理细胞作为阳性对照。
据报道，抗APO-1单克隆抗体的同型开关变体表现出明显不同的细胞活性(戴因等, 1992;欧姆等, 1992). 虽然广泛使用的IgG3抗APO-1单克隆抗体诱导I型SKW6.4和H9细胞凋亡，但与CD95具有相同特异性和亲和力的IgG2b开关变体不诱导凋亡(戴因等, 1992;补充图7A). 与IgG3骨架通过Fc–Fc相互作用自聚集以诱导细胞毒性的能力一致，IgG2b抗APO-1单克隆抗体与蛋白A的额外交联导致细胞凋亡补充图7A). 虽然IgG3抗APO-1单克隆抗体能快速诱导CD95的覆盖、聚集和内化，但非凋亡性IgG2b抗APO-1mAb不能诱导CD95覆盖或内化()尽管IgG2b抗APO-1能够将CD95染色为与所述信号蛋白寡聚结构（SPOTS）一致的小表面结构(Muppidi和Siegel，2004年;西格尔等, 2004). 此外，IgG3，而不是IgG2b，抗APO-1单克隆抗体诱导I型SKW6.4和H9细胞中DISC的形成(，1-8车道）。因此，抗APO-1单克隆抗体诱导DISC组装和凋亡的能力与抗APO-1mAb诱导CD95内化的能力相关。
通过不诱导CD95内化或凋亡的抗APO-1 IgG2b激活非凋亡信号。(A类)刺激1小时后，通过荧光显微镜分析FITC缀合的IgG3（左两幅图）和IgG2b（右两幅图）抗APO-1单克隆抗体对SKW6.4细胞中CD95聚集的影响。(B类)用IgG3或IgG2b抗APO-1单克隆抗体在37°C下处理SKW6.4细胞1小时。在抗体处理1小时后，定量内吞CD95的细胞数量。实验分三次进行，显示为μ±标准差(C类)用IgG3（1、2、5、6、9和10道）或IgG2b（3、4、7、8、11和12道）抗APO-1单克隆抗体处理SKW6.4、H9或MCF7（FV）细胞。活化的CD95分子被免疫沉淀，并通过免疫印迹分析CD95（C20）、caspase-8和FADD。(D类)MCF7（FV）细胞的EMSA分析32携带NF-κB结合位点的P标记寡核苷酸，用1μg/ml IgG2b抗APO-1刺激指定时间。p50/p65表示NF-κB异二聚体的迁移。(E类)用1μg/ml IgG2b抗APO-1刺激MCF7（FV）细胞指定时间后，通过Western blotting分析pErk和总Erk。(F类)MCF7（FB）细胞经对照（ctr）、LzCD95L或IgG2b抗APO-1单克隆抗体处理后，用体外运动性（左）或侵袭性（右）分析。
我们进一步分析了CD95在受到IgG2b和IgG3抗APO-1单克隆抗体刺激时是否能够激活非凋亡途径。MCF7（FV）和MCF7(斯图等, 2002). 磁性内化囊泡的分离表明，被IgG3抗APO-1 mAb激活的MCF7（FV）细胞最大限度地募集DISC成分，与内体EEA-1和Rab4标记物的存在一致补充图7B). 类似地，在CD95刺激60分钟后检测到caspase-8的最大处理，再次符合受体内吞对促凋亡信号通路激活的要求。与两种同型抗APO-1单克隆抗体诱导MCF7（FV）细胞凋亡的不同能力相一致，促凋亡的IgG3抗APO-1mAb有效地诱导了DISC组装，而非凋亡IgG2b抗APO-1mAb未检测到DISC组装(，9–12车道）。然而，用非内化IgG2b抗APO-1单克隆抗体治疗MCF7（FV）可诱导NF-κB和Erk活化(). 用IgG2b抗APO-1单克隆抗体处理的ACHN和MCF7（FB）细胞也观察到类似的数据（数据未显示）。最后，我们测试了CD95L和非凋亡抗APO-1调节细胞运动和侵袭性的能力。两种CD95刺激均增强体外使用MCF7（FB）细胞的细胞运动性和侵袭性(). 因此，通过非内化诱导刺激发出的信号可以激活多种信号通路，从而增强致瘤潜能，而CD95的内化只需要用于凋亡信号。
讨论
CD95L诱导I型细胞凋亡需要受体内化
DISC的形成是通过CD95启动凋亡诱导的关键步骤(克雷梅斯蒂等, 2001;格拉斯姆等, 2001;Algeciras-Schimnich公司等, 2002). 在本报告中，我们利用六种不同的实验方法证明了受体内吞在DISC组装中的意外作用以及在I型细胞CD95信号转导中的凋亡。第一种策略涉及选择性调节PIP2损害CD95内化的水平。第二种策略利用针对网格蛋白内吞机制的siRNA。第三个涉及抗APO-1单克隆抗体不同开关异构体的一致性，以诱导CD95内化、DISC形成和凋亡。第四个涉及CD95细胞质域中的选择性内化突变。第五项利用一种新技术直接跟踪含有CD95的内化受体体，第六项涉及亚细胞分级研究，所有这些研究都表明，DISC组装主要发生在CD95内化并进入早期内体区室之后。此外，激活细胞的共焦显微镜显示，CD95与FADD和激活的caspase-8在EEA-1上共定位+隔间。虽然DISC组装的启动可能发生在受体内化之前和/或独立于受体内化，但这些数据支持CD95内化在DISC组分的高效组装、caspase-8和-3的激活以及诱导I型细胞（而非II型细胞）的细胞凋亡方面发挥重要作用。因此，I型细胞中的CD95内化发挥了必要的积极作用，而不是失活作用，否则会对注定要凋亡的细胞产生生物反作用。
最近的一项研究表明，活化的TNF-R1与FADD、TRADD和caspase-8复合物的组装也依赖于受体内吞作用(Schneider Brachert公司等, 2004). 内化缺陷的TNF受体虽然能够在PM处招募RIP1和TRAF2，但不能启动DISC形成并诱导凋亡(施耐德-布拉赫等, 2004). 我们的研究现在为直接招募FADD的死亡受体亚群（包括CD95、DR4和DR5）的一个成员提供了第一个证据，即膜动力学的时空调节和受体的内化在定义细胞命运中起着关键的调节作用。
受体内化与膜结合CD95L
我们的研究还证明了mCD95L诱导的细胞凋亡中CD95内化的必要性。wt mCD95和mCD95L（DA4）突变体以及共价结合的抗CD95单克隆抗体在BJAB和SKW6.4细胞中诱导CD95内化并激活凋亡的能力支持了这样一种观点，即CD95必须经历配体或激动性单克隆抗体结合诱导的一些生物物理变化。受体连接导致受体交联后几秒钟内迅速形成CD95的高阶聚集体(基什克尔等, 1995). 高分辨率共聚焦显微镜和活细胞成像最近揭示了受体结合后在PM处形成更有序的CD95低聚物，称为SPOTS，这一过程依赖于FADD的结合，但不依赖于胱天蛋白酶的激活(西格尔等, 2004). 此外，生物化学研究表明，CD95在受体激活后被进一步招募到筏膜部分，这一过程独立于其DD和DISC的形成(埃拉莫等, 2004) (). 因此，CD95L结合诱导CD95的空间和构象改变，从而允许受体齐聚、SPOT形成和定位于脂筏内。我们的研究定义了寡聚CD95诱导细胞凋亡的另一个要求：通过甲氰菊酯介导的途径内化并传递到早期内胚小室以实现有效的DISC组装和扩增().
早期CD95信号模型。一、 配体依赖性受体预结合。二、 微集料的形成被检测为SDS稳定集料和低水平DISC形成。结果表明，表达鞘磷脂合成酶1的细胞形成SDS稳定聚集体的效率高于SMS阴性细胞(宫主等, 2005)表明神经酰胺虽然对CD95信号传导不是必需的，但却是CD95介导的凋亡的一般增强剂。三、 将CD95招募到脂筏中形成SPOTS。四、 受体聚集也称为大脂筏平台的加盖和形成。这一步骤取决于DISC产生活性caspase-8，可以通过使用zVAD-fmk或zIETD-fmk预培养细胞来有效防止。在缺乏内化的情况下，步骤2-4的信号有可能激活非凋亡途径，但不足以杀死I型细胞。五、 激活受体的内化。六、 内化CD95迁移到内胚体室并进一步招募DISC成分。这一步骤依赖于肌动蛋白丝，因为它可以被latrunculin A（LtnA）抑制。此步骤还需要PIP2它是由氯氰菊酯介导的，因为它被INP54p的过度表达或CHC或AP-2的下调所抑制。在mCD95L诱导细胞凋亡的情况下，我们假设配体诱导的活化CD95复合物内化不再包含配体。DISC成分是FADD/Mort1、胱天蛋白酶-8、胱天蛋白酶-10和c-FLIP（未显示）。蓝色区域，DED；红区，DD；CD95中的N端PLAD以不同的绿色显示。
内体在CD95与FADD相关性中的潜在作用
内体内的内部化CD95似乎也提供了一个定位信号来集中FADD。在缺乏CD95内化的情况下，FADD仍处于弥漫性细胞质模式，并在EEA-1内表现出显著降低的定位+早期内体室（数据未显示）。因此，内体上的DISC组装或扩增可能提供额外的时间和空间调节，以将激活的DISC传递到下游效应器。细胞内激活caspase-8的要求与之前的一项研究一致，该研究发现，在PM处生成并连接到PM上的活性caspase 8不会杀死细胞(马丁等, 1998).
最近关于多种受体的证据支持内体在控制信号转导中的作用。在EGF受体的情况下，Grb2和活化的Ras不仅在PM上共定位，而且在EGF刺激后也在内体上共定位(迪古列尔莫等, 1994). 此外，小亚细胞适配器蛋白超家族（ProfIAP）的p14和MP1成员优先定位于晚期内体，并与MEK1/2复合以促进Erk1/2的激活(文德利希等, 2001;泰斯等, 2002). 最后，定位于内体亚群中的APPL（包含PH域、PTB域和亮氨酸拉链基序的衔接蛋白）Rab5效应蛋白将EGF和氧化应激信号与染色质重塑和基因转录调控联系起来(米亚琴斯卡等，2004年a). 除EGFR外，TNF-R1相关DISC复合物的靶向性反式-高尔基体小泡最近被证明能激活内溶酶体酸性，但不能激活PM定位的中性鞘磷脂酶(施耐德-布拉赫等, 2004). 因此，内体局部信号复合物似乎提供了一个亚细胞巢，用于信号放大和路由到相应的下游效应器。
CD95信号的分区在定义细胞结果中很重要
我们的研究还表明，CD95内化能力的改变对CD95活化细胞的细胞命运具有深远的影响。无法内化CD95的细胞通过表达FynC-GFP-INP54p、下调氯氰菊酯AP-2/CHC内吞机制或通过使用非凋亡抗CD95单克隆抗体诱导NF-κB转录激活和Erk1/2激活CD95结合。因此，其他类型的信号可能独立于受体内部化而发生。CD95L激活非凋亡信号通路，包括MAPK和NF-κB信号通路，被认为在CD95耐药肿瘤的发生中发挥作用(安等, 2001;巴恩哈特等, 2004;彼得等, 2005). 事实上，用抗APO-1单克隆抗体或可溶性CD95L治疗CD95L耐药的MCF7（FB）细胞可增加肿瘤细胞的运动性和侵袭性。因此，CD95膜定位和内化的动力学在平衡内化依赖的凋亡和内化依赖性非凋亡途径以分别驱动细胞凋亡和其他功能方面起着关键作用。
TNF-R1的膜动力学也被证明在确定TNFR激活的细胞命运方面起着关键作用。TNF-R1诱导的凋亡涉及序列信号复合物。第一种涉及组装涉及TNF-R1、TRADD、RIP1和TRAF2（复合物1）的脂筏放大复合物，并在泛素化和TNF-R1-复合物降解之前介导NF-κB活化(莱格勒等, 2003;Micheau和Tschopp，2003年). 复合物1经历了前定义的修饰，使得先前与TNF-R1结合的TRADD和RIP1的DD可以与其他含DD的蛋白质相互作用。FADD和caspase-8向这种修饰的细胞质复合体的募集启动了细胞凋亡机制（复合体2）(Micheau和Tschopp，2003年). 复合物2在细胞内形成，不含受体。然而，最近追踪含受体的内化囊泡的研究表明，DISC仍然与内化的TNF-R1结合，形成内体“致命的囊泡”(施耐德-布拉赫等, 2004). 对于CD95，CD95L刺激诱导细胞表面低水平DISC的形成，随后整个复合物内化(). 在I型细胞中，这一内化步骤触发了大量信号蛋白FADD和caspase-8向执行凋亡的内体上激活的受体募集。
总之，我们的研究结果为受体信号的亚细胞定位在确定细胞命运中发挥重要作用的观点提供了支持。在CD95的情况下，受体内化通过体内信号通路传递激活的受体，使细胞产生促凋亡结果。相反，抑制受体内化使激活的受体能够参与生物化学途径，从而诱导生前途径。这些动力学不仅对理解CD95生物学至关重要，而且可能对理解影响受体贩运的化疗药物与新出现的促凋亡治疗在癌症治疗中的作用具有重要意义。
