《维罗尔杂志》。2003年1月；77(2): 1141–1148.
牛副流感病毒3型在恒河猴体内复制的宿主范围限制因素是多基因的
,1,* ,1 ,1 ,1 ,2 ,三 ,1和1
马里奥·斯基亚多普洛斯
呼吸道病毒科，1马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所传染病实验室实验灵长类病毒学科，邮编：20892，2Bioqual Inc.，马里兰州罗克维尔，邮编：20850三
亚历山大·C·施密特
呼吸道病毒科，1马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所传染病实验室实验灵长类病毒学科，邮编：20892，2Bioqual公司，马里兰州罗克维尔，邮编：20850三
杰弗里·里格斯
呼吸道病毒科，1马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所传染病实验室实验灵长类病毒学科，邮编：20892，2Bioqual Inc.，马里兰州罗克维尔，邮编：20850三
索尼娅·苏尔曼
呼吸道病毒科，1马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所传染病实验室实验灵长类病毒学科，邮编：20892，2Bioqual Inc.，马里兰州罗克维尔，邮编：20850三
威廉·埃尔金斯
呼吸道病毒科，1马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所传染病实验室实验灵长类病毒学科，邮编：20892，2Bioqual公司，马里兰州罗克维尔，邮编：20850三
玛丽莎·圣克莱尔
呼吸道病毒科，1马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所传染病实验室实验灵长类病毒学科，邮编：20892，2Bioqual Inc.，马里兰州罗克维尔，邮编：20850三
彼得·柯林斯
呼吸道病毒科，1马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所传染病实验室实验灵长类病毒学科，邮编：20892，2Bioqual Inc.，马里兰州罗克维尔，邮编：20850三
布莱恩·墨菲
呼吸道病毒科，1马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所传染病实验室实验灵长类病毒学科，邮编：20892，2Bioqual Inc.，马里兰州罗克维尔，邮编：20850三
呼吸道病毒科，1马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所传染病实验室实验灵长类病毒学科，邮编：20892，2Bioqual Inc.，马里兰州罗克维尔，邮编：20850三
收稿日期：2002年7月19日；2002年10月7日接受。
摘要
堪萨斯牛副流感病毒3型（BPIV3）毒株在非人灵长类动物呼吸道中的复制受到限制，是人类PIV3（HPIV3）的100到1000倍，PIV3是婴幼儿的一种重要病原体。BPIV3在人类婴儿和儿童中的复制也受到限制，但它具有免疫原性，目前正在临床试验中作为疫苗候选进行评估，以防止HPIV3引起的疾病。我们通过将重组野生型HPIV3的每个开放阅读框（ORF）与BPIV3中的类似ORF进行交换，检查了BPIV3宿主范围衰减表型的遗传基础，并注意到P基因的多个ORF作为单个单位进行交换，HN和F基因作为单个单位交换。从cDNA中回收重组嵌合牛-人PIV3，并测定病毒在体外和恒河猴呼吸道中的复制水平。携带BPIV3 N或P ORF的重组嵌合HPIV3在猴子的上呼吸道和下呼吸道中高度衰减，而携带BPIV3M或L ORF或F和HN基因的嵌合HPVI3仅中度衰减。这表明灵长类BPIV3复制宿主范围限制的遗传决定因素是多基因的，主要决定因素是N和P ORF。用这些牛-人嵌合病毒（包括高度减毒的病毒）免疫的猴子比用BPIV3免疫的猴子产生更高水平的HPIV3血凝抑制血清抗体，并免受野生型HPIV3的攻击。此外，宿主范围决定因素可以与衰减点突变相结合，以提高衰减水平。因此，在恒河猴中表现出不同程度衰减的嵌合重组牛-人PIV3病毒可作为候选疫苗进行评估，以保护婴儿免受HPIV3引起的严重下呼吸道疾病的影响。
人类副流感病毒3型（HPIV3）及其动物对应物牛PIV3（BPIV3）是一种被包裹的非片段负链RNA病毒属呼吸道病毒在家里副粘病毒科(4,26). HPIV3是婴儿呼吸道疾病的常见原因(8,28)目前还没有获得许可的疫苗。HPIV3和BPIV3具有中到高水平的核苷酸和氨基酸序列同源性(2)并且通过交叉中和研究具有25%的抗原相关性(6). 堪萨斯BPIV3毒株在人类和非人类灵长类动物的呼吸道中复制受到限制(6,23)并被评估为候选疫苗，以预防由HPIV3感染婴幼儿引起的严重下呼吸道疾病(22-24,27).
BPIV3和HPIV3具有相同的基因组组织(4)编码来自6个相邻基因的9个蛋白质。这九种蛋白质包括三种核衣壳相关蛋白，即核蛋白（N）、磷酸蛋白（P）和大聚合酶蛋白（L），它们构成核衣壳复合体和相关聚合酶；一种内部基质蛋白（M）；融合蛋白（F）和血凝素-神经氨酸酶（HN）包膜糖蛋白。P基因还通过使用辅助蛋白C的替代阅读框或通过伪模板核苷酸插入（RNA编辑）编码三个额外的多肽，以生成辅助V和D多肽。与其他副流感病毒类似，一种或多种HPIV3辅助蛋白可能参与病毒RNA合成的调节，并作为宿主抗病毒干扰素反应的拮抗剂发挥作用(15).
而顺式-两种病毒的作用转录和复制控制区高度保守，两种病毒同源蛋白之间的氨基酸序列同源性从P蛋白的约59%到M蛋白的90%不等(2). 因此，灵长类BPIV3衰减表型的宿主范围决定因素可能由一个或多个BPIV3开放阅读框（ORF）编码，而不是由高度保守的顺式-执行监管序列。此前，BPIV3的N ORF被证明在取代HPIV3中的类似ORF时具有高水平的衰减(1)，并且当在HPIV3中取代它们的F和HN对应物时，BPIV3的F和HN基因显示出中等程度的衰减(34). 在本研究中，我们扩展了这些观察结果，以表明当取代HPIV3基因组中的同源HPIV3 ORF时，P以及较小程度上的M和L ORF也可以产生衰减，这表明BPIV3的宿主范围衰减表型是多基因的。
材料和方法
携带ORF替代物的HPIV3感染性cDNA的构建。
通过PCR或定点突变在BPIV3和HPIV3 N、P、M或L ORF cDNA的翻译起始和终止密码子处引入独特的限制性位点。利用标准分子克隆技术，通过引入的独特限制性位点交换每个结构的ORF。如有必要，对ORF终止密码子之后的唯一限制性位点的位置进行调整，以便与ORF一起转移的终止密码子后面的核苷酸（nt）数量保持每个嵌合基因组长度为6的倍数(25). 在ORF替换之后，每个ORF开始周围的核苷酸序列被进一步修改，以便替换的ORF序列和ORF上游的序列被改回每个野生型亲本的序列。ORF结束后引入的唯一限制位点没有进一步修改。N ORF交换已在前面进行了描述(1). 通过使用分别引入M和HN下游非编码区的独特限制性位点，将F和HN基因替换为单个限制性片段(34).
从cDNA中回收病毒并对病毒RNA（vRNA）进行测序。
从每个携带BPIV3 ORF取代的全长HPIV3抗原组cDNA中回收rHPIV3（图。)如前所述，通过与PIV3支持质粒共转染和与MVA-T7痘苗病毒重组物（琳达·怀亚特和伯尼·莫斯的慷慨馈赠）共感染HEp-2细胞(12,34). 如前所述，通过在LLC-MK2单层膜上进行斑块纯化，对rHPIV3进行生物克隆，并在LLC-NK2细胞上进一步增殖(36).
具有BPIV3 ORF取代的重组HPIV3及其亲本HPIV3野生型和BPIV3堪萨斯病毒的基因组结构示意图（非按比例）。BPIV3序列用阴影区（□）表示，HPIV3序列由透明区（□(2). ▿, rHPIV3-L中T1711I点突变的相对位置BT1711I型.
为了确认每个嵌合重组体的特性和结构，从每个生物克隆病毒中分离vRNA，如前所述(36)并用作逆转录PCR（RT-PCR）的模板来扩增感兴趣区域。因此，产生了一个含有取代ORF的RT-PCR片段，其两侧是HPIV3主干序列，并通过限制性内切酶消化和DNA测序对扩增产物进行分析，以确认其结构(36).
体外复制rHPIV3。
在LLC-MK2细胞中测定野生型和嵌合型rHPIV3s的多周期生长动力学。每种测试的病毒以0.01的感染倍数（MOI）接种在六孔板中的LLC-MK2单层中，一式三份，培养物在32°C下培养。从每个孔中采集培养基（0.5 ml），并在感染后5天内，在0小时和24小时间隔用0.5 ml新鲜培养基替换。为了测定体外复制的温度敏感性，病毒滴度（TCID50/ml）在32°C和35至40°C的分级温度下通过上述LLC-MK2单层培养物上的滴定测定。
灵长类动物研究。
恒河猴(猕猴)同时通过鼻内（i.n.）和气管内（i.t.）途径接种对HPIV3血清血凝抑制（HAI）抗体呈阴性的人，每1 ml含有105TCID公司50病毒，如前所述(1,34). 在感染后第1天到第10天采集鼻咽拭子样本，在感染后的第2、4、6、8和10天采集气管灌洗（TL）样本。如前所述，通过在32°C下滴定LLC-MK2细胞单层，对NP和TL样本中存在的病毒进行定量(1,34)，获得的平均峰值病毒滴度表示为log10TCID公司50/毫升。对恒河猴进行静脉注射和静脉注射，每次1ml，含106TCID公司50在免疫后28天或31天对野生型JS株HPIV3进行检测，并在攻击后第2、4、6和8天采集NP和TL样本。样品中的HPIV3按上述方法进行定量。如前所述，在免疫前（第0天）、免疫后（第28天或31天）和激发后（第56天或59天）采集血清样本，并进行分析以确定抗HPIV3的HAI抗体滴度(11,39). 对于某些组，所提供的数据包括从之前的两项研究中收集的数据(1,34). 本研究和先前研究中的动物组感染了相同的病毒制剂，并使用类似的程序收集和定量样本。
结果
用BPIV3 ORF替代物回收rHPIV3。
堪萨斯BPIV3毒株在人类和其他灵长类动物的呼吸道中复制受到限制。为了确定灵长类BPIV3宿主范围衰减表型的遗传决定因素，修改了HPIV3的抗原cDNA，以包含BPIV3的N、P、M或L ORF，代替类似的HPIV3 ORF（图。). 此外，如前所述，将F和HN基因作为一对转移到一起，以替换其HPIV3对应物(34).
包含N、P、M、F和HN或L ORF的嵌合牛-人PIV3（图。)从cDNA中回收。其中两个之前已经描述过，即rHPIV3-FB海南B(34)和cKa-N（此处称为rHPIV3-NB) (1). 通过斑块分离对重组嵌合病毒进行生物克隆，并从克隆的病毒中分离vRNA，并将其用作产生RT-PCR产物的模板。通过测序和限制性内切酶分析，确认了每个重组病毒替换ORF侧翼的基因组结构。
两种重组病毒，rHPIV3-LBT1711I型和rHPIV3-LB（图。)，产生了BPIV3 L ORF。rHPIV3-L型BT1711I型首先生成，但在体外复制中发现其对温度高度敏感（见下文）后，对其进行测序，发现其在L ORF中包含两个点突变，导致Ala-425-to-Val（A425V）和Thr-1711-to-Ile取代（T1711I）。后一种突变出现在抗原cDNA中，但前者是该cDNA转染后发生的自发突变。产生了另一个重组体（rHPIV3-LB)具有真实的BPIV3 L ORF序列。
回收每个嵌合重组牛-人病毒的能力表明，取代的BPIV3蛋白与HPIV3蛋白以及与顺式-HPIV3基因组的作用序列。
嵌合rHPIV3的体外复制。
对于每一种嵌合病毒，存在这样的可能性：被取代的BPIV3蛋白可能与编码的蛋白和顺式-HPIV3主干的作用序列。如果存在这种部分不相容性，则应表现为嵌合病毒在LLC-MK2等细胞系中的复制减少，这对双亲病毒都是允许的。
因此，通过以0.01的MOI感染LLC-MK2细胞并每隔24小时测量病毒产量，将每个嵌合rHPIV3在体外的复制动力学与其野生型rHPIV2和BPIV3亲本病毒的复制动力学进行比较。rHPIV3-L除外BT1711I型，所有带有BPIV3 ORF替代物的嵌合rHPIV3的生长速度与它们的亲本病毒相似（图。)所有嵌合病毒都增长到10以上7TCID公司50/感染后第5天ml。这证实了每一个取代的野生型BPIV3蛋白都与这些蛋白和顺式-HPIV3主干的动作信号。相反，rHPIV3-L的复制受到限制B T1711I型体外实验表明其BPIV3 L聚合酶蛋白中的一个或两个氨基酸替换在体外减弱。
嵌合rHPIV3的多步生长曲线。LLC-MK2单分子膜以0.01的MOI感染三倍于所示PIV3的细胞，并在32°C下培养。每隔24小时收集等分培养基上清液，并在32°C下在LLC-MK2单层上量化病毒滴度。
嵌合病毒在允许和限制温度下的复制。
一个或多个被取代的BPIV3蛋白可能与HPIV3骨架中的一个蛋白有轻微的不相容性，该蛋白在32°C下无法检测到，但在高温下可能会变得明显。还需要进一步表征突变体rHPIV3-L所表现出的限制复制B T1711I型病毒（图。). 为了确定每个rHPIV3中的ORF替换是否改变了这些病毒在高温下的生长能力，将每个嵌合rHPIV2的复制温度敏感性水平与亲本病毒和rHPIV4的复制温度敏感水平进行了比较内容提供商45，这是一个很好的特征ts秒以及之前证明在人类和非人类灵长类动物中具有适当减毒和免疫原性的减毒候选HPIV3疫苗(19,20,24). 评估野生型和嵌合型rHPIV3在32°C的允许温度和更高温度范围内在LLC-MK2细胞上生长的能力（表). 令人惊讶的是，rHPIV3-LB和rHPIV3-LB T1711I型高度重视ts秒，带有rHPIV3-LB T1711I型更多ts秒比rHPIV3-LB或rHPIV3内容提供商45.如上所述，rHPIV3-L中存在BPIV3 L ORFB T1711I型该病毒含有两个与野生型BPIV3相关的氨基酸编码改变，因此有兴趣确定哪一个或两个是导致这种增加的原因ts秒rHPIV3-L的表型B T1711I型与rHPIV3-L相比B.rHPIV3-L的另一种病毒克隆B T1711I型已确定包含T1711I替代，但不包含A425V突变。这种病毒的关闭温度与rHPIV3-L相同B T1711I型（数据未显示），表明仅T1711I突变是rHPIV3-L温度敏感性水平升高的原因B T1711I型.
表1。
| 病毒 | 平均滴度（log10TCID公司50/ml）在32°C时 | 平均对数10指示温度下病毒滴度降低（°C）
|
|---|
| 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 |
|---|
| BPIV3堪萨斯州 | 8.7 | 0 | 0.1 | 0.2 | 0.8 | 1.1 | 1.3 |
| rHPIV3重量 | 8.6 | 0.3 | −0.2 | 0.1 | 0.3 | 0.4 | 0.5 |
| rHPIV3-N型B | 8.5 | —b条 | — | — | 0.5 | 0.5 | 0.4 |
| rHPIV3-P型B | 7.8 | — | — | — | 1 | 1.2 | 1.3 |
| rHPIV3-M型B | 8 | — | — | — | 0.4 | 1.5 | 2.1 |
| rHPIV3-F型B海南B | 8.2 | — | — | — | 0.5 | 0.6 | 0.7 |
| rHPIV3-L型B | 8 | 0 | 0.4 | 1.5 | 3.7 | 4.6 | 4.1 |
| rHPIV3-L型B（T1711I） | 7 | 1.6 | 1.4 | 4.2 | ≥5.3 | ≥5.6 | ≥5.7 |
| rHPIV3型内容提供商45 | 7.8 | 0.9 | 1.3 | 2.2 | 3 | ≥6.4 | ≥6.4 |
将BPIV3 ORF引入野生型HPIV3中可以减弱恒河猴的rHPIV3。
为了确定每种ORF或基因替代对嵌合rHPIV3在恒河猴上下呼吸道复制能力的影响，对恒河猴分别进行静脉注射和静脉注射，剂量为105TCID公司50每个站点。将嵌合病毒的复制水平与野生型rHPIV3和BPIV3亲本病毒进行比较。在10天的时间里，在恒河猴的上呼吸道和下呼吸道中测定了每种病毒的复制动力学（图。). 这表示为平均峰值滴度，表示病毒脱落的峰值滴度；表示为每日滴度总和的平均值，表示10天期间病毒载量的比较（表). NP标本的平均滴度总和通常高于TL标本，因为NP标本是每天采集的，而TL标本是每隔一天采集的。
含有BPIV3 ORF替代物的嵌合rHPIV3的平均每日病毒滴度。显示了感染父母或嵌合HPIV3的每组猴子的平均每日NP拭子（A）和TL（B）病毒滴度。每组猴子的数量如表所示计算各组每天的平均病毒滴度。一些数据来自以前的动物研究(1,34)（表).
表2。
嵌合牛-人PIV3在恒河猴体内的复制水平、免疫原性和效力
| 免疫病毒一 | 组大小b条 | PIV3滴度平均峰值（log10TCID公司50/ml±SE）c（c）
| 日滴度总和的平均值（log10TCID公司50/ml±SE）d日
| 免疫后血清HPIV3 HAI抗体滴度e（电子） | 平均峰值挑战HPIV3滴度（log10TCID公司50/ml）至（f）:
| 激发后血清HPIV3 HAI抗体克
|
|---|
| NP公司 | TL公司 | NP公司 | TL公司 | NP公司 | TL公司 | 滴定 | 组大小 |
|---|
| rHPIV3重量 | 12 | 4.2 ± 0.4 | 3.5 ± 0.3 | 21.2±1.7安 | 10.5 ± 1.1 | 8.6±0.4 | 1.4 ± 0.3 | 1.1 ± 0.2 | 11.5±0.3 | 6 |
| rHPIV3-L型B | 4 | 3.0 ± 0.8 | 3.5 ± 0.2 | 11.8±2.4 B、C、D | 10.5 ± 1.0 | 10.3 ± 0.5 | 0.9 ± 0.2 | 1.5 ± 0.1 | 10.8 ± 0.6 | 4 |
| rHPIV3-M型B | 4 | 3.0 ± 0.6 | 3.4 ± 0.6 | 16.6±3.7 A，B | 11.8±2.3 | 7.8 ± 0.9 | 1.4 ± 0.9 | 1.2 ± 0.4 | 11.0 ± 0.4 | 4 |
| rHPIV3-F型B海南B | 6 | 2.7 ± 0.2 | 2.7 ± 0.4 | 13.5±0.9摄氏度 | 9.1 ± 2.1 | 4.7 ± 0.6 | 2.6 ± 0.2 | 1.8 ± 0.5 | 11.0 ± 0.0 | 4 |
| rHPIV3-N型B | 8 | 2.6 ± 0.6 | 2.0 ± 0.4 | 14.5±2.7巴 | 6.0 ± 1.2 | 7.5 ± 0.4 | 2.1 ± 0.4 | 1.2 ± 0.2 | 10.0 ± 0.0 | 2 |
| rHPIV3-L型BT1711I型 | 8 | 2.2 ± 0.2 | 1.4±0.2 | 8.7±0.3摄氏度，华氏度 | 4.4 ± 0.6 | 9.8±0.3 | 0.9 ± 0.1 | 1.6 ± 0.1 | 10.8 ± 0.5 | 4 |
| rHPIV3-P型B | 6 | 1.2 ± 0.2 | 1.5 ± 0.3 | 6.2±0.3 D | 5.3 ± 1.0 | 7.2 ± 0.6 | 2.4 ± 0.5 | 2.2 ± 0.6 | 10.4 ± 0.5 | 4 |
| BPIV3堪萨斯州 | 12 | 2.5 ± 0.2 | 2.1 ± 0.2 | 14.2±1.1 B | 6.4±0.8 | 5.1 ± 0.5 | 2.9 ± 0.2 | 2.0 ± 0.5 | 11.0 ± 0.0 | 2 |
| RSV或无 | 4 | 不适用 | 不适用 | 不适用 | 不适用 | <2.0 ± 0.0 | 5.0 ± 0.3 | 5.0 ± 0.3 | 11.5 ± 0.5 | 2 |
当替代HPIV3中的类似ORF时，每个BPIV3 ORF都限制了恒河猴上呼吸道或下呼吸道的复制（图。)表明BPIV3的寄主范围衰减表型是多基因的。通过比较上呼吸道病毒复制的平均峰值滴度（表)嵌合rHPIV3分为三类：（i）携带BPIV3 M或L ORF或F和HN基因的病毒，其复制被限制约16至32倍，（ii）携带BPVI3 N或LT1711I型ORF表现出40到100倍的复制限制，以及（iii）具有BPIV3 P ORF替代的嵌合HPIV3，其在复制方面表现出1000倍的限制，表明BPIV3 P-ORF是衰减表型的主要贡献者。rHPIV3-P的复制水平B甚至低于BPIV3亲本病毒在上呼吸道的复制，这表明其在体内的某些限制复制也可能是由于体外不明显的基因不相容效应。下呼吸道的模式有所不同，那里的衰减水平通常较低。携带BPIV3 L基因或F和HN基因对的病毒被衰减六倍或更少，而携带N、M或L的病毒T1711I型与野生型rHPIV3相比，携带BPIV3 P基因的病毒的基因衰减了26到32倍（表). 因为rHPIV3-LB T1711I型在体外复制时被减弱，并且高度ts秒，在体内观察到的这种病毒的衰减水平可能是由于宿主范围序列规定的限制复制和其高水平的温度敏感性（恒河猴的体温约为39°C）规定的限制复制的结合。有趣的是，rHPIV3-MB，rHPIV3-FB海南B，和rHPIV3-LB在上呼吸道复制减弱，在下呼吸道没有明显限制。
含有BPIV3 ORF替代物的嵌合rHPIV3具有免疫原性，可保护恒河猴免受野生型HPIV3的攻击。
对PIV3反复感染的保护与针对主要抗原决定簇F和HN糖蛋白的高水平抗体有关(9,29). 虽然BPIV3和HPIV3 F及HN蛋白的氨基酸序列相同，但其同源性为75至79%(2)，它们只有25%的抗原相关(6). 为了评估rHPIV3s的免疫原性，在感染前和感染嵌合rHPIV3或其亲本病毒后第28天或31天采集血清样本，并测定血清中抗HPIV3的HAI抗体水平。每个携带HPIV3 F和HN糖蛋白的嵌合重组体诱导了高水平的抗HPIV3的HAI抗体，而rHPIV3-FB海南B以及携带BPIV3糖蛋白的BPIV3亲本病毒诱导与人类病毒反应的HAI抗体减少8至16倍。rHPIV3-L型B T1711I型，rHPIV3-NB和rHPIV3-PB与BPIV3相比，在恒河猴呼吸道中的复制效率降低了约2到10倍，但它们诱导的HPIV3 HAI抗体增加了约4到32倍，可能是因为它们含有同源的HPIV3-糖蛋白。
为了评估嵌合rHPIV3s的保护作用，猴子被注射106TCID公司50野生型HPIV3（表). 在攻击后10天内，每隔2天收集NP和TL样本，并在LLC-MK2细胞上对样本中的病毒进行定量。所测试的每一种嵌合重组体都对HPIV3复制提供了高水平的保护，包括高度减毒的rHPIV3-PB和rHPIV3-LB T1711I型。对挑战后收集的血清样本的分析表明，每个组都产生了类似的、高滴度的针对HPIV3的HAI抗体，表明所有猴子都确实受到了感染。
讨论
BPIV3在恒河猴和人类中的复制受到高度限制，提供了一种用于开发HPIV3活疫苗的衰减表型。本研究通过将每个HPIV3 ORF与其对应的BPIV3对应物交换，并检查这种交换对体外和恒河猴中产生的每个嵌合病毒复制的影响，以确定这种衰减的遗传基础。研究结果表明，每种ORF替代物都会使恒河猴的rHPIV3减弱，并且不同ORF具有特定的衰减梯度。一般来说，含有编码蛋白在牛和人PIV3之间高度保守的基因的嵌合体在体内复制到更高水平，而含有编码蛋白质在牛和人类PIV3间保守程度较低的基因的嵌合复制到更低滴度。
含有BPIV3 P替代物rHPIV3-P的嵌合rHPIV3B在恒河猴中高度衰减，实际上，在上呼吸道中比BPIV3母体病毒本身的衰减程度略高。自rHPIV3-PB体外复制的效率与BPIV3亲本相同ts秒有理由认为，其体内复制的限制主要反映了宿主范围的差异，而不是牛和人PIV3蛋白的不相容性。因此，很明显，由该基因复合体编码的一个或多个蛋白质，即P蛋白本身和由替代ORF编码的C、D或V辅助蛋白，是导致恒河猴BPIV3整体衰减的主要因素。BPIV3和HPIV3的P蛋白具有大约59%的氨基酸同源性，并且在所有PIV3多肽中具有最高的氨基酸差异数（247个氨基酸）。C、D和V辅助蛋白分别具有约72%、30%和56%的氨基酸特性，分别对应于56、92和35个氨基酸差异(2).
副流感病毒的辅助蛋白的一个功能是抵消宿主干扰素系统的抗病毒作用(14,16,17). 由于功能缺失，负链病毒中此类抗干扰素基因的丢失通常与体内复制的减弱有关(14,15,18). BPIV3和HPIV3的辅助蛋白尚未被直接证明具有抗干扰素活性，但这些基因的缺失正在减弱(13)因此，一个或多个PIV3辅助蛋白可能起到干扰素系统拮抗剂的作用。此外，P/C/D/V复合体中的一个或多个BPIV3基因可能进化为以宿主特异的方式抑制牛干扰素反应，从而使这种抗干扰素蛋白在灵长类动物中可能无法有效发挥作用。因此，BPIV3 P基因复合物的部分宿主范围衰减表型可能是一种或多种编码的宿主防御拮抗剂的宿主特异性的结果。
rHPIV3-NB，rHPIV3-MB，rHPIV3-FB海南B和rHPIV3-LB嵌合病毒在上呼吸道或下呼吸道均被减弱，这表明N和L基因、F和HN基因对以及M基因在较小程度上都具有宿主范围的衰减决定因素。rHPIV3-N的观察结果B，rHPIV3-MB，rHPIV3-FB海南B和rHPIV3-LB嵌合病毒在体外复制中没有明显限制，这表明每个取代的野生型BPIV3蛋白在HPIV3蛋白和顺式-作用信号，并且在体内观察到的每个替代物的衰减可能不是由于BPIV3和HPIV3组分之间的不相容性，而是真实的宿主范围限制。这一发现也表明，其中一些病毒仅限于在上呼吸道而非下呼吸道复制。我们确实注意到，有证据表明导入的BPIV3 L ORF和HPIV3遗传背景之间可能存在不相容的小影响，因为rHPIV3-LB嵌合体被发现是ts秒在体外高温下。这可能反映了在升高的非生理温度下，BPIV3 L蛋白和HPIV3组分之间的相互作用效率降低。这是否有助于这种嵌合病毒在体内的衰减尚不清楚。rHPIV3-L的发现B在较温暖的下呼吸道中复制到与野生型HPIV3相同的水平，但在较凉爽的上呼吸道中复制受到限制，这表明温度敏感性或病毒蛋白不相容性在灵长类动物的复制限制中并不起主要作用。BPIV3 M、L、F和HN ORF在下呼吸道缺乏显著的衰减，表明这些基因指定的宿主范围限制可能是组织特异性的。显然，BPIV3复制的宿主范围限制是多基因的，N、P、M和L基因以及F和HN对基因都具有宿主范围衰减决定因素。由于BPIV3复制的宿主范围限制由至少五个基因指定，因此该病毒的衰减表型在人类复制后应具有高度稳定的表型，初步观察表明情况确实如此(23).
虽然BPIV3的遗传稳定性是抗HPIV3活疫苗的理想特性，但BPIV3和HPIV3之间的抗原差异会降低其对HPIV3的保护效力。在本研究中，rHPIV3-F诱导的低水平HPIV3-反应性HAI抗体说明了这一点B海南B与野生型rHPIV3相比。因此，BPIV3和rHPIV3-F都不是B海南B将是最佳的HPIV3疫苗候选，因为它们携带BPIV3而不是HPIV3的主要保护性抗原。相反，这里描述的其他嵌合病毒均携带HPIV3 F和HN抗原决定簇以及BPIV3的宿主范围限制性决定簇。尽管其中一些嵌合HPIV3（rHPIV3-NB，rHPIV3-PB和rHPIV3-LBT1711I型)在体内中度至高度减毒，它们诱导的血清HAI抗体水平高于BPIV3，因此可能被证明是HPIV3的候选疫苗。嵌合病毒rBPIV3-FH（H）海南H（H）其中BPIV3被用作主干，其F和HN基因被HPIV3的基因取代，也已生成，并正在作为候选疫苗进行评估(21,34). 这种候选疫苗也应该是表型稳定的，因为它拥有四个BPIV3基因，这些基因分别指定在灵长类动物中限制复制。
rHPIV3-L的高衰减B T1711I型在恒河猴中反映了由其L基因的宿主范围序列和T1711I和A425V点突变中的一个或两个所指定的复制限制的相加性。T1711I突变表明ts秒体外表型，因此也可能是体内衰减表型的原因，尽管目前不能排除A425V突变的作用。尽管这两种突变对体内衰减的个别贡献尚待确定，但rHPIV3-L的衰减增加BT1711I型与rHPIV3-LB说明了这一点ts秒宿主范围衰减的决定因素可以结合起来微调候选疫苗病毒的衰减水平。
其他几种动物或禽类病毒，如牛和恒河猴轮状病毒、禽流感A型病毒、牛呼吸道合胞病毒和痘苗病毒（其自然宿主未知），在人类或非人类灵长类动物中具有复制的宿主范围限制，被认为是“杰纳病毒”候选疫苗能够保护人类免受各自人类病原体的侵害(30). 然而，并非所有与人类病毒病原体对应的动物都表现出宿主范围衰减表型。例如，仙台病毒是一种小鼠PIV1，其氨基酸和核苷酸序列与人PIV1（HPIV1）和牛和人PIV3相似(33). 然而，仙台病毒在灵长类动物中复制到与野生型HPIV1相同的水平(37)表明它缺乏BPIV3所示灵长类动物衰减的宿主范围决定因素。因此，类似病毒多肽之间的大量氨基酸差异并不能自动赋予宿主范围衰减表型。
在人类确实发生宿主范围衰减的例子中，其遗传基础通常不太清楚，以前只在单个病例中进行了系统评估。一种甲型禽流感病毒被评估为人类减毒活疫苗候选，因为它在非人类灵长类动物中高度减毒(32). 流感病毒携带H3N2野生型人类病毒的血凝素和神经氨酸酶基因以及禽流感病毒的6个剩余RNA片段的重组病毒在人类中被发现高度减毒但具有免疫原性(31). 单基因重配分析表明，禽流感A病毒NS、M、PB2和PB1基因片段均能减弱人类野生型H3N2流感A病毒(5). 有趣的是，由A型流感病毒NS基因片段编码的NS1蛋白被证明是干扰素拮抗剂，缺乏它的病毒在体内会被减弱(38)，增加了BPIV3和禽流感A病毒因干扰素拮抗剂功能丧失而部分减弱的可能性。
附着或融合蛋白也可以在灵长类动物呼吸道病毒宿主范围的衰减中发挥重要作用。例如，受体特异性已被证明是禽流感病毒与人流感病毒宿主范围限制的决定因素(7,40). 牛呼吸道合胞病毒是一种在我们最近的动物亲戚黑猩猩中复制受到高度限制的病毒，其宿主范围衰减表型部分由其附着G和/或融合F蛋白介导(三). 因此，不足为奇地发现BPIV3附着或融合蛋白，即HN或F蛋白，可能有助于人类该病毒的宿主范围衰减表型(34).
因此，两种Jennerian候选疫苗（本研究中的BPIV3）和一种先前研究的禽流感a病毒衰减的遗传决定因素(5)已定义为非人类灵长类或人类。在这两种情况下，多个基因都有助于限制宿主的复制范围。这表明可能存在多种机制来实现这种复制限制。这一信息为疫苗使用的此类病毒的安全性和表型稳定性提供了部分解释，并为未来的研究奠定了基础，这些研究可以具体解决每个BPIV3蛋白限制灵长类宿主复制的机制。
致谢
我们感谢Paul Duprex提出的有用的PCR建议，感谢Tammy Tobery、Ernest Williams和Fatimeh Davoodi提供的技术援助。
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